来源：Transcriptome based putative integrated phenylpropanoid and flavonoid biosynthetic pathway in Andrographis paniculata（Ecological Genetics and Genomics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
穿心莲是含二萜内酯和黄酮类活性成分的重要药用植物，其二萜内酯途径研究较深入，黄酮合成分子信息却长期匮乏。本研究从已发表的穿心莲从头转录组数据集中挖掘出27个苯丙烷-黄酮网络关键基因，完成全长CDS鉴定、序列注释、蛋白结构模拟与系统发育分析，并基于转录丰度构建了 putative 整合通路。非开花突变体总黄酮含量显著高于常规品种VK-1（315 vs 218 mg QE/g干浸膏），为后续功能验证提供了序列资源与候选靶点。
研究背景
穿心莲（Andrographis paniculata (Burm. f.) Wall. ex Nees）在印度俗称"Kalmegh"，原产印度与斯里兰卡，广泛分布于南亚与东南亚，因味极苦被称为"苦味之王"。它是爵床科穿心莲属一年生直立草本，传统医学中以粉末、浸剂或煎剂单用或复方入药，用于代谢紊乱（如糖尿病）、肝功能障碍、胃肠道疾病（痢疾、消化不良、肠炎）、感染性疾病（疟疾、淋病、蠕虫病）、炎症与皮肤病（疱疹、疥疮、皮疹）、呼吸道感染及消化性溃疡，并具保肝、解热、抗菌、抗炎活性，外用可治皮肤感染与蛇伤。已鉴定的植物化学成分中，穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯是主要活性二萜内酯。与二萜内酯途径相比，该物种黄酮生物合成的分子信息仍十分有限，而黄酮类成分具有重要治疗与营养保健应用价值，这一空白制约了代谢工程改造与品质育种。本研究即针对这一缺口，对既有转录组数据集进行系统挖掘。
研究方法
2.1 总黄酮含量测定
总黄酮含量从两个对比种质即VK-1与非开花突变体（NFM）中测定。总黄酮含量采用紫外-可见分光光度计、参照Ref. [21]的方法并稍作修改进行测定。取0.1 mL样品提取液，与2.25 mL水、0.15 mL 5%亚硝酸钠和0.3 mL 10% AlCl₃混合，混合物孵育6 min。随后向混合物中加入1 mL 1 M氢氧化钠，在510 nm波长处记录吸光度。总黄酮含量以槲皮素当量（QE）表示（mg QE/g干浸膏）。分析采用四个生物学重复，结果以平均值表示。VK-1与NFM之间的总黄酮含量采用配对t检验进行统计学比较。P < 0.05的概率值视为具有统计学显著性。
【数据】样品：VK-1与NFM种质叶提取液；提取液体积：0.1 mL；水：2.25 mL；5%亚硝酸钠：0.15 mL；10% AlCl₃：0.3 mL；孵育时间：6 min；1 M NaOH：1 mL；检测波长：510 nm；生物学重复：4个；显著性阈值：P < 0.05；统计方法：配对t检验
2.2 基于转录组的苯丙烷与黄酮生物合成基因鉴定
本研究分析的转录组数据集此前由对比穿心莲种质生成，已由Kalariya等[22]报道。原始转录组实验包含自然开花VK-1与不开花突变体植株各三个生物学重复。用于转录组水平比较的叶片样品于傍晚采集，自然开花VK-1植株为移栽后78天（DAT），自然不开花突变体植株为85 DAT。总RNA采用Chaudhary等（2011）描述的内部RNA分离方法提取。RNA浓度用Qubit® 4.0荧光仪测定，RNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳评估。cDNA文库构建使用500–1000 ng RNA与KAPA mRNA HyperPrep Kit for Illumina（Cat. No. KK8581）。mRNA富集与文库制备后，文库用Agilent 4150 TapeStation评估，并用Qubit® 4.0荧光仪定量。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，产生2 × 150 bp双端读长。每个样品测序产生约8–10 GB数据。原始测序数据存于NCBI Sequence Read Archive，BioProject为PRJNA1204518，BioSample登录号为SAMN46042656–SAMN46042664。从组装好的转录组数据集中，鉴定出对应于黄酮生物合成相关基因的编码DNA序列（CDS）。选取含完整开放阅读框的基因用于计算机蛋白结构预测、结构验证以及与公共蛋白数据库的比较相似性评估。蛋白模型使用经ExPASy服务器访问的SWISS-MODEL在线平台生成[23]。模型质量参数按近期一项转录组研究所用标准评估[24]。为进一步验证基因注释，对穿心莲编码苯丙氨酸解氨酶（ApPAL）的CDS序列使用NCBI BLAST工具进行相似性搜索。检索获得十个最接近的同源序列并在核苷酸水平进行分析。
【数据】种质：VK-1（78 DAT）与NFM（85 DAT）；生物学重复：各3个；RNA用量：500–1000 ng；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；读长：2 × 150 bp；数据量：每样品约8–10 GB；RNA质量检测：1%琼脂糖凝胶；BioProject：PRJNA1204518；BioSample：SAMN46042656–SAMN46042664；建模平台：SWISS-MODEL（ExPASy）；BLAST同源序列数：10条
2.3 系统发育分析
系统发育分析使用MEGA 12.0版本进行。进化关系采用Tamura–Nei替换模型推断，bootstrap分析使用1000次重复。所有比对位点均纳入缺口与缺失数据处理，计算使用三个处理线程执行。此外，13个已鉴定黄酮生物合成通路基因对应的scaffolds使用BLASTx算法与NCBI非冗余（NR）蛋白数据库比对，序列同源性依据相似性指标解读。
【数据】软件：MEGA 12.0；替换模型：Tamura–Nei；bootstrap重复：1000次；处理线程：3；比对策略：全部位点纳入；数据库：NCBI NR；算法：BLASTx；比对基因数：13个
2.4 比较基因表达分析
开展比较基因表达分析以研究穿心莲VK-1与NFM种质中苯丙烷、黄酮与花青素生物合成通路相关基因。使用每种质三个生物学重复的转录丰度数据（VK-1：L1A、L1B、L1C；NFM：L2A、L2B、L2C）。计算倍数变化、logCPM、P值与错误发现率（FDR），FDR < 0.05为统计学显著。通路相关基因基于功能注释与同源性鉴定。热图构建使用转录丰度的log2转换（log2(x + 1)）与Z-score标准化（按基因）数据。热图在R中使用pheatmap包构建，采用欧氏距离与完全连锁法。
【数据】种质：VK-1（L1A/L1B/L1C）与NFM（L2A/L2B/L2C）；生物学重复：各3个；统计量：fold change、logCPM、P值、FDR；显著性阈值：FDR < 0.05；数据转换：log2(x + 1)、Z-score；聚类距离：欧氏距离；连锁方法：完全连锁；软件包：R pheatmap
研究结果
3.1 总黄酮含量测定
穿心莲VK-1与非开花突变体（NFM）品系间总黄酮含量差异显著。NFM品系总黄酮含量（315 mg QE/g干浸膏）高于VK-1（218 mg QE/g干浸膏）。基于配对t检验，两基因型间差异具有统计学显著性（t = 5.218，df = 3，P = 0.0137）。
【数据】NFM总黄酮：315 mg QE/g干浸膏；VK-1总黄酮：218 mg QE/g干浸膏；统计量：t = 5.218，df = 3，P = 0.0137；重复数：4个生物学重复
3.2 转录组分析
转录组组装指标的详细信息，包括组装大小、质量参数、转录本数、编码DNA序列（CDS）及其各自的质量评估，已在先前发表的研究中描述[22]。
3.2.1 穿心莲核心苯丙烷通路相关基因
#### 3.2.1.1 苯丙氨酸解氨酶（ApPAL）
转录组分析显示，穿心莲苯丙氨酸解氨酶基因（ApPAL）全长2283碱基对。ApPAL基因的完整编码序列（CDS）已存入NCBI Nucleotide数据库，GenBank登录号PZ067705，对应蛋白序列登录号YEV25501。为确认功能注释，使用NCBI保守结构域数据库（CDD）对CDS进行保守结构域分析。搜索参数设定E值阈值1 × 10⁻²、最大命中数500、启用基于组成的统计。分析鉴定出与保守结构域PLN02457（PSSM-ID: 215251）的显著匹配，E值为0.0，从而确认其归类为ApPAL家族蛋白。随后将共识CDS衍生的氨基酸序列用于SWISS-MODEL服务器的三维结构预测（图1）。
生成的结构模型呈同源四聚体构型。预测结构质量评估显示MolProbity评分1.71、clash评分1.51。QMEAN评分为−2.60，Cβ偏差值0.22，表明立体化学性质可接受。此外，Ramachandran Z评分为−1.877，表明多数氨基酸残基位于Ramachandran图中能量有利区域（图2）。
系统发育分析进一步表明，ApPAL与先前报道的穿心莲ApPAL序列（XM_051274368.1、XM_051274883.1）进化关系最近，确认其在该物种内的保守性（图3）。
在植物中，黄酮生物合成起源于苯丙氨酸——一种经莽草酸途径生成的芳香族氨基酸，并经苯丙烷代谢路线进行[18]。保守结构域分析表明，所鉴定ApPAL序列属于PLN02457家族，该家族归类于Lyase I-like超家族。该超家族成员包括苯丙氨酸解氨酶（ApPAL）与组氨酸解氨酶，催化β-消除反应，在植物中通常以活性同源四聚体酶形式发挥功能。四聚体复合物中每个催化位点由三个独立亚基贡献的氨基酸残基构成，反映出结构协调的活性机制。预测蛋白模型的结构验证使用MolProbity完成，该网络工具评估大分子结构的整体与局部立体化学质量参数。所鉴定CDS（GenBank登录号PZ067705）获得的Ramachandran图统计落在精修良好蛋白结构的可接受范围内，支持预测模型的可靠性。苯丙烷通路包含将苯丙氨酸转化为对香豆酰辅酶A的三个主要起始步骤[25]。在第一个 committed 步骤中，ApPAL催化苯丙氨酸的非氧化脱氨生成反式肉桂酸[26]，从而将代谢流从初级代谢导向次级代谢产物合成[27]。随后，肉桂酸4-羟化酶（ApC4H）——一种细胞色素P450依赖的单加氧酶——催化反式肉桂酸羟化形成对香豆酸，这是黄酮生物合成途径中的第一个氧化步骤[28]。生成的对香豆酸随后被4-香豆酸:CoA连接酶（Ap4CL）转化为对香豆酰辅酶A，完成下游黄酮合成所需中心中间体的形成。先前研究已证明草莓果实中ApPAL活性与花青素及其他酚类化合物积累呈正相关[29]，凸显该酶在苯丙烷代谢中的调控意义。此外，编码ApPAL的基因如StlA已涉及特殊代谢物（包括芪类抗生素）的生物合成[26]。基于转录组来源的基因鉴定，构建了穿心莲 putative 黄酮生物合成通路，见图4。
【数据】ApPAL CDS长度：2283 bp；GenBank核苷酸登录号：PZ067705；蛋白登录号：YEV25501；CDD E值阈值：1 × 10⁻²；最大命中数：500；保守结构域：PLN02457（PSSM-ID: 215251）；E值：0.0；MolProbity评分：1.71；clash评分：1.51；QMEAN评分：−2.60；Cβ偏差：0.22；Ramachandran Z评分：−1.877；同源序列：XM_051274368.1、XM_051274883.1
#### 3.2.1.2 反式肉桂酸4-单加氧酶（ApC4H）与4-香豆酸:CoA连接酶（Ap4CL）
编码苯丙烷通路主要酶的关键基因——苯丙氨酸解氨酶（ApPAL）、反式肉桂酸4-单加氧酶（ApC4H）和4-香豆酸:CoA连接酶（Ap4CL）——已成功从穿心莲转录组数据集中鉴定。ApC4H是一种细胞色素P450依赖的单加氧酶，催化反式肉桂酸羟化生成对香豆酸，从而同时参与苯丙氨酸代谢与下游苯丙烷生物合成。生成的对香豆酸随后被Ap4CL转化为对香豆酰辅酶A。该代谢物是黄酮生物合成以及其他分支（如木质素形成）的直接前体。ApC4H的编码序列（CDS）已存入NCBI GenBank数据库，核苷酸登录号PZ067706，对应蛋白序列登录号YEV25502。在拟南芥中，木质素含量已显示与ApC4H基因表达水平相关[25]，凸显其在苯丙烷流中的调控重要性。肉桂酸4-羟化酶基因序列的系统发育分析显示，ApC4H基因（PZ067706）与预测的穿心莲C4H基因序列（XM_051278411.1）聚为一类，形成独立簇，bootstrap值为52%（中等）（图5）。
这表明ApC4H基因在苯丙烷通路中于相关物种间具有进化保守性。拓扑结构亦表明ApC4H基因在不同植物物种中功能保守。在苯丙烷通路的第三步，Ap4CL催化辅酶A（CoA）以ATP依赖方式连接至对香豆酸，产生中心代谢中间体对香豆酰辅酶A。Ap4CL同工型表现出底物特异性与功能分化。例如在拟南芥中，At4CL1、At4CL2和At4CL4主要参与木质素生物合成，而At4CL3优先与黄酮代谢相关[30]。ApPAL、ApC4H与Ap4CL的协同表达模式屡有报道[31]，表明苯丙烷通路内存在紧密调控。此外，胁迫条件下Ap4CL活性升高与花青素及黄烷醇积累增加呈正相关[32]。负责对香豆酰辅酶A形成的Ap4CL编码序列（CDS）全长1761碱基对，已存入NCBI Nucleotide数据库，GenBank登录号PZ067707，对应蛋白序列登录号YEV25503。
【数据】ApC4H核苷酸登录号：PZ067706；ApC4H蛋白登录号：YEV25502；ApC4H同源序列：XM_051278411.1；bootstrap值：52%；Ap4CL CDS长度：1761 bp；Ap4CL核苷酸登录号：PZ067707；Ap4CL蛋白登录号：YEV25503
#### 3.2.1.3 参与羟化/甲基化修饰的基因
编码莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶（ApHCT）的编码序列（CDS）——一种重要的……
（原文此处节选中断，后续内容未提供）
讨论与解读
本研究基于转录组对穿心莲苯丙烷-黄酮生物合成通路基因进行了系统分析，共鉴定并表征了27个基因，涵盖核心苯丙烷通路、中心黄酮、黄酮、黄酮醇、花青素及异黄酮分支。全长编码序列的存在、与已知蛋白的同源性以及结构特征，构成了所述基因注释的额外依据。据此在穿心莲中重建了 putative 苯丙烷-黄酮生物合成通路。所得数据有助于该药用植物黄酮生物合成相关基因的分子表征，可用于基因表达分析、代谢物谱及所述基因功能的后续研究。
编译者解读：该研究以"干实验"为主——转录组挖掘加同源注释、结构模拟与系统发育，成本低、产出快，为穿心莲这类非模式药用植物快速搭建了黄酮通路的基因框架。亮点在于把NFM突变体作为天然"高黄酮对照"，315 vs 218 mg QE/g的差异为后续关联表达与代谢物提供了抓手。局限也明显：通路为计算机重建，未做异源表达或酶活验证，Z-score热图仅提示转录相关性而非因果。对合成生物学而言，这批GenBank登录的CDS可直接作为穿心莲黄酮异源重建的候选元件库。
参考来源
期刊：Ecological Genetics and Genomics, 2026
DOI: 10.1016/j.egg.2026.100538
DOI: 10.1016/j.egg.2026.100538