来源：Protocol for constructing barcoded Saccharomyces cerevisiae strains and performing pooled mating experiments（STAR Protocols）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
天然酿酒酵母分离株遗传背景多样，是研究基因型—表型关系的宝贵资源，但缺乏高效、可追溯的高通量操作流程。本方案描述了从天然二倍体分离株出发，经高通量转化、转化子筛选与验证、产孢与稳定单倍体回收，最终获得携带抗生素抗性标记、组成型荧光报告和唯一DNA条形码的Mat-a与Mat-α单倍体菌株的完整实验流程，并可选配混合交配（en masse mating）产生混合二倍体后代。作者在约200株二倍体起始菌株中经四轮独立实施，回收获得90株验证通过的Mat-a菌株和50株验证通过的Mat-α菌株，为大规模天然分离株的pooled遗传分析提供了可执行的操作蓝本。
研究背景
条形码标记的酿酒酵母菌株使得跨众多基因型的混合（pooled）遗传分析成为可能。此类分析依赖于一套稳定、可追踪且通量足够的菌株构建流程：需要把条形码与抗性标记、荧光报告一起整合进基因组，需要从天然二倍体分离株获得可交配的单倍体衍生物，还需要在96孔板、琼脂选择平板、琼脂patch平板与24孔板等多种板式之间保持菌株身份的可追溯性。原文摘要指出，本方案旨在生成来自天然二倍体分离株的稳定条形码单倍体菌株，工作流涵盖高通量转化、转化子筛选与验证，随后进行产孢与稳定单倍体回收，并包含表型与分子验证方法；可选的混合交配流程用于产生混合二倍体后代。关于该方案的完整使用与执行细节，原文指引读者参阅Strauss等的工作。
研究方法
逐步方法细节
#### 天然菌株的转化前准备
耗时：3天
本步骤准备亲本菌株的标准化起始培养物，并建立跨板式的定位追踪，以服务于下游高通量转化（图2A）。
1. 准备用于转化的亲本酵母菌株。
a. 选择适合在HO位点进行基因组整合的酿酒酵母菌株。这些菌株可以是二倍体、Mat-a或Mat-α菌株。
b. 验证菌株基因型，并确认不存在会干扰筛选与追踪的抗生素抗性标记和荧光报告。
c. 将菌株划线接种于YPD琼脂平板，30°C培养2天以获得单菌落。
d. 从YPD琼脂平板挑取48株二倍体菌株，按棋盘格模式接种到装有1 mL YPD培养基的96深孔板中，30°C、1200 rpm振荡培养14–20 h（图3A）。注意：仅含培养基的孔作为交叉污染的内部控制，应保持无生长。
e. 准备48支50 mL离心管，按对应孔位标签标注（如A1、A3、…、B2、B4、…、H12），每管装10 mL YPD培养基。
f. 随机挑取2株菌，为其额外准备两支50 mL管；它们将在下游转化中作为阴性对照（步骤4c）。注意：菌株定位策略。为尽量减少手动高通量操作中的样本混淆，通过在各板式间保持一致的定位映射来维持菌株身份。菌株最初以96孔格式组织，固定位置对应其菌株编号。当工作流在产孢期间临时切换到不同板式（如24孔板），或当每株菌需处理多个菌落时，位置会被系统性地重新分配，同时保留原始编号方案。后续步骤回到96孔格式，保持相同的位置标识，以确保每株菌和每个菌落在整个工作流中的可追溯性（图3）。
g. 从每孔转移10 μL培养物至对应的50 mL管中，30°C振荡培养16 h。
h. 以相同方式准备两株阴性对照菌株。
i. 使用血细胞计数板（Burker计数室）测定4个随机选取样本的细胞浓度。关键：确保细胞处于对数中期（1–2 × 10⁷ cells/mL），且大多数细胞已出芽。过生长的培养物（≥7 × 10⁷ cells/mL）会降低转化效率。若培养物达到对数晚期，按1:50稀释到10 mL新鲜YPD培养基中（50 mL管），重新培养2–4 h后再继续。由于仅计数4株菌，应避免使用高度聚集或絮凝的菌株。若必须使用这些菌株，则在细胞计数前对样品进行超声处理。一旦二倍体培养物达到对数中期，立即进行高通量转化以最大化整合效率。
【数据】菌株数：48株二倍体（另2株阴性对照）；培养基：YPD；温度：30°C；时间：划线培养2天、振荡培养14–20 h、转移后培养16 h；转速：1200 rpm；培养体积：96深孔板1 mL、50 mL管10 mL；接种量：10 μL；细胞浓度：对数中期1–2 × 10⁷ cells/mL，过生长阈值≥7 × 10⁷ cells/mL；稀释比例：1:50；重新培养时间：2–4 h；计数样本：4个
#### 高通量转化
耗时：2天
本步骤将Mat-a和Mat-α构建体导入48株菌，产生抗生素抗性的二倍体候选菌株以供后续验证（图2B）。
2. 准备用于转化的PCR产物。
a. 分别为Mat-a和Mat-α构建体准备独立的反应。
b. 使用表S1所列整合引物（引物1和引物2），从各质粒PCR扩增完整整合盒。
i. 每种构建体每2株菌进行1个PCR反应。
ii. 分别合并Mat-a PCR产物和Mat-α PCR产物。配制PCR反应预混液：
| 试剂 | 每反应用量/体积 |
|---|---|
| Kapa HotStart HiFi 2× master mix | 25 μL |
| HO_integration_F (10 μM) | 1 μL |
| HO_integration_R (10 μM) | 1 μL |
| DNA模板（质粒） | 5 ng |
| ddH₂O | 补至50 μL |
注意：使用适合长片段扩增的商业化Kapa HotStart HiFi 2× master mix。可根据可获得性替换具体产品。按下述循环条件进行PCR：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 初始变性 | 98°C | 30 s | 1 |
| 变性 | 98°C | 10 s | 30个循环 |
| 退火 | 62°C | 20 s | 30个循环 |
| 延伸 | 72°C | 8 min | 30个循环 |
| 终延伸 | 72°C | 15 min | 1 |
| 保持 | 4°C | 持续 | — |
注意：若使用不同的DNA聚合酶，按所用酶调整变性温度和延伸时间；同样，若使用不同引物，按所用引物的具体序列调整退火温度。
c. 将PCR产物在琼脂糖凝胶（0.8%）上电泳以验证产物长度。注意：在本方案中，PCR产物通常不经纯化直接使用，每次转化加入固定体积（约25 μL）的扩增反应液，而非逐个调整DNA量。这相当于每反应50–200 ng PCR产物。
【数据】构建体：Mat-a与Mat-α两种；引物：HO_integration_F与HO_integration_R（10 μM，各1 μL）；模板：质粒DNA 5 ng；预混液：Kapa HotStart HiFi 2× master mix 25 μL；反应总体积：50 μL；PCR循环：98°C 30 s初始变性，98°C 10 s、62°C 20 s、72°C 8 min共30循环，72°C 15 min终延伸，4°C保持；凝胶浓度：0.8%琼脂糖；每转化加入PCR体积：约25 μL；每反应DNA量：50–200 ng；反应配置：每种构建体每2株菌1个PCR反应
3. 制备化学感受态酵母细胞。
a. 取各培养物10 mL（总计约1×10⁸细胞），3,200 × g离心5 min。
b. 加入10 mL ddH₂O重悬细胞以洗涤。
c. 离心（3,200 × g，5 min），弃上清。
d. 再用1 mL ddH₂O洗涤并重悬细胞。
e. 3,200 × g离心5 min，彻底弃上清。
f. 用60 μL ddH₂O重悬细胞。
【数据】培养体积：10 mL（约1×10⁸细胞）；离心条件：3,200 × g、5 min（共3次）；洗涤液：ddH₂O 10 mL后1 mL；重悬体积：60 μL ddH₂O
4. 用Mat-a和Mat-α构建体转化细胞。
a. 准备两块U形96孔板用于转化：一块用于Mat-a构建体，一块用于Mat-α构建体。
b. 将每株菌30 μL转入两块板中对应的孔（如菌株A1转入两块板的A1孔）。
c. 向Mat-a板的每孔加入25 μL Mat-a构建体，向Mat-α板的每孔加入25 μL Mat-α构建体。
i. 阴性对照培养物加入25 μL ddH₂O（代替PCR产物）。
d. 向每孔加入120 μL转化混合液。
i. 使用多通道移液器时，提前安排枪头盒，每隔一列填充、中间留空一列。
e. 42°C静置孵育40 min。
【数据】板型：U形96孔板2块；菌液体积：30 μL/孔；构建体体积：25 μL/孔；阴性对照：25 μL ddH₂O；转化混合液：120 μL/孔；热激条件：42°C、40 min、不振荡
#### 转化子回收与二倍体转化子筛选
耗时：2–3天
本步骤筛选成功将Mat-a或Mat-α构建体整合进基因组的二倍体细胞。应紧接上述步骤4之后进行（图2C）。
5. 回收转化子并进行抗生素筛选。
a. 3,200 × g离心板3 min，去除上清。
b. 每孔加入150 μL YPD（不要重悬），30°C孵育3 h进行回收。
i. 15 min后重悬培养物，继续振荡孵育。
c. 从每孔取120 μL涂布到补充相应抗生素的YPD琼脂平板上（如Mat-a构建体用潮霉素，Mat-α构建体用诺尔丝菌素）（图3B）。注意：平板应按步骤1e所给菌株命名标注。
d. 平板在30°C孵育2–3天，直至单菌落清晰可见。
i. 确认涂布阴性对照转化反应的平板无 colonies。暂停点：带单菌落的平板可在4°C保存最长一周。
【数据】离心条件：3,200 × g、3 min；回收液：YPD 150 μL；回收条件：30°C、3 h（15 min后重悬）；涂布体积：120 μL；抗生素：潮霉素（Mat-a）、诺尔丝菌素（Mat-α）；筛选平板培养：30°C、2–3天；保存条件：4°C最长1周
#### 所选二倍体转化子的验证
耗时：2天
本步骤对候选二倍体转化子筛查两个特征：在构建体特异性抗生素上生长（表明获得整合盒）和表达相应荧光报告（表明存在预期构建体）。两项标准均通过的菌落保留为二倍体转化子并进入产孢（图2D）。自此，每个亲本菌株由两个独立的转化子谱系代表：一个携带Mat-a构建体，一个携带Mat-α构建体，应作为独立的菌株集处理。若最初使用的是单倍体菌株，则跳过本步骤及产孢步骤，直接进入"单倍体菌株验证"步骤（步骤12）。
6. 准备用于验证的菌落。注意：在液体培养、琼脂……（原文此处截断）
【数据】原文未详述（节选于步骤6处截断）
研究结果
预期结果
本方案成功实施后，可从天然二倍体酿酒酵母分离株衍生出条形码标记的Mat-a和Mat-α单倍体菌株。每个单倍体在HO位点携带整合构建体，包含抗生素抗性标记、组成型荧光报告和唯一DNA条形码。经产孢、筛选和验证后，可从部分起始二倍体菌株获得可交配的单倍体衍生物。转化率、产孢效率和回收率因菌株背景和构建体而异。
在本工作流的实施中，该方案在四轮独立实验中应用，起始于约200株二倍体菌株。经转化、产孢和验证步骤后，共回收获得90株验证通过的Mat-a菌株和50株验证通过的Mat-α菌株。因此，当处理遗传多样的天然分离株时，使用者应预期菌株回收是不完全的且依赖于构建体。
验证通过的菌株通过以下方式确认：在相应抗生素上生长、荧光筛选，以及三次靶向PCR扩增，分别验证条形码区域、HO整合位点和MAT位点。所得单倍体菌株集合随后可用于混合交配实验。经混合交配和Cre诱导后，条形码融合将每个二倍体后代中的亲本条形码连接起来，从而可通过测序融合条形码对进行基因型鉴定。对混合群体的测序通常产生条形码计数表，可量化大规模天然分离株集合中的菌株丰度、交配结果或相对适合度，如Strauss等所做。
【数据】起始菌株：约200株二倍体；实验轮次：4轮独立实施；回收Mat-a验证菌株：90株；回收Mat-α验证菌株：50株；验证方法：抗生素生长、荧光筛选、3次靶向PCR（条形码区、HO整合位点、MAT位点）；测序产出：条形码计数表
讨论与解读
本方案的价值在于把"天然分离株—条形码单倍体—混合交配—测序计数"串成一条可追溯的高通量流水线。原文明确提示两个现实约束：其一，回收率因菌株背景和构建体而异，约200株二倍体起始仅获得90株Mat-a与50株Mat-α验证菌株，说明天然遗传多样性会显著影响转化与产孢效率；其二，流程在96孔板、琼脂选择平板、琼脂patch平板与24孔板之间多次切换，作者用一致的定位映射与编号方案来防止样本混淆，这是手动高通量操作中容易被低估的设计要点。原文未详述各菌株背景的具体转化率差异及失败菌株的归因分析。
编译者解读：从合成生物学应用看，该流程的亮点是把条形码融合与Cre诱导结合，使混合交配后的二倍体后代可通过一次测序读出亲本配对关系，适合大规模天然变异体的适合度扫描。局限在于依赖HO位点单拷贝整合与双构建体分步转化，回收率受菌株背景制约，且流程步骤繁多、对操作一致性要求高；若要与自动化液体处理平台对接，板式切换与定位映射规则需进一步标准化。
参考来源
期刊：STAR Protocols（2026）
DOI：10.1016/j.xpro.2026.104905
DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104905