来源：ATP-free fatty aldehyde biosynthesis enables an autonomous lux-based bioluminescence system（iScience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
细菌Lux生物发光系统要实现持续发光，必须依赖LuxEC复合体以ATP和NADPH为代价合成脂肪醛底物，宿主代谢状态一波动，信号就跟着抖。这项研究用α-双加氧酶（αDOX）替换LuxEC——该酶直接把脂肪酸转成脂肪醛，不消耗ATP。研究者从三种αDOX同源物中筛出CsαDOX，再借机器学习引导的定向进化把发光强度提升约7.9倍，并实现单细胞级成像；在多种抗生素处理下，该系统的发光衰减幅度小于天然LuxCDABE系统。
研究背景
生物发光报告系统长期用于活细胞监测。萤火虫荧光素酶（FLuc）和NanoLuc（NLuc）信噪比高、无光漂白与光毒性、动态范围宽，但必须外源添加荧光素——连续采集受限、成本上升，组织内底物渗透与分布不均也是老问题。为摆脱外源底物，研究者把荧光素酶与荧光素合成基因一起整合进宿主，构建了细菌和真菌来源的自主发光系统。问题在于：这两类系统的荧光素合成都需要ATP（图1A）。营养匮乏或代谢抑制剂引起的细胞代谢波动，会直接压低发光强度，而且这种下降可以独立于发光基因表达的变化而发生。因此，寻找一条不依赖ATP的底物供给路线，成为自主发光系统走向稳定、长效监测的关键一步。
研究方法
关键资源表（试剂与资源）
菌株与病毒：大肠杆菌XL10-Gold（Agilent Technologies，Cat#200314）；大肠杆菌JM109(DE3)（Promega，Cat#P9801）。
关键商业试剂盒与试剂：KOD FX Neo DNA聚合酶（Toyobo Life Sciences，Cat#KOD-201）；FastGene凝胶/PCR提取试剂盒（NIPPON Genetics，Cat#FG-91302）；BigDye Terminator v1.1循环测序试剂盒（ThermoFisher Scientific，Cat#4337450）；T5核酸外切酶（New England Biolabs，Cat#M0663S）；DpnI（Takara，Cat#1235A）；肉豆蔻酸（Wako，Cat#544-63-8）；羧苄青霉素（MP Biomedicals，Cat#195092）；卡那霉素（Wako，Cat#25389-94-0）；美罗培南（Sumitomo Pharma，Cat#876139）；利福平（Wako，Cat#13292-46-1）。
数据沉积：质粒序列见Table S1，存放于 https://doi.org/10.5281/zenodo.23169225。
寡核苷酸：引物为ThermoFisher定制DNA寡核苷酸；合成cDNA（CsαDOX、CalαDOX、OsαDOX）为ThermoFisher GeneArt Strings DNA片段。
重组DNA：pRSETB-LuxAB（Kusuma等）；pRSETB-LuxCDABE（Kusuma等）；pRSETB-OsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-CalαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-CsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-'TesA+CsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-TesB+CsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-LuxD+CsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-LuxD-G4S-CsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-CsαDOX-G4S-LuxD+LuxAB（本研究）；pRSETB-LuxAB-G4S-CsαDOX（本研究）；pRSETB-LuxD+LuxAB-G4S-CsαDOX（本研究）；pRSETB-LuxD+eCsαDOX+LuxAB（本研究）；pRSETB-LuxD+eCsαDOX+LuxAB v.1（本研究）；pRSETB-LuxD+eCsαDOX+eLuxAB（本研究）；pRSETB-LuxD+eCsαDOX+eYNLX（本研究）；pRSETB-YNLX（Kusuma等）。
软件与算法：BLAST（Altschul等，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；UCSF chimera（Pettersen等，https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）；Origin8（OriginLab，https://www.originlab.com/）；ImageJ（FIJI）（Schneider等，https://imagej.net/Fiji/）；EvoProtGrad（Emami等，https://nrel.github.io/EvoProtGrad/）；EVOLVEpro（Jiang等，https://github.com/mat10d/EvolvePro/）。
实验模型与研究对象信息：菌株及培养条件
大肠杆菌菌株在LB肉汤中培养，添加羧苄青霉素（100 μg/mL），37°C、200 rpm（LTI-700E，EYELA）。本研究使用的大肠杆菌菌株详细信息见关键资源表。
【数据】菌株：大肠杆菌XL10-Gold、JM109(DE3)；培养基：LB肉汤；抗生素：羧苄青霉素100 μg/mL；温度：37°C；转速：200 rpm；仪器：LTI-700E（EYELA）
方法细节：通用方法
DNA寡核苷酸购自ThermoFisher Scientific。PCR扩增使用KOD-FX-Neo（Toyobo Life Science）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒（NIPPON Genetics）。用DpnI处理以降解反向PCR载体中的亲本载体。小规模质粒DNA从1.5 mL LB液体细菌培养物中经碱裂解与乙醇沉淀获得。cDNA构建体的DNA测序使用BigDye Terminator v1.1循环测序试剂盒（Life Technologies）完成。
【数据】质粒制备：1.5 mL LB培养物；方法：碱裂解+乙醇沉淀；测序试剂盒：BigDye Terminator v1.1；PCR酶：KOD-FX-Neo；载体降解：DpnI处理
方法细节：αDOX-Lux的构建
以pRSETB载体中的luxAB操纵子为起始材料，在大肠杆菌中构建不依赖ATP的Lux系统。OsαDOX、CalαDOX和CsαDOX的大肠杆菌密码子优化序列由ThermoFisher Scientific合成。所有αDOX基因的cDNA经PCR扩增，用T5核酸外切酶介导的低温DNA克隆法（TLTC）亚克隆进LuxAB操纵子，得到αDOX-LuxAB/pRSETB。硫酯酶克隆方面，'TesA与TesB从大肠杆菌K-12基因组扩增，LuxD从LuxCDABE/pRSETB载体扩增；PCR产物用TLTC组装亚克隆进CsαDOX-LuxAB/pRSETB，得到硫酯酶-CsαDOX-LuxAB/pRSETB。融合策略方面，用GGGGS连接肽将LuxD融合到CsαDOX的N端或C端，并用同一连接肽将CsαDOX融合到LuxB的C端，生成LuxB-GGGGS-CsαDOX，经TLTC法组装。诱变获得的CsαDOX与LuxA优化变体亚克隆进LuxD-CsαDOX-LuxAB操纵子。Venus通过EL连接肽与eLuxA融合，采用TLTC组装。
【数据】载体：pRSETB；克隆方法：TLTC（T5核酸外切酶介导低温DNA克隆）；连接肽：GGGGS（LuxD-CsαDOX）、EL（eLuxA-Venus）；融合体：LuxB-GGGGS-CsαDOX；基因来源：'TesA/TesB来自大肠杆菌K-12基因组，LuxD来自LuxCDABE/pRSETB
方法细节：机器学习引导的CsαDOX与LuxA定向进化
CsαDOX与LuxA的诱变由两种机器学习方法引导：EvoProtGrad与EVOLVEpro。EvoProtGrad源代码见https://nrel.github.io/EvoProtGrad/；EVOLVEpro源代码见https://github.com/mat10d/EvolvePro。两种模型均使用ESM2-3B基础层蛋白语言模型（PLM）进行进化。LuxA与CsαDOX的野生型序列最初作为EvoProtGrad框架的输入，采用两个专家模型：一个蛋白语言模型（PLM）和一个在GFP相关适应度数据集上训练的CNN模型。马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）参数设为100次迭代，每个变体最多12个突变。预测的候选变体经EVOLVEpro进入下一轮优化。所得候选通过定点诱变（SDM）引入突变，并进行发光活性实验评估。每轮筛选的变体随后作为下一轮EVOLVEpro活性优化的输入，至第4轮每周期产生最多12个新突变。多突变体构建时，人工选取每轮至少表现最好的前三个变体，组合有益突变，生成增强型LuxA与CsαDOX变体。使用重叠引物进行定点诱变（SDM），以LuxD-CsαDOX-LuxAB/pRSETB和LuxCDABE/pRSETB为模板获得突变变体。SDM热循环条件：18个循环的变性（94°C，15 s）、退火（55°C，30 s）、延伸（68°C，5 min）。PCR产物经DpnI处理，转化进大肠杆菌JM109(DE3)。
【数据】模型：ESM2-3B蛋白语言模型；MCMC迭代：100次；每变体突变上限：12个；循环数：4轮；SDM热循环：18循环，变性94°C 15 s，退火55°C 30 s，延伸68°C 5 min；宿主：大肠杆菌JM109(DE3)
方法细节：荧光素酶测定
修饰质粒转化进大肠杆菌JM109(DE3)，在T7启动子下组成型表达。培养物过夜生长，铺于96孔白色板（Greiner Bio-One，150 μL/孔），用多模式板读仪（Spectra Max iD5，Molecular Devices）曝光3 s测定发光强度。发光值（含诱变）以OD600归一化，得到最终发光强度。eCsαDOX-eLux操纵子与LuxCDABE的抗生素处理实验中，过夜培养物调整至OD600 = 0.5，用同一板读仪曝光3 s测定发光。抗生素终浓度：美罗培南（30 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、利福平（25 μg/mL）、羧苄青霉素（100 μg/mL）。IPTG添加至终浓度1 mM。肉豆蔻酸（Wako）添加至终浓度20–1000 μM。
【数据】板型：96孔白色板，150 μL/孔；曝光：3 s；归一化：OD600；抗生素终浓度：美罗培南30 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、利福平25 μg/mL、羧苄青霉素100 μg/mL；IPTG：1 mM；肉豆蔻酸：20–1000 μM；菌液OD600：0.5（抗生素实验）
方法细节：生物发光成像
取重组大肠杆菌菌落加入10 μL H2O。用琼脂垫法将0.3 μL各重组大肠杆菌引入35 mm玻璃底培养皿。发光成像用基于IXploreTM Live for Luminescence（EVIDENT）系统的倒置显微镜，配备EM-CCD相机（Andor iXon Ultra 888），曝光数分钟，EM增益1000×，×60物镜，2×2 binning设置。所有成像条件在37°C载物台培养箱STX（TOKAI HIT）中进行。所有发光图像用ImageJ软件分析。从原始图像中减去背景信号，用ImageJ自适应中值滤波去除宇宙射线伪影，不改变原始亮度或细胞形态。显微图像应用伪彩渲染，"Red Hot"查找表用于表示总发光强度。
【数据】样品体积：10 μL H2O重悬，0.3 μL点样；培养皿：35 mm玻璃底；相机：EM-CCD Andor iXon Ultra 888；EM增益：1000×；物镜：×60；binning：2×2；温度：37°C；曝光：数分钟；分析软件：ImageJ（FIJI）
方法细节：定量与统计分析
数据拟合与统计分析使用Origin8软件（OriginLab）或Microsoft Excel。统计值包括……（原文节选至此结束，后续内容未详述）。
【数据】软件：Origin8（OriginLab）、Microsoft Excel；统计方法：原文未详述
研究结果
不依赖ATP的自主生物发光系统设计
起点选细菌荧光素酶系统作为自主生物发光平台，理由是其溶解性和热稳定性优于真菌生物发光系统。天然生化通路中（图1A），荧光素合成由三酶级联介导：LuxD（硫酯酶）、LuxE（酰基-蛋白合成酶）和LuxC（酰基-CoA还原酶）。LuxE与LuxC形成脂肪酸还原酶复合体，以ATP和NADPH依赖的方式催化长链脂肪醛生成。为建立一条不以ATP为辅因子的替代性长链脂肪醛合成通路，研究者考察了α-双加氧酶（αDOX）。选取三个表征充分的αDOX同源物：源自水稻（Oryza sativa）的OsαDOX、源自Crocosphaera subtropica的CsαDOX、源自Calothrix parietina的CalαDOX。这些αDOX基因被引入luxAB表达系统，三种含αDOX的系统均在大肠杆菌JM109(DE3)中产生可检测的自主生物发光，与未转化阴性对照清晰区分（图1B）。所测酶中，CsαDOX相对其他αDOX同源物产生最高发光强度。该结果与先前报道一致：CsαDOX偏好利用中链脂肪酸底物（C10–C16），与细菌荧光素酶活性更兼容。相比之下，OsαDOX偏好更长链脂肪酸（>C16），CalαDOX表现相对较差，可能与其固有结构特性相关的蛋白聚集有关。尽管存在这些差异，所有基于αDOX的系统发光强度仍低于野生型LuxCDABE操纵子，说明要达到与ATP依赖通路相当的亮度还需进一步优化。
【数据】菌株：大肠杆菌JM109(DE3)；αDOX同源物：OsαDOX、CsαDOX、CalαDOX；CsαDOX底物偏好：中链脂肪酸C10–C16；OsαDOX底物偏好：>C16；发光强度排序：CsαDOX最高，均低于野生型LuxCDABE；数值：原文未详述具体发光值
Lux系统的自主发光强度受细胞内脂肪酸可用性影响——脂肪酸是脂肪醛生产的前体。因此，增强脂肪酸供给（过表达脂肪酸生物合成酶如硫酯酶，或外源补充肉豆蔻酸）可调节LuxCDABE与CsαDOX-Lux操纵子的性能。为验证这一点，研究者检查了过表达硫酯酶（LuxD、'TesA和TesB）能否增强大肠杆菌脂肪酸生物合成（图1C与图S2A）。引入硫酯酶导致发光强度升高，其中LuxD比'TesA和TesB产生高达3.9倍的增强（图1D与图S2A）。这些结果表明，脂肪酸可用性是表达CsαDOX与LuxAB的大肠杆菌中脂肪醛生产的限速因素。与此解释一致，补充肉豆蔻酸导致发光强度呈浓度依赖性升高，最佳浓度为200 μM。该条件下，发光强度相对未补充肉豆蔻酸的大肠杆菌培养物提高至多19倍（图S2B）。此外，将LuxD纳入CsαDOX+LuxAB系统，使发光强度提高9.4倍，同时所需肉豆蔻酸浓度（50 μM）显著低于不含LuxD的CsαDOX+LuxAB系统（图S2C）。这些结果表明，仅LuxD就足以增强大肠杆菌脂肪酸可用性，从而支持更高发光输出，尽管要最大化性能可能还需通过额外代谢工程进一步优化。另外，与CsαDOX-Lux系统相比，表达LuxCDABE操纵子的大肠杆菌在补充低浓度肉豆蔻酸（20 μM）时发光强度提高至多4.3倍（图S2D）。这些条件下，体内脂肪酸向脂肪醛的转化在LuxEC依赖通路中似乎比CsαDOX-Lux系统更高效。
【数据】硫酯酶：LuxD、'TesA、TesB；LuxD增强倍数：3.9倍（相对'TesA/TesB）；肉豆蔻酸最佳浓度：200 μM；补充肉豆蔻酸增强：19倍；加LuxD增强：9.4倍；加LuxD后肉豆蔻酸需求：50 μM；LuxCDABE+20 μM肉豆蔻酸增强：4.3倍
研究者进一步考察融合蛋白策略，旨在通过最小化酶间扩散距离加速脂肪醛通道化。该设计中，LuxD与LuxB分别融合到CsαDOX的N端与C端。然而该融合策略未导致发光强度升高（图1C与图1D）。鉴于CsαDOX分子量较大（70.5 kDa），蛋白折叠受损或酶活性降低可能造成了融合构建体性能有限。与此解释一致，LuxD-G4S-CsαDOX融合体的可检测发光仅在室温孵育48 h后出现，提示融合蛋白折叠或成熟延迟（图S3）。尽管有这些局限，LuxAB-G4S-CsαDOX融合架构为构建单复合体自主生物发光系统提供了概念性启示，可作为未来结构或蛋白工程优化的起点。
【数据】融合构建体：LuxD-G4S-CsαDOX、CsαDOX-G4S-LuxD、LuxAB-G4S-CsαDOX；CsαDOX分子量：70.5 kDa；融合体发光检出时间：室温48 h；发光增强：无（未升高）
机器学习引导的定向进化提升αDOX-Lux发光输出
为进一步提高发光强度，研究者用机器学习引导策略对CsαDOX进行定向进化。具体而言，应用基于蛋白语言模型（PLM）的诱变，同时改善CsαDOX的适应度与催化活性景观。第一步采用基于PLM的零样本方法，用EvoProtGrad探索适应度景观。EvoProtGrad又称即插即用定向进化（PPDE），基于离散马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）框架整合无监督与有监督模型。后续轮次聚焦用EVOLVEpro增强活性景观，该方法此前已被证明可改善多种酶的催化性能，包括CRISPR核酸酶、先导编辑器和T7 RNA聚合酶。EvoProtGrad与EVOLVEpro均采用ESM-2作为突变设计的底层PLM。经过四轮迭代诱变，生成并评估了一组CsαDOX多突变变体（图2A）。CsαDOX-Lux操纵子（LuxD+CsαDOX+LuxAB）的亮度早在第一轮诱变即升高（图2B）。CsαDOX多突变变体筛选鉴定出CsαDOX-I489L/F407V突变体（下称增强型CsαDOX，eCsαDOX），其发光强度相对原始CsαDOX-Lux操纵子提高至多7.2倍（图2C）。平行地，在CsαDOX诱变之前，研究者用EvoProtGrad与EVOLVEpro对细菌荧光素酶催化亚基LuxA进行定向进化。LuxA诱变在天然LuxCDABE操纵子背景下进行。该筛选获得一个更亮的LuxA变体，携带C130E/N148G/F186N/A128F突变（LuxA v.1），亮度约为野生型LuxA的10倍。引入额外突变Q344A（eLuxA）后，亮度相对野生型LuxA进一步提高至约14倍（图S4）。随后将LuxA v.1与eLuxA纳入eCsαDOX-Lux操纵子，亮度相对原始CsαDOX-Lux操纵子提高至多7.9倍（图3A）。为进一步提高光子输出，研究者引入黄色荧光蛋白（Venus），通过生物发光共振能量转移（BRET）提高表观量子产率，此策略此前已在Nano-lanternX系统开发中得到验证。将Venus融合到eLuxA得到eCsαDOX-eYNLX操纵子；然而该修饰未导致亮度进一步提高……（原文节选至此结束，后续内容未详述）。
【数据】进化轮次：4轮；突变体：CsαDOX-I489L/F407V（eCsαDOX）；eCsαDOX增强：7.2倍；LuxA v.1突变：C130E/N148G/F186N/A128F；LuxA v.1亮度：约10倍；eLuxA额外突变：Q344A；eLuxA亮度：约14倍；eCsαDOX-Lux（含LuxA v.1/eLuxA）增强：7.9倍；融合：Venus-eLuxA（eYNLX）；eYNLX亮度变化：未进一步提高（原文节选至此）
表达LuxCDABE与eCsαDOX-eLux操纵子的大肠杆菌抗生素响应
（原文结果节选未包含该小节文字，图4对应内容未详述。）
【数据】菌株：大肠杆菌JM109(DE3)；操纵子：LuxCDABE、eCsαDOX-eLux；抗生素：原文节选未详述；数值：原文未详述
【数据】图5：原文未提供图注与对应结果文字，数据原文未详述
讨论与解读
本研究建立了一条源自细菌生物发光系统的替代性自主发光通路，不依赖ATP运行。该通路中，α-双加氧酶（αDOX）催化脂肪酸转化为脂肪醛，无需ATP或NADPH，从而在功能上替代ATP依赖的LuxEC复合体，作为细菌荧光素酶的荧光素供给模块。αDOX广泛分布于植物界，也见于蓝细菌等非植物生物。植物中拟南芥αDOX（AtαDOX）与水稻αDOX（OsαDOX）已被充分表征，有可用的晶体结构，偏好较长链脂肪酸（>C16）。相比之下，来自蓝细菌的αDOX，包括Crocosphaera subtropica（CsαDOX）、Calothrix parietina（CalαDOX）和Leptolyngbya sp.（LepαDOX），据报道偏好利用中链脂肪酸。鉴于中链脂肪酸与Lux通路生产脂肪醛更兼容，选择这些酶是期望以不依赖ATP的方式增强发光。尽管CsαDOX-Lux操纵子的发光强度仍低于天然LuxCDABE操纵子，这一差异可归因于若干因素。其一，CsαDOX产生（n−1）脂肪醛，偏好碳链长度的差异可能降低底物兼容性……（原文讨论节选至此结束）。
编译者解读
把底物供给从ATP依赖的LuxEC换成αDOX，思路干净：绕开能量货币，发光就不再随宿主ATP池起舞。机器学习引导的定向进化在四轮内把CsαDOX亮度拉高7.2倍、组合LuxA变体达7.9倍，说明PLM零样本+活性优化的组合对缺乏结构数据的酶确实管用。但亮度仍不及天然LuxCDABE，且（n−1）醛的链长兼容性、70.5 kDa大蛋白的融合折叠都是硬约束。抗生素实验只显示相关性，未确立ATP因果机制——这是该工作最需要后续补强的一环。
参考来源
期刊：iScience（2026）
DOI：10.1016/j.isci.2026.118029
DOI: 10.1016/j.isci.2026.118029