来源：Transcriptomic and proteomic profiling reveals carbon nanoparticles regulation of glucosinolate biosynthesis in radish microgreens (Raphanus sativus L.)（Scientia Horticulturae）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
碳纳米颗粒（CNPs）能提升萝卜芽苗菜中硫苷（GSLs）的含量，但背后的调控网络一直不清楚。本研究用转录组加蛋白质组的多组学手段，追踪了0–200 mg/L CNPs处理下萝卜芽苗菜的生长表型、元素含量、氨基酸谱、硫苷谱及基因/蛋白表达变化。结果锁定了一批以浓度特异方式响应的硫苷合成结构基因，并通过WGCNA找出与硫苷显著相关的MYB44、C2H2、MYC2、ERF105等转录因子，勾勒出CNPs调控硫苷合成的新网络。
研究背景
硫苷是一类富含硫的次生代谢物，在十字花科蔬菜（西兰花、萝卜、芥菜等）中广泛分布。其降解产物具有生物活性，在心血管疾病、抑郁、肥胖等慢性病防护方面显示出效果，在癌症预防与抑制方面尤为突出。硫苷的生物合成途径已较为清晰：以甲硫氨酸、色氨酸或苯丙氨酸为起点，经支链氨基转移酶脱氨生成相应氧代酸，再经过链延伸、核心结构形成和侧链修饰等保守步骤。其中，MAM介导的缩合、IPMI催化的异构化、IPMDH参与的氧化脱羧依次进行；BCAT4、MAMs、IPMs和IPMDHs是链延伸阶段的关键限速酶。核心结构的形成则由细胞色素P450酶等催化完成。
碳纳米材料已被报道可影响植物次生代谢物的合成，例如荧光碳点可诱导Tetrastigma Hemsley中次生代谢物、黄酮、卟啉与叶绿素代谢相关基因的表达，单壁碳纳米管（SWCNTs）能以浓度依赖方式促进酚酸和黄酮的积累，镁掺杂碳量子点可激活水稻次生代谢物合成。然而，CNPs如何调控萝卜芽苗菜硫苷合成，其分子机制尚缺乏系统解析。本研究即以此为切入点，采用多组学策略展开分析。
研究方法
2.1 植物材料
红色萝卜种子（每组30 g，购自山东潍坊寿和种业）进行水培。配制不同浓度的碳纳米颗粒分散液（0、25、50、100、200 mg/L）。六组种子（编号1–6）分别浸入100 mL碳纳米颗粒分散液中浸泡15 h。浸泡结束后，将种子转移至铺有一层湿润滤纸（用蒸馏水饱和）的发芽盘中。发芽盘用带孔保鲜膜覆盖，在27°C、相对湿度70%的光照条件下培养。种子保持湿润状态24 h直至发芽。培养结束后移除滤纸，使用自配的、不含硝酸盐和硫酸盐组分的改良Hoagland营养液开始水培。生长时长从发芽开始记录。第1天，向第2–6组的水培系统中加入不同浓度的碳纳米颗粒分散液（0、25、50、100、200 mg/L）以及5 mmol/L的K2SO4和KNO3溶液。第1组为空白组，仅加入改良Hoagland溶液；第2组加入盐但不加CNPs，作为对照组。萝卜芽苗菜在第8天收获，冻干、粉碎，4°C冷藏备用。每个处理浓度重复三次。
【数据】种子用量：30 g/组；CNPs浓度：0、25、50、100、200 mg/L；浸泡体积：100 mL；浸泡时间：15 h；培养温度：27°C；相对湿度：70%；发芽维持时间：24 h；K2SO4/KNO3浓度：5 mmol/L；收获时间：第8天；重复数：3次
2.2 萝卜芽苗菜表型性状分析
生长特性分析。生长第8天，从每组收获萝卜芽苗菜。每组随机选取20株进行表型测量。用游标卡尺测量株高，计算并记录平均值。
元素含量分析。硫和钾含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES，Agilent 5110）测定。取约0.1 g冻干粉碎样品，在微波消解系统中用3 mL浓HNO3消解。消解液转移至25 mL容量瓶，定容后分析。硫和钾含量分别用硫和钾标准溶液计算。总氮含量用凯氏定氮仪（SKD-2000）测定。
氨基酸含量分析。氨基酸谱用Biochrom 30+氨基酸分析仪分析。色氨酸含量用高效液相色谱（Shimadzu，LC-20A）测定。
谷胱甘肽（GSH）含量。GSH含量按GSH检测试剂盒说明书测定。
硫苷谱分析。硫苷组分与浓度参照Demir等（2023）的方法，用超高效液相色谱联用Triple TOF 7600高分辨质谱仪分析。
【数据】株高测量：20株/组；样品量：约0.1 g；消解酸：3 mL浓HNO3；定容体积：25 mL；仪器：ICP-OES Agilent 5110、凯氏定氮仪SKD-2000、Biochrom 30+氨基酸分析仪、HPLC Shimadzu LC-20A、Triple TOF 7600
2.3 组学测序分析
#### 2.3.1 样品制备
萝卜芽苗菜于生长第8天收获，立即液氮速冻，送至基迪奥生物公司测序。每个处理组设三个生物学重复。转录组测序（RNA-seq）在cDNA文库构建后进行。提取样品总RNA，检查其纯度与完整性。用mRNA捕获磁珠富集mRNA，再经高温处理片段化。以片段化mRNA为模板，用逆转录酶混合物合成第一链cDNA。在第二链cDNA合成过程中，完成末端修复、poly-A加尾和接头连接。目标片段用Hieff NGS® DNA Selection Beads纯化，PCR扩增后的文库在Illumina Novaseq X Plus平台上测序。
差异表达基因（DEG）分析如下：原始read counts用edgeR包归一化。通过假设检验计算P值，随后进行多重检验校正获得错误发现率（FDR）。显著差异表达基因定义为FDR < 0.05且|log2FC| > 1。DEG的功能注释使用Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库。
蛋白质提取使用iST样品制备试剂盒（PreOmics，德国）进行烷基化、酶解和肽段脱盐。样品用Bruker timsTOF Pro2质谱仪分析，进行数据依赖采集文库构建和数据非依赖采集分析，实现蛋白质定性定量图谱。鉴定组间丰度显著变化的蛋白质。用Benjamini-Hochberg方法校正p值（FDR < 0.05）。|FC| > 1.5且P < 0.05的蛋白质定义为差异表达蛋白（DEP）。DEP通过GO和KEGG通路注释。
转录组-蛋白质组整合分析包括基因与蛋白表达相关性、GO/KEGG富集和通路映射。显著性关键标准设定为转录组|FC| > 2、蛋白质组|FC| > 1.5、P < 0.05。重点关注在转录和翻译两个水平同时差异表达的基因/蛋白，尤其是富集于GSL生物合成通路的那些。
【数据】收获时间：第8天；生物学重复：3次；DEG标准：FDR < 0.05、|log2FC| > 1；DEP标准：|FC| > 1.5、P < 0.05；整合分析标准：转录组|FC| > 2、蛋白质组|FC| > 1.5、P < 0.05；测序平台：Illumina Novaseq X Plus；质谱仪：Bruker timsTOF Pro2
2.4 实时定量PCR（qRT-PCR）分析
qRT-PCR用于验证RNA-seq结果的可靠性。用植物RNA试剂盒（Sangon Biotech，中国）从CNP处理的萝卜芽苗菜中提取总RNA。qRT-PCR参照Wu等（2025）报道的方法进行。基因转录本丰度通过qRT-PCR定量，引物用PrimerQuest软件（www.idtdna.com）设计。qRT-PCR设三个生物学重复；平均相对基因表达水平用2-ΔΔCT法计算。以ACTIN基因作为内参基因。qRT-PCR引物序列见表S1。
【数据】生物学重复：3次；定量方法：2-ΔΔCT；内参基因：ACTIN；引物设计软件：PrimerQuest
2.5 统计分析
统计分析使用IBM SPSS Statistics（版本23）进行。所有实验重复三次。组间差异用Student's t检验评估，显著性设定为P < 0.05。
【数据】软件：IBM SPSS Statistics 23；重复数：3次；显著性阈值：P < 0.05；检验方法：Student's t检验
研究结果
3.1 CNP处理萝卜芽苗菜的生长特性分析
研究了CNPs对萝卜（Raphanus sativus L.）幼苗生长阶段的影响。如图1a和1b所示，与对照组相比，25–100 mg/L CNPs处理对萝卜芽苗菜株高呈正向效应，分别增加10.6%、5.9%和4.7%，而200 mg/L CNPs未影响植株生长。与对照组相比，100 μg/mL CNP处理后植株干重中的氮（N）和钾（K）含量分别显著增加23.09%和9.6%（p < 0.05）。
本研究在萝卜芽苗菜中共鉴定出18种不同的游离氨基酸（表1）。在主要游离氨基酸中，甲硫氨酸和色氨酸是GSL生物合成的前体物质。25–50 mg/L CNP处理后甲硫氨酸和色氨酸浓度下降，100–200 mg/L时则上升。在25–100 mg/L CNP浓度下，萝卜芽苗菜中谷氨酸浓度下降，并在25 mg/L时达到最低值，但当CNP浓度超过25 mg/L后显著上升（p < 0.001）。在25和50 mg/L CNP浓度下，甲硫氨酸和天冬氨酸浓度下降，与空白组和对照组均呈显著差异（p < 0.05），但更高浓度下未见显著变化。缬氨酸和丝氨酸浓度在CNP处理过程中逐渐下降。GSH含量随CNPs浓度升高而增加，100–200 CNPs处理组与其他组相比差异显著（p < 0.05，图S1）。
【数据】株高增幅：25 mg/L +10.6%、50 mg/L +5.9%、100 mg/L +4.7%；氮含量增幅：+23.09%（100 μg/mL，p < 0.05）；钾含量增幅：+9.6%（100 μg/mL，p < 0.05）；游离氨基酸种类：18种；谷氨酸最低值浓度：25 mg/L（p < 0.001）；甲硫氨酸/天冬氨酸显著差异浓度：25、50 mg/L（p < 0.05）；GSH显著差异组：100–200 mg/L（p < 0.05）；200 mg/L对株高：无影响
3.2 萝卜芽苗菜硫苷谱与含量
不同浓度CNPs处理萝卜芽苗菜的GSL谱与含量见表2。共鉴定出5种主要GSLs，包括3种脂肪族和2种吲哚型，其中glucoraphenin（GRH）丰度最高，其次是4-甲基硫代-3-丁烯基硫苷（4-MGBS）。与对照组相比，200 mg/L CNP处理组总GSL含量增加19.59%。GRH是萝卜特有GSL，占总GSLs比例最大，其次为4-MGBS。在50 mg/L和200 mg/L CNP浓度下，GRH含量相对对照组分别增加16.32%和23.53%。glucoerucin（GRE）含量在100 μg/mL CNP处理下最高（1.32 μM/g）。同样，4-MGBS含量在100 μg/mL CNP处理下达到峰值，较对照组增加25.7%。
【数据】鉴定GSL种类：5种（3种脂肪族+2种吲哚型）；总GSL增幅：+19.59%（200 mg/L）；GRH增幅：+16.32%（50 mg/L）、+23.53%（200 mg/L）；GRE最高含量：1.32 μM/g（100 μg/mL）；4-MGBS增幅：+25.7%（100 μg/mL）
3.3 CNP处理萝卜芽苗菜的转录组分析
用RNA-seq研究了CNPs对萝卜芽苗菜转录组的影响。主成分分析（PCA）显示CNP处理组与对照组明显分离，PC1和PC2分别占总变异的89%和5.4%（图2a）。不同浓度CNPs处理组由PC1区分，表明转录水平发生显著变化。相关性热图分析显示组内重复性高，所有三个生物学重复的决定系数（r2）均超过0.8（图S2）。从18个不同浓度CNPs处理的萝卜芽苗菜样品中共获得61.17 GB clean data。DEG以P < 0.05和|log2FC| > 1.0为阈值鉴定。比较分析共鉴定出6022个显著DEGs。其中，Ctrl vs Blank、Ctrl vs 25、Ctrl vs 50、Ctrl vs 100和Ctrl vs 200比较分别有671、2788、1821、656和1522个上调DEGs，以及232、1531、783、337和373个下调DEGs，表明它们可能参与萝卜芽苗菜对CNP处理的生理响应（图2b）。
DEG的GO功能注释分析鉴定了参与CNPs响应的调控通路（图2c）。DEG的GO富集分析揭示CNPs影响多个细胞过程，包括生物学过程、分子功能和细胞组分。与生物学过程相关的DEGs主要涉及细胞过程、代谢过程、生物调控、定位和应激响应。与细胞组分相关的DEGs主要与细胞解剖实体和含蛋白复合物相关。与分子功能相关的DEGs主要是结合、催化活性、运输活性、ATP依赖性和结构分子活性。Ctrl vs 200的GO富集分析显示在生物学过程类别中显著过代表，尤其是细胞过程、代谢过程、生物调控、生长、催化活性。这一观察表明CNPs作为外部刺激可能引起萝卜芽苗菜的变化。次生代谢物、阳离子吸收和转运受到调控以抵抗外部刺激。
KEGG通路分析进一步揭示CNP处理影响的关键代谢通路（图2d）。显著富集的通路包括苯丙烷生物合成（ko00940）、次生代谢物生物合成（ko01110）、GSL生物合成（ko00966）、植物MAPK信号（ko04016）以及氮/硫代谢（ko00910/ko00920）。在GSL生物合成通路内，编码BCAT4（ncbi_108857098）、MAM1（ncbi_108828349）、CYP79F1（ncbi_108812420）、IPMDH1（ncbi_108822324）、SUR1（ncbi_108813271）和UGT74B1（ncbi_108814109）的关键DEG表现出明显的差异表达。
【数据】PC1/PC2方差贡献：89%/5.4%；r2：>0.8；clean data总量：61.17 GB；样品数：18；显著DEGs总数：6022；上调DEGs：671（Ctrl vs Blank）、2788（Ctrl vs 25）、1821（Ctrl vs 50）、656（Ctrl vs 100）、1522（Ctrl vs 200）；下调DEGs：232、1531、783、337、373；DEG阈值：P < 0.05、|log2FC| > 1.0；富集通路：ko00940、ko01110、ko00966、ko04016、ko00910/ko00920
3.4 CNP处理萝卜芽苗菜的蛋白质组分析
对照组与CNP处理组三个重复间呈显著相关，R2 > 0.8。相关性分析显示不同CNP浓度处理样品间存在强组间相关性（图3a）。散点图展示对照组与CNP处理组之间DEPs的分布（图3b）。DEPs被归类到多种GO条目，涉及应激响应、膜和酶激活剂活性（图3c）。KEGG通路富集分析显示DEPs参与内质网蛋白加工、GSL代谢、GSH代谢、氨基酸生物合成和氮代谢通路（图3d）。
【数据】重复间相关：R2 > 0.8；GO条目：应激响应、膜、酶激活剂活性；KEGG通路：内质网蛋白加工、GSL代谢、GSH代谢、氨基酸生物合成、氮代谢
3.5 转录组-蛋白质组整合分析
由于基因表达和蛋白质合成调控网络的复杂性，采用转录组与蛋白质组联合策略。该方法能够鉴定可能参与CNP调控GSL生物合成的关键基因。为验证整合分析，对6个选定基因进行qRT-PCR，比较转录组与蛋白质组数据。qRT-PCR测定的基因表达与RNA-seq结果一致（图S3），证实了转录组和蛋白质组结果的可靠性。
对Ctrl与200 mg/L CNP组中鉴定到的基因和蛋白的差异倍数进行整合转录组-蛋白质组分析。基因与蛋白的共表达直接展示在维恩图中（图4a），有139个基因在翻译水平和转录后水平均重叠。在基因-蛋白共表达分析中，点被分类为两者均显著、任一显著或均不显著（图4b）。由于萝卜中复杂的调控过程，转录组与蛋白质组之间观察到弱相关。CNPs的调控主要影响翻译水平和蛋白翻译水平，表明基因转录与翻译之间存在时间差异。
【数据】qRT-PCR验证基因数：6个；重叠基因数：139个；整合分析组别：Ctrl vs 200 mg/L；转录组-蛋白质组相关性：弱相关
讨论与解读
碳基纳米材料对植物活性化合物的影响已通过多组学方法得到考察。多组学分析整合不同层次的生物信息，为生物过程及潜在机制提供更广阔的视角和更深入的解释。已有研究表明，荧光碳点可诱导Tetrastigma Hemsley中次生代谢物生物合成、黄酮生物合成、卟啉与叶绿素代谢相关DEGs，并建立基因-代谢物关联网络，多组学分析揭示44个枢纽基因与荧光碳点诱导的品质成分积累高度相关；SWCNTs以浓度依赖方式促进酚酸和黄酮等活性化合物的积累；镁掺杂碳量子点纳米材料可激活水稻次生代谢物生物合成。这些研究均表明碳纳米材料影响植物次生代谢物合成。在植物中，矿质元素的吸收利用、初生与次生代谢物合成与代谢共同构成复杂且高度协调的网络。硫苷及其水解产物在生理过程中发挥多种作用——本研究正是在这一框架下，通过转录组与蛋白质组整合，揭示了CNPs以浓度特异方式调控BCAT4、MAM1、IMDH1、SUR1、CYP79F1、UGT74B1等结构基因，并经WGCNA锁定MEpink、MEdarkgreen、MEdarkmagenta模块中MYB44、C2H2、MYC2、ERF105等转录因子与硫苷显著相关，构建了CNPs调控萝卜芽苗菜硫苷生物合成的新调控网络。
编译者解读：该研究的方法学价值在于把表型—元素—代谢物—转录本—蛋白五个层次串成一条证据链，尤其用九象限矩阵和WGCNA把浓度效应落到具体转录因子上，为纳米材料诱导植物品质改良提供了可复用的分析范式。局限也明显：转录组与蛋白质组仅呈弱相关，说明翻译后调控未被覆盖；且实验止于关联分析，MYB44、MYC2等枢纽因子尚未经遗传验证。对合成生物学而言，这批浓度响应型启动子元件与TF候选清单，可作为在微生物或植物底盘重构硫苷通路的调控部件来源。
参考来源
期刊：Scientia Horticulturae, 2026
DOI: 10.1016/j.scienta.2026.115162
DOI: 10.1016/j.scienta.2026.115162