来源：蛋白结晶初筛条件沉淀剂优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
蛋白纯化到95%，初筛板却清一色透明。别急着骂蛋白。沉淀剂优化没做好，晶体可能只是没被逼出来。本文按“低级错误→流程分维度→进阶疑难”排查，覆盖PEG、盐、pH、温度、添加剂、接种等常见坑。你照着做，少走两周弯路。
第一步：快速排查低级错误
1. 蛋白浓度太低或太高。现象：液滴一直清亮，或一上样就大量无定形沉淀。解决：A280测浓度，初筛调到5-10 mg/mL；若瞬间沉淀，降到2-5 mg/mL再试。
2. 池液加错或母液稀释错。现象：整板长得一模一样，连盐晶都不出。解决：重新核对母液，PEG 3350母液用0.22 µm过滤，盐母液现配，pH计校准。
3. 液滴没封住。现象：液滴干一半，或体积忽大忽小。解决：坐滴板压紧胶带，悬滴用硅化盖玻片，池液加50-100 µL，油层用石蜡油:硅油1:1。
4. 温度波动。现象：边缘孔和中间孔结果不同。解决：4°C和20°C各做一套，培养箱别频繁开门。
第二步：分维度系统排查
1. 沉淀剂类型选错
现象：清亮液滴多，偶有油滴或胶状。原理：PEG靠体积排阻，盐靠盐析，MPD兼有。蛋白性质不同，响应差别大。解决：首轮筛PEG 3350 10-25%、PEG 2000 15-30%、硫酸铵1.0-2.5 M、MPD 20-40%。用坐滴法，1 µL蛋白+1 µL池液，池液80 µL。验证：48 h看液滴，7天复看。清亮则升沉淀剂浓度10%。
2. 沉淀剂浓度梯度太粗
现象：只在某一行出微晶，但无法长大。原理：过饱和度窗口窄。解决：围绕出晶孔做24孔梯度，PEG 3350从12%到22%，每2%一档；硫酸铵从1.2到2.0 M，每0.1 M一档。16°C平衡。验证：记录出晶