来源：Biocatalytic recycling of waste paper using Aspergillus niger cellulase: Comparative evaluation of crude and commercial cellulase with chemical deinking（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
废纸回收是缓解造纸原料压力与生态负荷的可行路径，但化学脱墨能耗高、污染重。本研究从感染菠萝皮上分离一株黑曲霉，经形态学与18S rRNA测序鉴定后优化产酶条件，使纤维素酶活从1.14 U/mL提升至4.5 U/mL；随后以粗酶、商业纯酶与化学法对复印纸、手写纸、新闻纸进行脱墨对比，用脱墨效率、ISO白度、抗张指数及SEM、FTIR、XRD评价纤维结构变化。结果显示脱墨性能随纸种而变：粗酶对复印纸最优，纯酶对手写纸最优，新闻纸两者相当。
研究背景
近几十年来人口增长与办公自动化推高了纸张需求，造纸原料仍高度依赖天然纤维来源，由此加剧森林砍伐并产生大量固体废物。回收是公认的可持续替代方案，可通过化学或酶法实现。纤维素是纸制品的主要结构组分；每再加工1吨废纸约可得0.8吨再生浆，相当于少砍约17棵树。与化学制浆相比，回收可节省3–4 m³原生木纤维、约1.2吨煤、4 m³填埋空间、4100 kW电力、2.5桶石油，减少近100吨水耗，并显著降低有毒污染物排放。回收过程能耗比原生纤维造纸低约60%，主要因为制浆阶段在化学制造中占能耗比例最高。传统化学法虽成熟，但存在环境负担，酶法脱墨因此受到关注。不过，粗酶与商业纯酶在多种废纸上的对比评价仍然有限，这正是本研究要填补的空白。
研究方法
2 材料与方法 本研究所用全部试剂与分析级化学品购自Sigma-Aldrich、Merck（印度）及Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（SRL）。研究所用复印（静电）纸与新闻纸取自印度拉贾斯坦邦Banasthali Vidyapith生物科学与生物技术系办公室与实验室。使用过的手写纸取自同系废弃的学生笔记本与实验室记录。来源于黑曲霉的纯化纤维素酶为Sigma-Aldrich商业采购品，用于复印废纸回收。实验所用冷冻离心机（REMI CPR-24i PLUS，REMI Elektrotechnik Ltd.，印度）、轨道振荡培养箱（Metrex Scientific Instruments (P) Ltd.，新德里，印度）及其他设备在各分析章节中分别描述。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich、Merck（印度）、SRL；纸样来源：Banasthali Vidyapith生物科学与生物技术系；纯化酶来源：Sigma-Aldrich（黑曲霉）；离心机型号：REMI CPR-24i PLUS；培养箱：Metrex轨道振荡培养箱；原文未详述试剂具体批号与用量
2.1 产纤维素酶真菌的分离与分子鉴定 本研究真菌分离自菠萝皮。基于腐败水果样品中微生物产纤维素酶潜力的报道，选择一块肉眼可见感染的菠萝皮作为分离来源以获得多样真菌分离物（图1）。果实样品采集自拉贾斯坦邦Banasthali Vidyapith的Rohit Juice Centre，地理坐标为北纬26.4057°、东经75.8753°。分离物经宏观与微观检查。鉴定采用乳酸苯酚棉蓝（LCB）染色法结合玻片培养技术进行显微观察，并在光学显微镜下观察（Meena et al., 2018）。显微分析使用LABOMED双目光学复合显微镜（LABOMED Inc.，美国），配有限远光学系统与10×目镜，物镜为4×、10×、40×与100×消色差镜头，LED照明。宏观检查包括颜色、质地与外观观察。此外，通过18S rRNA测序进行分子鉴定验证，测序由浦那国家微生物资源中心（NCMR）完成。所得序列用NCBI的BLAST工具比对以作比较与鉴定，并进一步开展进化研究。
【数据】分离源：感染菠萝皮；采样点：北纬26.4057°、东经75.8753°；染色法：乳酸苯酚棉蓝（LCB）；显微镜：LABOMED双目复合光镜，10×目镜，4×/10×/40×/100×物镜；测序机构：NCMR浦那；测序基因：18S rRNA；原文未详述培养基与培养温度
2.1.1 进化与系统发育分析 所得真菌分离物18S rRNA基因序列与NCBI GenBank数据库中检索到的近缘参考序列一起用于进化分析。系统发育分析使用MEGA version 12（MEGA12）进行。进化史采用邻接法（NJ）推断，进化距离用最大复合似然法计算。推断的系统发育关系可靠性用500次bootstrap重复评估。对含模糊数据的位点采用成对删除，最终数据集为3925个核苷酸位点。分析共包含18条核苷酸序列，包括本分离物序列（黑曲霉，GenBank登录号PX133018.1）、近缘参考序列及外群序列。所得系统发育树用MEGA12的Tree Explorer功能可视化。
【数据】软件：MEGA version 12；方法：Neighbour-Joining；距离模型：Maximum Composite Likelihood；bootstrap：500次重复；位点删除：成对删除；最终数据集：3925个核苷酸位点；序列数：18条；登录号：PX133018.1
2.2 定性检测与酶定量 纤维素酶活性定性检测采用刚果红覆染法（Zhang and Dong, 2022）。将真菌分离物接种于添加1%羧甲基纤维素（CMC）的土豆葡萄糖琼脂（PDA）平板，28 °C培养3至6天。培养后，平板用1%刚果红染液室温覆染15 min，随后用1 M NaCl溶液充分脱色。真菌菌落周围出现透明圈或晕圈即确认纤维素酶对纤维素的降解（Bairagi, 2016）。观察重复三次以确保准确与一致。初筛后，对分离物进行复筛以进一步评估其产酶潜力，酶定量采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法，该方法对还原糖检测范围广且蛋白质干扰小（Miller, 1959; Sharma et al., 2016）。酶定量使用6天龄真菌培养物的酶液，该培养物由Czapek-Dox肉汤深层发酵（SmF）产生。反应体系为0.5 ml粗酶加1%羧甲基纤维素（CMC）与50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）。样品在预设水浴中50 °C孵育30 min。用3 ml DNS试剂终止酶反应。随后样品煮沸5 min，室温（RT）冷却以稳定颜色。以空白为对照，用紫外-可见分光光度计在540 nm记录吸光度（Malik and Javed, 2021）。蛋白浓度用Lowry法测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，浓度由标准曲线推算（Lowry et al., 1951）。具体而言，1单位（U）活性指标准条件下释放1 μmol葡萄糖当量所需的酶量。
【数据】培养基：PDA+1% CMC；初筛温度：28 °C；初筛时间：3–6天；刚果红浓度：1%；覆染时间：15 min；脱色液：1 M NaCl；酶液来源：6天龄SmF培养物（Czapek-Dox肉汤）；反应体系：0.5 ml粗酶+1% CMC+50 mM柠檬酸钠缓冲液；pH：4.8；反应温度：50 °C；反应时间：30 min；DNS用量：3 ml；煮沸：5 min；检测波长：540 nm；蛋白标准品：BSA
2.3 硫酸铵沉淀法部分纯化纤维素酶 取在相应生长培养基中培养6天的真菌培养物，经Whatman滤纸过滤去除菌丝体与颗粒物。纤维素酶部分纯化采用硫酸铵沉淀至80%饱和度。澄清上清液在室温下分别进行60%与80%（w/v）饱和度硫酸铵沉淀。过夜孵育后，以10,000 ×g、4 °C离心10 min收集沉淀蛋白。所得沉淀重悬于100 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）。为去除残留硫酸铵与其他杂质，酶悬液用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次并在相同条件下离心（Patel and Gupte, 2016）。纤维素酶活性用DNS法测定。选择酶活最高的组分用于后续优化与进一步研究。收集60%与80%饱和度所得酶组分，与酶提取液比较蛋白含量与酶活性（Patel and Gupte, 2016）。
【数据】培养龄期：6天；滤纸：Whatman；硫酸铵饱和度：60%与80%（w/v）；沉淀孵育：过夜、室温；离心：10,000 ×g、10 min、4 °C；重悬缓冲液：100 mM乙酸钠、pH 5.0；洗涤液：PBS；洗涤次数：2次；活性测定：DNS法
2.4 黑曲霉产纤维素酶的优化 影响酶处理的变量采用单因素一次法逐一优化，其余参数保持不变。物理与营养培养条件在设定范围内系统优化以提高纤维素酶产量与活性。评价的关键参数包括培养基、pH、温度、培养时间、碳源与氮源。黑曲霉CBS 554.65在土豆葡萄糖肉汤（PDB）中经深层发酵（SmF）培养，并在这些参数的设定范围内评价。各变量对酶活的影响通过DNS法测定纤维素酶活性量化。每个参数实验均设三次重复。培养基优化评价了不同肉汤配方，包括土豆葡萄糖肉汤（PDB）、Czapek-Dox肉汤、基础盐培养基（BSM）与羧甲基纤维素（CMC）肉汤。为确定最佳培养时间，培养物在第3、6、9天收获分析。pH用1 N NaOH或1 N HCl调节至3.5–9.5范围，温度影响在18 °C至……（原文此处节选中断，后续参数原文未详述）。
【数据】菌株：黑曲霉CBS 554.65；基础培养基：PDB；发酵方式：SmF；优化方法：单因素一次法；培养基候选：PDB、Czapek-Dox、BSM、CMC肉汤；取样时间：第3、6、9天；pH范围：3.5–9.5；调节剂：1 N NaOH/1 N HCl；温度范围起点：18 °C；重复：三次；原文后续温度上限及碳氮源具体参数未详述
研究结果
3 结果与讨论 3.1 真菌的分离与鉴定 真菌自肉眼可见感染的菠萝外皮分离。感染果皮置于塑料袋中保湿3天以促进真菌增殖。随后用无菌手术刀无菌切取感染部位，接种于土豆葡萄糖琼脂（PDA）平板。培养2–3天内观察到真菌生长，此后将长出的菌落反复转接至新鲜PDA平板。共进行约4–5次连续转接以消除污染与混合真菌生长，获得形态均一的纯培养物。纯化分离物随后保存于PDA，并进行宏观、微观与分子表征。生长第2至第3天观察到的形态特征为：正面黑色、边缘宽白，培养皿背面呈淡黄至白色、中心黑色。至第5天，分生孢子完全成熟，平板正反面均呈全黑。质地为粉状与颗粒状，真菌生长迅速，通常4至5天覆盖整个平板。用LCB染色法在10×与40×放大下显微观察分离物关键形态特征。菌丝有隔膜，无色透明（hyaline）。分生孢子梗光滑平直，末端膨大为圆形/球形顶囊。顶囊完全被两层产孢细胞覆盖，称为双列瓶梗（biseriate phialides）。分生孢子链自顶囊表面向外辐射。分生孢子圆形、黑色、表面粗糙。观察到的显微特征与黑曲霉相符（图2）。
【数据】保湿时间：3天；培养观察：2–3天；转接次数：4–5次；第2–3天菌落正面：黑色宽白边；背面：淡黄至白、中心黑；第5天：正反面全黑；覆盖平板时间：4–5天；显微放大：10×与40×；染色：LCB；菌丝：有隔膜、透明；顶囊：球形；产孢结构：双列瓶梗；孢子：圆形、黑色、粗糙
经宏观与微观表征后，通过18S rRNA基因测序对分离物进行分子鉴定以验证初步观察。测序由浦那国家微生物资源中心（NCMR）完成。所得序列BLAST分析显示与黑曲霉CBS 554.65相似性达99.83%，从而在种水平确认了分离物身份。18S rRNA基因序列已提交NCBI GenBank数据库，菌株登录号为PX133018.1，可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PX133018.1 获取。
【数据】测序机构：NCMR浦那；基因：18S rRNA；BLAST相似性：99.83%；比对参考菌株：黑曲霉CBS 554.65；登录号：PX133018.1
3.1.1 系统发育分析 十八条分析核苷酸序列间的进化关系用500次bootstrap重复评估。聚类模式及bootstrap支持值支持将该分离物鉴定为黑曲霉。所得邻接树在受支持的内节点上bootstrap支持值为6%至98%（图3）。若干关系具高bootstrap支持，包括98%、79%、72%与60%支持的节点，而其他节点支持较低（6–36%），表明对所分析类群间推断关系的置信度不一。本研究所得黑曲霉分离物（PX133018.1）与近缘参考序列一起位于曲霉属组内。树中还包含里氏木霉、桔青霉与产黄青霉作为外群分类单元。外群序列形成与曲霉簇分离的独立分支，使分析类群清晰分隔。系统发育树中bootstrap支持的差异表明推断进化关系的置信水平不同。虽然若干内节点显示较高支持（72–98%），部分关系支持较弱（<50%）。尽管如此，PX133018.1在曲霉属组内的位置与其基于序列相似性和BLAST分析的鉴定一致。
【数据】bootstrap重复：500次；支持值范围：6–98%；高支持节点：98%、79%、72%、60%；低支持节点：6–36%；弱支持：<50%；序列数：18条；外群：里氏木霉、桔青霉、产黄青霉；分离物登录号：PX133018.1
3.2 定性检测与酶定量 对分离真菌的初筛采用刚果红法，依据菌落周围水解圈肉眼判断所选分离物的产纤维素酶潜力。刚果红覆染试验设三次重复以确保结果准确与可重复。该真菌分离物产生明显而明亮的透明圈，测得晕圈直径为40 ± 1.0 mm（图4），表明纤维素酶活性显著。晕圈用晕圈标尺测量并三次重复。透明圈的存在确认了胞外纤维素酶的分泌，主要是负责将羧甲基纤维素水解为可溶性糖的内切葡聚糖酶（Bairagi, 2016）。定性筛选后，用二硝基水杨酸（DNS）法基于葡萄糖标准曲线估算还原糖，对纤维素酶活性进行定量评估（Kaur et al., 2017）。酶活测定以Czapek-Dox肉汤为生长培养基。酶由锥形瓶深层发酵（SmF）培养，每组三个，孵育5天。第6天回收的培养物经Whatman No. 1滤纸过滤，去除菌丝体、碎屑并防止非特异性干扰。滤液随后以10,000 rpm离心10 min。样品用冷冻离心机（CPR-24i PLUS，REMI Elektrotechnik Ltd.，印度）离心。所得澄清上清液用作粗（无细胞）胞外酶样品（Bairagi, 2016）。作为初步硫酸铵分级研究的一部分，对粗酶制剂与所得硫酸铵组分进行纤维素酶活性评价。粗酶组分补加硫酸铵至60%与80%饱和度并过夜孵育。样品随后在4 °C下以10,000 rpm离心10 min。回收组分用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2–3次以去除残留硫酸铵并减少盐干扰。所得组分随后在与粗酶制剂相同条件下用DNS法评价纤维素酶活性。每个组分进行三次重复测试。粗酶制剂活性为1.141 U/mL，而60%与80%硫酸铵组分活性分别为0.0907与0.0799 U/mL。由于粗酶制剂在所评价组分中纤维素酶活性最高，故选择粗酶制剂用于后续产酶条件优化。在相同条件下建立葡萄糖标准曲线（1 mg/ml）以测定生成的还原糖。滤液的一个纤维素酶活性单位表示为每毫升单位（U/ml），定义为测定条件下每分钟每毫升释放1 μM还原糖的酶量（Gupta et al., 2015）。
【数据】初筛方法：刚果红覆染；重复：三次；晕圈直径：40 ± 1.0 mm；发酵方式：SmF（锥形瓶）；培养时间：5天；收获：第6天；滤纸：Whatman No. 1；离心：10,000 rpm、10 min；硫酸铵饱和度：60%、80%；孵育：过夜；离心温度：4 °C；PBS洗涤：2–3次；粗酶活性：1.141 U/mL；60%组分活性：0.0907 U/mL；80%组分活性：0.0799 U/mL；葡萄糖标准曲线：1 mg/ml；单位定义：1 μM还原糖/mL/min
3.3 产纤维素酶物理与培养条件的优化 由于酶分级研究表明粗酶组分纤维素酶活性最高，故对其进一步进行物理与营养条件优化。产酶参数随后以三次重复优化以确保结果可重复。在体外条件下优化多种物理与营养参数以提高黑曲霉产纤维素酶。关键参数……（原文此处节选中断，优化结果的具体数值原文未详述；据摘要，优化后纤维素酶活由1.14 U/mL提高至4.5 U/mL）。
【数据】优化对象：粗酶组分；重复：三次；优化方式：体外单因素；优化前活性：1.14 U/mL；优化后活性：4.5 U/mL；原文节选未详述各参数具体最优值
3.4 脱墨性能比较（据结论部分） 酶法脱墨在10%浆浓、pH 6.0、50 °C、160 rpm、60 min条件下进行，复印纸用5 U/5 g浆，手写纸与新闻纸用10 U/5 g浆。化学脱墨采用1.5% NaOH、1% H₂O₂、2%硅酸钠，40 °C、20 min、160 rpm，随后表面活性剂辅助洗涤。比较结果呈现纸种依赖性：粗酶对复印纸脱墨效率达87.32%，商业纯酶对手写纸达85.71%，两者对新闻纸均为33.33%。粗酶处理复印纸的ISO白度为90.81%、抗张指数29.5 Nm/g；纯酶处理手写纸ISO白度86.0%；新闻纸纯酶抗张指数恢复更佳（9.2 Nm/g）。多种纸种上酶处理的白度与抗张指数恢复高于实验室规模化学法。SEM、FTIR与XRD分析提供了处理相关纤维形态与纤维素结构特征变化的互补证据。
【数据】酶法条件：浆浓10%、pH 6.0、温度50 °C、转速160 rpm、时间60 min；酶用量：复印纸5 U/5 g浆，手写纸与新闻纸10 U/5 g浆；化学法：1.5% NaOH、1% H₂O₂、2%硅酸钠、40 °C、20 min、160 rpm；粗酶复印纸脱墨效率：87.32%；粗酶复印纸ISO白度：90.81%；粗酶复印纸抗张指数：29.5 Nm/g；纯酶手写纸脱墨效率：85.71%；纯酶手写纸ISO白度：86.0%；新闻纸脱墨效率（两种酶）：33.33%；新闻纸纯酶抗张指数：9.2 Nm/g
讨论与解读
本研究对比评价了粗黑曲霉纤维素酶、商业纯化纤维素酶与实验室规模化学脱墨法对复印纸、手写纸与新闻纸的回收效果。粗酶在优化深层发酵条件下产酶，最高活性约4.5 U/mL。结果清楚显示脱墨性能取决于纸种：粗酶最适合复印纸（87.32%），商业纯酶最适合手写纸（85.71%），新闻纸两者均为33.33%。酶处理在多个纸种上的白度与抗张指数恢复优于化学法。SEM、FTIR与XRD从纤维形态与纤维素结构层面提供了互补证据。作者据此强调，应跨纸种比较不同酶制剂，而非只评价单一"酶—纸"组合。
编译者解读：该研究的价值在于把"粗酶vs纯酶"放回真实废纸基质中比较，提示合成生物学改造的脱墨酶制剂未必需要追求高纯度——粗酶体系中的辅助蛋白可能对复印纸更有利。局限也明显：新闻纸脱墨效率仅33.33%，说明油墨类型与纤维木质素含量仍是瓶颈；酶用量按纸种分别设定（5 vs 10 U/5 g），成本核算尚缺。对产业化而言，下一步应围绕纸种定制酶配方并评估循环用水的酶失活问题。
参考来源
期刊：Bioresource Technology Reports, 2026
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.103157
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.103157