酿酒酵母聚半乳糖醛酸酶移码突变失活及修复

来源：A Frameshift Mutation Causes Loss of Polygalacturonase Activity in Saccharomyces cerevisiae BCRC21447 and Its Restoration Enables Efficient Juice Clarification（Biocatalysis and Agricultural Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

酿酒酵母中聚半乳糖醛酸酶活性常与PGU1基因相关，但多数菌株携带该基因却不表现活性。本研究在S. cerevisiae BCRC21447的PGU1基因第1024位发现一个胸腺嘧啶插入，造成移码突变、酶活丧失。作者用质粒过表达修正后的PGU1，成功恢复酶活，并确定最优产酶条件为pH 4.5、25 °C、48 h；1%（w/v）冻干粗酶粉处理24 h后，苹果汁透光率由68.67%升至90.75%。

研究背景

果胶是高等植物中层和初生细胞壁中的结构性杂多糖，主链主要由α-1,4连接的D-半乳糖醛酸构成。在果汁提取、过滤与澄清过程中，果胶的黏度和凝胶特性会抬高浊度与黏度，给食品工业带来麻烦。果胶酶能降解果胶物质，降低果汁黏度和浊度，因而广泛用于果汁澄清、提取以及葡萄酒等发酵饮料生产。

目前食品工业用的商品果胶酶多由黑曲霉生产，其分泌的果胶酶系成分复杂，包含聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和果胶甲酯酶等。问题在于果胶甲酯酶会催化果胶脱甲酯基，释放甲醇——食品加工中不受欢迎的副产物，具有潜在毒性。此外，丝状真菌来源的果胶甲酯酶常与其他果胶酶共存，表现出……（原文此处节选截断）。酿酒酵母作为食品安全级宿主，其内源聚半乳糖醛酸酶主要由PGU1基因编码，但许多菌株虽有该基因却检测不到酶活，这一矛盾成为本研究的切入点。

研究方法

2.1 菌株与培养条件

本研究所用菌株汇总于表1。大肠杆菌TOP10用于质粒扩增，于37 °C在Luria–Bertani（LB）培养基中培养。转化后的大肠杆菌培养基补充100 mg/L氨苄青霉素。S. cerevisiae BCRC21447于30 °C在YPD培养基中培养。转化后的酿酒酵母于补充200 mg/L G418的YPD培养基中培养。

【数据】菌株：E. coli TOP10、S. cerevisiae BCRC21447；抗生素：氨苄青霉素100 mg/L、G418 200 mg/L；温度：大肠杆菌37 °C、酵母30 °C；培养基：LB、YPD

2.2 质粒构建

本研究所用质粒与引物分别汇总于表1和表S1。构建质粒pPGU1以在酿酒酵母中过表达PGU1。质粒pBCo1作为模板，用于PCR扩增含KanMX和AmpR抗性基因的DNA片段。PCR扩增使用热循环仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行。每个50 μL反应体系含1 μL正向引物（10 μM）、1 μL反向引物（10 μM）、1 μL模板DNA（500 ng/μL）、22 μL双蒸水和25 μL PrimeSTAR Max Premix（Takara Bio Inc.，日本滋贺）。PCR程序为：94 °C初始变性30 s；随后35个循环，每个循环94 °C变性30 s、按引物熔解温度（Tm）优化的退火温度退火30 s、72 °C延伸1 min 20 s；最后72 °C终延伸7 min，之后保持于10 °C。含PGU1基因并融合His标签的片段由Integrated DNA Technologies（美国爱荷华州科拉尔维尔）合成。KanMX、AmpR和PGU1三个片段用Gibson Assembly组装，生成pPGU1质粒。组装后的质粒经热激转化进大肠杆菌TOP10扩增，质粒DNA用Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit（Zymo Research，美国加州尔湾）纯化。

【数据】反应体积：50 μL；引物浓度：10 μM；模板DNA：500 ng/μL（1 μL）；退火：按Tm优化、30 s；延伸：72 °C、1 min 20 s；循环数：35；终延伸：72 °C、7 min；抗性基因：KanMX、AmpR

2.3 转化

采用醋酸锂–电穿孔法（Chen and Lin, 2022）将pPGU1质粒转化进S. cerevisiae BCRC21447。酿酒酵母先在1 mL YPD肉汤中30 °C预培养24 h，取80 μL培养物接种至20 mL YPD肉汤，30 °C培养至OD600达0.5–1.2。4 °C、3,500 rpm离心5 min收集细胞，用冰冷无菌水洗涤，重悬于含1 M LiAc、10× TAE缓冲液和1 M山梨醇的溶液中。悬液30 °C孵育45 min，随后加入100 μL 1 M二硫苏糖醇（DTT），继续孵育15 min。离心收集细胞，用1 M山梨醇洗涤两次，最终重悬于100 μL 1 M山梨醇中制备感受态细胞。转化时，取50 μL感受态细胞与500 ng pPGU1混合，转入电击杯，用BIO-RAD MicroPulser电穿孔仪（Bio-Rad Laboratories，美国加州赫拉克勒斯）以1.25 kV电击。电击后加入1 mL YPD肉汤和1 mL山梨醇，30 °C恢复培养。转化子在含200 μg/mL G418的YPD琼脂平板上筛选，30 °C培养48 h。阳性菌落经菌落PCR确认。

【数据】预培养：1 mL YPD、30 °C、24 h；接种量：80 μL入20 mL；OD600：0.5–1.2；离心：3,500 rpm、5 min、4 °C；LiAc：1 M；DTT：100 μL、1 M、15 min；电击：1.25 kV；质粒用量：500 ng；G418筛选：200 μg/mL、30 °C、48 h

2.4 蛋白表达检测

蛋白浓度用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品。蛋白样品与4×上样缓冲液及β-巯基乙醇混合，100 °C热变性10 min，在4–12% NuPAGE™ Bis-Tris Mini Protein Gels（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）上分离。蛋白条带用考马斯亮蓝染色（Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）显色。Western blot分析中，蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封闭后与抗6×His标签抗体（1:2,000；Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）孵育过夜，随后与山羊抗小鼠IgG抗体（1:15,000；Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）孵育。免疫反应信号用BCIP/NBT底物溶液（Nacalai Tesque Inc.，日本京都）检测。

【数据】热变性：100 °C、10 min；凝胶：4–12% Bis-Tris；一抗：抗6×His、1:2,000、过夜；二抗：山羊抗小鼠IgG、1:15,000；检测底物：BCIP/NBT

2.5 聚半乳糖醛酸酶活性测定

酵母细胞在1 mL YPD肉汤中30 °C培养24 h，12,000 rpm离心1 min，取上清测定聚半乳糖醛酸酶活性。定性分析采用基于前人方法（Louw et al., 2010）改良的平板法。将上清点样于含1%聚半乳糖醛酸、2%琼脂和50 mM柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）的聚半乳糖醛酸（PGA）琼脂平板上。平板30 °C孵育24 h，随后用6 N HCl覆盖。透明圈的形成视为聚半乳糖醛酸酶活性的标志。定量分析采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法（Zhou et al., 2011），以半乳糖醛酸为标准品。50 μL培养上清与450 μL含0.25%聚半乳糖醛酸的50 mM柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）混合，50 °C孵育1 h。释放的还原糖通过540 nm吸光度测定。一单位（U）聚半乳糖醛酸酶活性定义为50 °C下每分钟释放1 μmol还原糖的酶量，以U/mg蛋白表示。

【数据】培养：1 mL YPD、30 °C、24 h；离心：12,000 rpm、1 min；PGA平板：1%聚半乳糖醛酸、2%琼脂、50 mM柠檬酸缓冲液pH 4.5；孵育：30 °C、24 h；显色：6 N HCl；DNS反应：50 μL上清+450 μL 0.25% PGA、50 °C、1 h；检测波长：540 nm；酶活定义：50 °C每分钟释放1 μmol还原糖为1 U

2.6 产酶影响因素

评估培养温度、pH和培养时间对聚半乳糖醛酸酶生产的影响。菌株分别在15、20、25、30、33和37 °C培养48 h以确定最适温度；在相同培养时长下测试pH 4至9的培养基。时间进程实验中，菌株在pH 4.5、30 °C培养，于0、6、12、36、48、72和96 h取样。离心后收集培养上清，用DNS法测定聚半乳糖醛酸酶活性。

【数据】温度梯度：15、20、25、30、33、37 °C；时间：48 h；pH范围：4–9；时间进程取样点：0、6、12、36、48、72、96 h；时间进程条件：pH 4.5、30 °C

2.7 苹果汁澄清

新鲜苹果洗净、去核、切块。将100 g苹果组织与50 mL水混合打浆，经网筛过滤制得苹果汁。粗酶制剂以1%、5%和8%浓度加入30 mL苹果汁，50 °C孵育。于0、30、60 min和24 h取样，随后1,000 × g离心10 min。上清用定性滤纸过滤，用分光光度计于650 nm测定果汁浊度。澄清效率依据处理前后浊度值按以下公式计算（Yin et al., 2017）。

【数据】苹果组织：100 g；加水：50 mL；果汁体积：30 mL；酶浓度：1%、5%、8%；孵育温度：50 °C；取样时间：0、30、60 min、24 h；离心：1,000 × g、10 min；检测波长：650 nm

2.8 统计分析

数据以三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。统计差异用Student's t检验评估，p < 0.05视为具有统计学显著性。

【数据】重复数：3次独立实验；统计方法：Student's t检验；显著性阈值：p < 0.05

研究结果

3.1 PGU1基因序列分析

前人研究已表明，尽管多数酿酒酵母菌株携带编码聚半乳糖醛酸酶的PGU1基因，却往往检测不到聚半乳糖醛酸酶活性（Jia and Wheals, 2000）。对S. cerevisiae BCRC21447的PGU1基因进行序列分析，鉴定出两个单核苷酸多态性（SNP）和一个单核苷酸插入。720 bp处的C-to-T替换为同义突变，不改变所编码的苯丙氨酸残基；877 bp处的A-to-G替换导致氨基酸由丝氨酸变为甘氨酸。此外，1024 bp处插入一个额外的胸腺嘧啶，造成移码突变，改变下游开放阅读框，预测产生异常蛋白序列（图S2）。

【数据】突变位点：720 bp C→T（同义）、877 bp A→G（Ser→Gly）、1024 bp插入T（移码）；SNP数：2个；插入：1个核苷酸

3.2 质粒构建与菌株转化验证

为确定该移码突变是否导致聚半乳糖醛酸酶活性丧失，构建了去除插入胸腺嘧啶的修正PGU1序列，以恢复原始开放阅读框。pPGU1质粒用Gibson Assembly构建，在大肠杆菌TOP10中扩增，并经PCR、琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证。电穿孔导入S. cerevisiae BCRC21447后，在含G418的YPD琼脂平板上筛选转化子。菌落PCR确认存在预期的1,423-bp片段（图1）。获得6个验证过的转化子，命名为oePG1至oePG6，用于后续分析。

【数据】预期片段大小：1,423 bp；转化子数量：6个（oePG1–oePG6）；筛选抗生素：G418

3.3 蛋白表达检测

蛋白表达经SDS–PAGE和Western blot分析。PGU1基因编码由361个氨基酸组成的聚半乳糖醛酸酶，预测分子量约37.288 kDa。SDS–PAGE虽未检测到与预测分子量对应的明显蛋白条带，但Western blot在转化子中检测到约37 kDa的特异性免疫信号，野生型菌株则无。所有转化子中，oePG4的目标蛋白信号最强，表明其重组PGU1表达水平最高（图2）。因此选取oePG4进行后续表征实验。

【数据】蛋白长度：361个氨基酸；预测分子量：37.288 kDa；检测信号：约37 kDa；最强表达菌株：oePG4

3.4 聚半乳糖醛酸酶活性测定

用聚半乳糖醛酸（PGA）琼脂平板评估聚半乳糖醛酸酶活性，商品果胶酶作为阳性对照。野生型菌株在PGA琼脂平板上不产生可检测的透明圈，表明无可检测的聚半乳糖醛酸酶活性。相反，所有重组菌株（oePG1–oePG6）在PGA琼脂上均形成明显透明圈，证明成功表达了能降解聚半乳糖醛酸的功能性PGU1（图3）。重组菌株酶活的恢复表明，修正移码突变成功恢复了S. cerevisiae BCRC21447中PGU1的功能。

【数据】野生型：无透明圈；重组菌株：oePG1–oePG6均有透明圈；阳性对照：商品果胶酶

3.5 温度、pH和培养时间对产酶的影响

为优化聚半乳糖醛酸酶生产，评估了培养pH、温度和孵育时间对oePG4菌株聚半乳糖醛酸酶活性的影响。培养上清中的酶活用DNS法测定（图4）。pH 4.5时观察到最大酶活（32.82 ± 1.18 U/mg）。所试温度中，25 °C产酶最高（39.21 ± 1.06 U/mg）。酶活随时间增加，培养48 h后达最大值（33.37 ± 4.59 U/mg），96 h时仍相对稳定（31.97 ± 1.61 U/mg）。据此确定oePG4产聚半乳糖醛酸酶的最优培养条件为pH 4.5、25 °C、培养时间48 h，后续实验均采用此条件。

【数据】最适pH：4.5（32.82 ± 1.18 U/mg）；最适温度：25 °C（39.21 ± 1.06 U/mg）；最适时间：48 h（33.37 ± 4.59 U/mg）；96 h：31.97 ± 1.61 U/mg

3.6 苹果汁澄清

为评估重组PGU1的应用潜力，将oePG4培养上清制备的粗酶粉用于苹果汁澄清。测试了不同酶剂量（1%、5%和8% [w/v]），未处理苹果汁作对照。结果显示，与未处理对照相比，所有处理的果汁澄清度均随反应时间增加（图5）。5%酶处理在30 min内即显著提高澄清度（p < 0.01），8%处理在60 min和24 h后显示显著改善（p < 0.05）。肉眼观察与定量结果一致，5%处理在整个孵育期内透明度最高。24 h后，所有酶处理组的字母均清晰可见。这些结果表明，酿酒酵母生产的重组PGU1能有效改善苹果汁澄清，可能在果汁加工中有应用潜力。

【数据】酶剂量：1%、5%、8%（w/v）；5%处理：30 min内显著（p < 0.01）；8%处理：60 min与24 h显著（p < 0.05）；孵育温度：50 °C；评价指标：650 nm浊度

讨论与解读

对S. cerevisiae BCRC21447的PGU1基因序列分析鉴定出两个SNP和一个单核苷酸插入（图S1）。其中一个SNP导致Ser293Gly替换。类似多态性此前在酵母VIN13的PGU1等位基因中也有发现，但异源表达分析表明该替换不影响聚半乳糖醛酸酶活性（Louw et al., 2010）。因此Ser293Gly替换不太可能是BCRC21447中PGU1功能丧失的原因。而1024 bp处插入额外胸腺嘧啶造成移码突变，改变下游开放阅读框，预测产生异常蛋白序列。由于PGU1编码的是一种功能性内切聚半乳糖醛酸酶，编码序列长1086 bp（Vidyasagar et al., 2022），该移码突变预期会破坏完整酶的产生。与此一致，S. cerevisiae BCRC21447在PGA琼脂平板上未能产生可检测的透明圈，表明无可检测的聚半乳糖醛酸酶活性（图3）。综合序列分析与酶活缺失结果，支持移码突变是BCRC21447中PGU1功能丧失的主要遗传缺陷这一结论。亲本菌株Saccharomyces cerevisiae BCRC 21447未显示可检测的聚半乳糖醛酸酶活性……（原文此处节选截断）。

编译者解读：本研究走的是"先诊断、再修复"的简洁路线——用一个质粒补回单碱基即可恢复酶活，说明该菌株的缺陷是单基因、可逆的，工程改造成本低。选择酿酒酵母而非黑曲霉作宿主，规避了果胶甲酯酶带来的甲醇问题，食品安全属性是卖点。局限也明显：质粒系统需G418抗性维持，工业规模下抗生素标记不可接受，后续应转向基因组整合或CRISPR修复；另外澄清实验仅在50 °C、粗酶粉水平完成，未与商品酶做同条件成本对比，离工业化还有距离。

参考来源

期刊：Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2026

DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104320

DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104320