来源：质谱蛋白鉴定肽段丢失烷基化优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完LC-MS/MS，搜库只出三五条肽段，覆盖率卡在10%以下——这种“样品进得去、结果出不来”的局面，大概率不是质谱仪坏了。问题基本都藏在裂解、还原烷基化、酶解这几步里。下面按实验流程拆成六个环节，每块给现象、给参数、给验证动作，从尿素配错到搜库参数漏设全覆盖。照着走一遍，能定位到具体是哪一步把肽段弄丢了。
第一步：先花十分钟排除几个基础错误
新手做的样品，一半以上的“肽段丢失”其实栽在下面这几条。
1. 尿素浓度不够，或者配错。有人图省事配4 M，蛋白没完全变性，二硫键包在结构里，DTT根本打不进去。直接配8 M尿素/100 mM Tris-HCl pH 8.5，现配现用。
2. IAA没避光，或者干脆漏加。碘乙酰胺见光分解，室内光照下30分钟活性掉一大截；漏加则Cys全游离，后续重新氧化成二硫键，肽段交联成大团块，根本进不了质谱。IAA加到50 mM，避光室温30分钟，别拖。
3. 胰酶直接加进8 M尿素里。尿素超过2 M，胰酶基本失活，酶解过夜也只切出几个大片段。酶解前必须稀释到尿素<1.5 M，或者用10 kDa超滤管换液。
4. 搜库时Cys固定修饰设成“无”。这最冤。数据里明明有+57.02146的质量偏移，参数没设，软件把烷基化肽段判成噪音丢掉。搜库前确认Carbamidomethyl (C)是Fixed。
上面四条都排完还是不行，说明问题在流程细节里，往下走。
第二步：按流程分模块系统排查
1. 裂解与变性（8 M尿素体系）
现象：肽段总数还算正常，蛋白覆盖率却很低；搜库时蹦出一堆+43 Da的修饰。
原理：尿素在水里会缓慢分解成氰酸铵，氰酸根攻击蛋白N端和Lys的氨基，产生氨甲酰化（+43.006 Da）。加热或久放会加速这个过程。修饰过的Lys不能被胰酶识别，漏切位点暴增，肽段自然就“少”了。
怎么判断→取1 μL裂解液测pH，正常应在8.5±0.3。搜库时把Carbamyl (K/N-term)设为Variable，命中占比>5%基本可以确认。
怎么解决→尿素现配现用，配好放4°C不超过3天。裂解全程冰上或室温，别超过37°C。超声用间歇模式，10 s on/10 s off，总共3分钟，别让样品发热。
怎么验证→同一样品用新旧尿素平行做一次，比较氨甲酰化肽段的比例。
2. 还原
现象：含二硫键的非还原肽段大量出现，或者含Cys的肽段直接消失。
原理：DTT在水溶液里、尤其碱性pH下会被氧化失效，8 M尿素中半衰期只有几小时。加的量不够或者放置太久，二硫键只打开一半，剩下的交联肽段分子量太大，色谱柱上不去。
解决：DTT终浓度10 mM（从1 M母液加），56°C孵育30分钟，pH控制在8.0-8.5。样品放置超过2小时，补加DTT到5 mM。
验证：取5 μg做非还原SDS-PAGE，还原组和未还原组条带位置差别明显，才算真打开。
3. 烷基化
现象：搜库出现大量Cys未修饰肽段，同时伴随二硫键交联肽段。
原理：IAA与游离巯基反应生成羧甲基（+57.02 Da），反应本身很快，但要求IAA摩尔数≥游离