来源：Integrating untargeted and targeted metabolomics reveals how Bacillus amyloliquefaciens-Saccharomyces cerevisiae co-fermentation reshapes phenylpropanoid metabolism and enhances the prebiotic function of black rice（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑米富含花青素与膳食纤维，但致密的麸皮层结构限制了营养物质的释放。本研究采用解淀粉芽孢杆菌与酿酒酵母协同发酵策略破解这一屏障，结合非靶向与靶向代谢组学揭示苯丙烷代谢途径的重塑规律。发酵后花青素含量达24.83 mg/g，DPPH自由基清除IC50降至0.0688 mg/mL；体外粪菌发酵中丁酸产量升至349.07 μg/mL，并富集拟杆菌属、抑制致病菌。荧光猝灭与分子对接进一步证实花青素以静态猝灭和氢键作用抑制酪氨酸酶。
研究背景
黑米（Oryza sativa L. indica）因富含功能成分而备受关注。其麸皮层中的花青素——尤其是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）——具有抗氧化与抗炎活性。黑米同时是B族维生素、维生素E、微量元素和膳食纤维的优质来源。
但黑米的健康效益受制于两个层面。物理结构上，麸皮层中致密的不溶性膳食纤维（IDF）形成强屏障，阻碍花青素等功能成分释放。化学层面上，花青素在胃肠道pH条件下稳定性差，小肠吸收有限（大部分以完整形式抵达结肠），并被肠道菌群广泛代谢为生物活性改变的酚酸等产物。花青素的糖基化模式还显著影响其跨肠上皮细胞转运。如何同时破解结构屏障与提升生物利用度，成为黑米功能化加工的关键问题。微生物发酵因其酶系丰富、条件温和，被视为有潜力的解决路径，而双菌协同能否兼顾破壁与代谢转化，尚待系统验证。
研究方法
2.1 材料
黑米购自黑龙江省哈尔滨市庆阳农场有限公司。酿酒酵母（ATCC 9763）与解淀粉芽孢杆菌（CICC 20123）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（中国北京）。酪氨酸酶（500 U/mg，源自蘑菇）、左旋多巴、2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。乙腈与甲醇为色谱纯，购自上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。
【数据】菌株：酿酒酵母ATCC 9763、解淀粉芽孢杆菌CICC 20123；酶活：酪氨酸酶500 U/mg；试剂纯度：乙腈/甲醇色谱纯，其余分析纯；产地：黑米黑龙江哈尔滨
2.2 发酵黑米的制备
黑米经研磨后过60目筛。黑米粉收集于烧杯中，密封，80 °C灭菌15 min，随后于−24 °C快速冷却5 min。以下条件已依据花青素含量进行优化（条件优化过程见Fig. S1A-J）。
（1）黑米粉:酿酒酵母:蒸馏水 = 1:10⁸:2 g:cfu:mL，温度30 °C，时间48 h。
（2）黑米粉:解淀粉芽孢杆菌:蒸馏水 = 1:10⁸:1 g:cfu:mL，温度28 °C，时间24 h。
（3）酿酒酵母:解淀粉芽孢杆菌 = 3:7，黑米粉:混合菌数:蒸馏水 = 1:10⁸:1 g:cfu:mL，温度28 °C，时间12 h。
天然黑米粉命名为NBR。在酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌及混合菌各自最优发酵条件下获得的冻干黑米粉分别命名为FSBR、FBBR和FBSBR。同时，为分析发酵过程随时间的变化，将混合菌培养的发酵时间延长至24 h，其余发酵条件均与FBSBR一致。为进一步区分FBSBR的代谢轮廓，混合菌发酵12 h（花青素含量较高）与24 h的样品分别命名为FBSBR1和FBSBR2。
【数据】筛目：60目；灭菌：80 °C、15 min；冷却：−24 °C、5 min；单菌发酵1：1:10⁸:2 g:cfu:mL、30 °C、48 h；单菌发酵2：1:10⁸:1 g:cfu:mL、28 °C、24 h；共发酵：菌比3:7、1:10⁸:1 g:cfu:mL、28 °C、12 h；延长时间：24 h
2.3 多酚的提取与含量测定
#### 2.3.1 花青素的提取与含量测定
花青素提取参照Ekici等方法并略作修改（Ekici et al., 2013）。黑米粉与提取液（80%乙醇与1% HCl，v/v）比例为1:25 g/mL。溶液置于超声波清洗机中，30 °C、420 W超声30 min。提取液于4 °C离心（8000 rpm，5 min）。同一样品连续提取三次，收集并混合上清液。花青素含量按Ekici等的pH示差法测定（Ekici et al., 2013）。简言之，花青素上清液与0.025 moL/L KCl-HCl缓冲液（pH = 1.0）按1:9比例混合，于520 nm和700 nm测定紫外吸光度（UV-2550，Shimadzu，日本），分别记为A1₅₂₀和A1₇₀₀。花青素上清液另与0.4 moL/L NaAc-HAc缓冲液（pH 4.5）按1:9比例混合，于520 nm和700 nm测定紫外吸光度，分别记为A2₅₂₀和A2₇₀₀。空白对照组为相应缓冲液。
（1）花青素含量 mg/mL = (A1₅₂₀ − A1₇₀₀ − A2₅₂₀ − A2₇₀₀) × DF × MW × 10³ / (ε × I)
式中DF为样品稀释倍数，MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量（449.2 g/moL），ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷消光系数（26,900 L moL⁻¹ cm⁻¹），I为比色皿光程（本实验为1 cm）。
【数据】料液比：1:25 g/mL；提取液：80%乙醇+1% HCl（v/v）；超声：30 °C、420 W、30 min；离心：4 °C、8000 rpm、5 min；提取次数：3次；检测波长：520/700 nm；缓冲液：0.025 moL/L KCl-HCl（pH 1.0）、0.4 moL/L NaAc-HAc（pH 4.5）；MW：449.2 g/moL；ε：26,900 L moL⁻¹ cm⁻¹；光程：1 cm
#### 2.3.2 总多酚的提取与定量
黑米粉与60%乙醇（v/v）按1:30 g:mL比例配制混合提取液。于360 W、30 °C超声环境中提取30 min。提取液经8000 rpm/min离心5 min后，收集总酚上清液。同样品按相同方式再提取三次。总酚含量测定参照Ryu等方法（2018）。取100 μL上清液，加入100 μL福林酚（2 moL/L）、8 mL 10% Na₂CO₃，用蒸馏水定容至10 mL，50 °C避光孵育30 min，于765 nm测定紫外吸光度。以没食子酸（0–2 mg/mL）按上述条件制备的标准曲线为y = 2.605x + 0.004，R² = 0.998。
【数据】料液比：1:30 g:mL；提取液：60%乙醇（v/v）；超声：360 W、30 °C、30 min；离心：8000 rpm/min、5 min；提取次数：4次；显色：100 μL福林酚（2 moL/L）+8 mL 10% Na₂CO₃，定容10 mL；孵育：50 °C、避光、30 min；检测波长：765 nm；标准曲线：y = 2.605x + 0.004，R² = 0.998；没食子酸范围：0–2 mg/mL
2.4 抗氧化活性测定
#### 2.4.1 DPPH自由基清除测定
DPPH自由基清除实验参照Wang等的方法（Wang et al., 2022）。适量DPPH粉末溶于80%乙醇（v/v），稀释至517 nm波长处吸光度为0.5–1备用。2.3.1中的花青素提取液用80%乙醇依次稀释2、4、8、16、32倍。50 μL花青素提取液与50 μL 80%乙醇混合后加入250 μL DPPH溶液；50 μL花青素提取液加入250 μL 80%乙醇；一并加入96孔板，避光平衡15 min后于517 nm测定吸光度，分别记为A1、A2、A3。以Vc为对照。计算公式如（2）：
（2）DPPH清除率 % = (A1 − A3)/A2 × 100
【数据】DPPH溶剂：80%乙醇（v/v）；检测波长：517 nm；吸光度范围：0.5–1；稀释倍数：2、4、8、16、32倍；加样体积：50 μL样品+50 μL乙醇+250 μL DPPH；平衡：避光15 min；对照：Vc
#### 2.4.2 ABTS自由基清除测定
ABTS储备液（7.4 mmoL/L，0.4 mL）与K₂S₂O₈储备液（2.6 mmoL/L，1.43 mL）混合，室温避光反应12 h。溶液用80%乙醇（v/v）稀释至734 nm处吸光度为0.700 ± 0.002。ABTS清除实验操作与DPPH清除实验相同，仅检测波长为734 nm。计算公式为：
（3）ABTS清除率 % = (A1 − A3)/A2 × 100
【数据】ABTS浓度：7.4 mmoL/L、0.4 mL；K₂S₂O₈浓度：2.6 mmoL/L、1.43 mL；反应：室温、避光、12 h；稀释：80%乙醇；检测波长：734 nm；吸光度：0.700 ± 0.002
2.5 非靶向代谢组学测定
#### 2.5.1 样品前处理
精确称取200 mg黑米粉于2 mL离心管中，加入600 μL甲醇，充分混匀。随后30 °C超声处理15 min，4 °C、12000 rpm离心10 min。收集上清液用于LC-MS分析。
【数据】样品量：200 mg；提取液：600 μL甲醇；超声：30 °C、15 min；离心：4 °C、12000 rpm、10 min
#### 2.5.2 超高效液相色谱测定
LC分析在Vanquish UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行。色谱柱为ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1 × 100 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，MA，美国）。柱温维持40 °C。流速与进样量分别设为0.3 mL/min和2 μL。LC-ESI(+)-MS分析中，流动相为（B2）0.1%甲酸乙腈（v/v）和（A2）0.1%甲酸水（v/v）。分离梯度如下：0–1 min，10% B2；1–5 min，10%~98% B2；5–6.5 min，98% B2；6.5–6.6 min，98%~10% B2；6.6–8 min，10% B2。LC-ESI(−)-MS分析中，流动相为（B3）乙腈和（A3）甲酸铵（5 mM）。分离梯度如下：0–1 min，10% B3；1–5 min，10%~98% B3；5–6.5 min，98% B3；6.5–6.6 min，98%~10% B3；6.6–8 min，10% B3。
【数据】色谱柱：ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1 × 100 mm，1.8 μm）；柱温：40 °C；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；正离子流动相：0.1%甲酸乙腈/0.1%甲酸水；负离子流动相：乙腈/5 mM甲酸铵；梯度时长：8 min
#### 2.5.3 质谱条件
代谢物质谱检测在Orbitrap Exploris 120（Thermo Fisher Scientific，美国）上以ESI离子源进行。采用MS1与MS/MS同步采集（Full MS-ddMS2模式，数据依赖性MS/MS）。参数如下：鞘气压力40 arb；辅助气流10 arb；喷雾电压ESI(+)为3.50 kV、ESI(−)为−2.50 kV；毛细管温度325 °C；MS1范围m/z 1…（原文节选至此）
【数据】质谱仪：Orbitrap Exploris 120；离子源：ESI；鞘气：40 arb；辅助气：10 arb；喷雾电压：+3.50 kV/−2.50 kV；毛细管温度：325 °C；扫描模式：Full MS-ddMS2
研究结果
3.1 多酚含量与抗氧化活性分析
不同菌株的发酵过程显著影响黑米粉中花青素与总多酚的积累及其抗氧化活性（图1A-C）。混合菌发酵效果最佳，花青素与总多酚含量分别达24.83 mg/g和30.58 mg/g，高于NBR的花青素21.58 mg/g与总多酚28.84 mg/g。这提示混合菌发酵促进了多酚的释放。其内在原因可能是两种微生物之间的协同作用：芽孢杆菌分泌的β-葡萄糖苷酶、淀粉酶等多种水解酶有助于破坏植物细胞壁结构，将结合态多酚与花青素转化为游离态（Ghamry et al., 2023）；同时酿酒酵母产生的有机酸和醇类提高了这些化合物的溶解性与提取率。
单菌发酵效果则各有不同。FBBR单菌发酵使总多酚含量升至28.07 mg/g，但花青素含量降至19.47 mg/g——这一下降可能与酶解作用及花青素在酸性环境中的不稳定性有关（发酵过程中pH变化见Fig. S1K）。FSBR活性物质总体含量较低，花青素为17.99 mg/g、总多酚为26.05 mg/g，但在抗氧化能力上表现出一定优势。
【数据】FBSBR：花青素24.83 mg/g、总多酚30.58 mg/g；NBR：花青素21.58 mg/g、总多酚28.84 mg/g；FBBR：总多酚28.07 mg/g、花青素19.47 mg/g；FSBR：花青素17.99 mg/g、总多酚26.05 mg/g
DPPH自由基为疏水性自由基，主要反映酚酸等脂溶性抗氧化剂的供氢能力；ABTS自由基则更适合评价亲水性抗氧化分子。DPPH与ABTS清除实验显示出显著不同的响应（图1B和C）。DPPH实验中，FBSBR的IC₅₀最低，为0.0688 mg/mL，表明其供氢能力更强，主要归因于酚类化合物。而FSBR的ABTS清除活性更优（IC50 = 0.0409 mg/mL），可归因于酵母发酵产生的水溶性代谢物。酿酒酵母在生长与自溶过程中会产生大量谷胱甘肽、可溶性肽和小分子还原剂。这些亲水性化合物在共发酵中丰度较低或部分降解，它们提高了与ABTS自由基的碰撞概率并协同贡献总体清除效率。这解释了为何FSBR在ABTS实验中优于FBSBR，尽管其总花青素与总酚含量更低。混合发酵兼具两类优势，总酚含量高，强化了DPPH清除能力；酵母的协同代谢也贡献了显著的亲水抗氧化潜力，整体抗氧化性能更强。
【数据】DPPH IC₅₀：FBSBR 0.0688 mg/mL；ABTS IC₅₀：FSBR 0.0409 mg/mL
Zhao等（2025）指出微生物发酵可显著提高谷物中酚类与花青素化合物的释放水平，从而增强抗氧化性。Wang等（2025）报道酵母与芽孢杆菌共发酵常表现出高于单菌发酵的自由基清除能力，强调微生物协同作用是增强体系抗氧化潜力的重要机制。总体而言，微生物共发酵不仅提高了活性物质的提取效率，还在抗氧化体系调控上表现出类型特异性和协同增效，为开发功能性谷物发酵产品提供了生化依据。
【数据】原文未详述
3.2 非靶向代谢组学分析
#### 3.2.1 代谢物鉴定分析
黑米粉发酵过程中的代谢物组成已完成分类。共鉴定出3237种代谢物，归入14个主要类别（图1D）。脂质及类脂分子占比最大，为35.9%；其次为有机杂环化合物20.5%、有机酸及其衍生物13.8%。这一分布表明黑米在整个发酵过程中保留了相当数量的初级代谢物以及结构稳定的次级代谢物。在已鉴定的差异代谢物中，1337种可归入13个主要类别。脂质及类脂分子比例略降至32.8%，有机杂环化合物与有机酸衍生物比例分别升至20.8%和15.8%。此外，苯环化合物与含氧有机化合物比例分别升至13.5%和8.3%。这些结果提示发酵促进了初级代谢向次级代谢的转化，推动抗氧化及香气相关化合物的生成。该过程归因于微生物发酵中多种酶系统的协同作用，如脱氢酶、酯酶和氨基转移酶，这些酶催化脂质与有机酸转化为芳香化合物和含氮衍生物。微生物代谢还产生有机酸和醇类（Liu et al., 2025），降低体系pH并促进酚酸与苯丙烷途径的激活，形成更多具有生物活性的差异代谢物（Sharma et al., 2019）。总之，发酵不仅改变了黑米代谢物组成，还通过激活次级代谢途径富集了功能成分，为提升其抗氧化性与营养价值提供了生化基础。
【数据】代谢物总数：3237种；类别数：14类；脂质及类脂：35.9%；有机杂环化合物：20.5%；有机酸及衍生物：13.8%；差异代谢物：1337种、13类；发酵后脂质：32.8%；有机杂环：20.8%；有机酸衍生物：15.8%；苯环化合物：13.5%；含氧有机化合物：8.3%
#### 3.2.2 多变量统计PCA与OPLS-DA分析
对黑米发酵样品与质控（QC）样品进行PCA，可初步了解样品间总体代谢差异与变异程度。PCA分析（图2A）显示，不同处理组间代谢物分布具有明显分离趋势。QC样品中所有检测代谢物的CV均小于30%（Fig. S2A），表明非靶向方法稳定可靠。以NBR为对照，FSBR、FBSBR与FBBR各组紧密聚类，而组间距离相对较大，说明各组代谢轮廓差异显著、组内重复性良好（聚类紧凑），代谢检测数据稳定可靠（Li et al., 2026）。其中FSBR与FBSBR同未发酵样品的分离最为显著，提示酿酒酵母可能是发酵黑米代谢组分变化的主要活性菌株（Gao et al., 2022）。OPLS-DA得分图（图2B）可展示样品在模型中的分布，反映组间差异与组内一致性。横坐标代表第一主成分，承载最大分类信息；纵坐标代表正交成分，主要用于去除噪声。与PCA相比，OPLS-DA能更清晰地区分不同发酵处理区域。
【数据】QC样品CV：<30%；分离趋势：FSBR/FBSBR与NBR分离最显著
#### 3.2.3 差异代谢物分析
基于OPLS-DA模型的VIP值及独立样本t检验筛选标准（|log2FC| ≥ 1，VIP ≥ 1，P ≤ 0.05），……（原文节选至此）
【数据】筛选标准：|log2FC| ≥ 1、VIP ≥ 1、P ≤ 0.05
讨论与解读
本研究系统阐明了解淀粉芽孢杆菌与酿酒酵母协同提升黑米生物活性成分生物利用度与功能性的机制：破解致密纤维屏障，重塑花青素代谢网络。FBSBR发酵模型在活性物质释放与结构转化上表现最优，花青素与总多酚分别达24.83 mg/g和30.58 mg/g，显著高于未发酵黑米。这一提升源于两菌的互补作用——芽孢杆菌分泌纤维素酶与β-葡萄糖苷酶破坏麸皮纤维结构、促进结合态多酚释放；酵母产生的有机酸与乙醇改善活性成分的溶解环境并推动结构修饰。非靶向代谢组学显示，混合发酵显著激活苯丙烷途径，黄酮类与酚酸类增加；上游苯丙氨酸与肉桂酸减少，下游多种衍生物积累。这种代谢流重定向由芽孢杆菌提供的碳骨架与还原力、以及酵母营造的弱酸性微环境共同驱动。
编译者解读：该研究的亮点在于用"破壁+代谢重定向"的双菌分工逻辑替代单一菌种发酵，并以非靶向代谢组学定位苯丙烷通路节点，思路清晰。但需注意，花青素提升幅度有限（21.58→24.83 mg/g），共发酵的真正增量更多体现在下游酚酸衍生物与益生功能上；且体外粪菌发酵与分子对接结果距体内验证尚有距离。对合成生物学而言，本研究提示可将芽孢杆菌水解酶系与酵母酸性代谢模块视为可拆分的功能元件，为构建靶向释放谷物活性成分的工程菌群提供参考。
参考来源
期刊：Food Chemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.152022
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.152022