来源：Trehalose biosynthesis mediated by PeTPS2 alleviates postharvest senescence of Pleurotus eryngii by maintaining cell wall structural homeostasis（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
杏鲍菇采后品质劣变快，低温贮藏虽能延缓衰老，却会引发冷胁迫。本研究从海藻糖代谢切入，鉴定出关键响应基因PeTPS2——一个兼具TPS与TPP双结构域的双功能酶。过表达PeTPS2使海藻糖含量提升近一倍，几丁质和β-1,3-葡聚糖含量同步上升，菌株对细胞壁胁迫和低温的耐受性显著增强。外源10 mM海藻糖处理则有效延缓了杏鲍菇采后褐变、失水与软化。研究为食用菌保鲜提供了代谢导向的新策略。
研究背景
杏鲍菇质地厚实、风味良好，富含优质蛋白、膳食纤维、B族维生素和必需矿物质，是广泛消费的食用菌。但其采后品质下降迅速，成为产业难题。采收后呼吸与蒸腾作用增强，导致失水、酶促褐变、组织软化和微生物腐败，货架期明显缩短。
低温贮藏（0–4°C）是常用手段，但杏鲍菇在长期低温下仍会遭受冷胁迫，表现为褐变、组织韧化、软化和风味损失。其中菌柄韧化是杏鲍菇区别于双孢蘑菇等食用菌的显著特征，与细胞壁组分改变和木质素沉积密切相关。生理层面，低温首先触发膜脂相变与过氧化，引起电解质泄漏和丙二醛大量积累。
海藻糖作为应激响应代谢物，在真菌、植物和昆虫中可稳定蛋白质与生物膜、防止分子聚集。然而，海藻糖代谢在杏鲍菇采后冷胁迫中的调控机制尚不清楚。本研究旨在鉴定海藻糖合成关键基因，通过过表达与外源处理两条路径，解析海藻糖缓解采后衰老的细胞壁相关机制。
研究方法
2.1 菌株材料
杏鲍菇菌株GIM5.344购自广东省微生物研究所，保存于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。载体pBHg-BCA1由福建农林大学微生物研究中心提供。遗传操作中，大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，培养于LB培养基（含50 mg L⁻¹卡那霉素）；根癌农杆菌GV3101用于杏鲍菇转化，培养于含50 mg L⁻¹卡那霉素和20 mg L⁻¹利福平的LB培养基。
【数据】菌株：P. eryngii GIM5.344、E. coli DH5α、A. tumefaciens GV3101；抗生素浓度：卡那霉素50 mg L⁻¹、利福平20 mg L⁻¹；培养基：PDA、LB
2.2 海藻糖含量测定
取500 mg菌丝体或子实体粉末，与5 mL 80%乙醇混合，于60 °C、20 kHz条件下超声提取1 h，每20 min间歇振荡一次。离心后收集上清，真空浓缩至干。残渣溶于600 μL双蒸水。取40 μL样品溶液稀释5–10倍，经0.22 μm水相膜过滤后HPLC分析。分离使用ZORBAX Carbohydrate色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm），流动相为70%乙腈，流速1.0 mL/min。进样量20 μL，示差折光检测器检测。海藻糖采用外标法定量：配制系列不同浓度海藻糖标准溶液，过滤后于相同色谱条件下分析，以峰面积对标准浓度作图建立校准曲线。
【数据】样品量：500 mg；提取液：5 mL 80%乙醇；超声温度：60 °C；频率：20 kHz；时间：1 h；复溶体积：600 μL；稀释倍数：5–10倍；滤膜孔径：0.22 μm；色谱柱：ZORBAX Carbohydrate（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流动相：70%乙腈；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL
2.3 序列分析与克隆
杏鲍菇海藻糖代谢基因序列从Joint Genome Institute（JGI）数据库检索。杏鲍菇、肺形侧耳、灰树花和酿酒酵母（NCBI数据库检索）的TPS家族蛋白序列用ClustalW进行多序列比对。随后用MEGA（11.0版）以最大似然法（ML）构建系统发育树，采用Poisson模型/Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型，1000次bootstrap重复。PeTPSs的保守蛋白结构域用InterPro在线工具（InterProScan，https://www.ebi.ac.uk/interpro/）鉴定，并与NCBI保守结构域数据库（CDD，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）交叉比对。以杏鲍菇cDNA为模板扩增PeTPS2编码序列，引物列于表S1。保守结构域和序列特征用SMART在线生物信息学工具预测。
【数据】数据库：JGI、NCBI、InterPro、CDD；软件：ClustalW、MEGA 11.0、SMART；模型：Poisson/JTT；bootstrap：1000次；模板：杏鲍菇cDNA；引物：见表S1
2.4 质粒构建与真菌转化
PeTPS2过表达载体基于改造的双元载体pBHg-BCA1构建，该载体含甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gpd）启动子，是担子菌转化系统中广泛使用的强组成型驱动元件。将PeTPS2全长编码序列插入pBHg-BCA1载体，随后通过PEG介导转化导入杏鲍菇菌株GIM5.344。转化子在含30 mg L⁻¹和60 mg L⁻¹潮霉素B的再生培养基上经多轮筛选。通过PCR扩增含潮霉素抗性基因和PeTPS2编码序列的嵌合片段，确认构建体成功整合。质粒构建和转化子验证所用引物列于表S1。过表达效率依据转化子中PeTPS2基因的转录水平评估。
【数据】载体：pBHg-BCA1；启动子：gpd；转化方法：PEG介导；潮霉素B筛选浓度：30 mg L⁻¹和60 mg L⁻¹；验证方法：PCR；引物：见表S1
2.5 非生物胁迫处理
为评估细胞壁完整性，使用刚果红（CR，干扰β-1,3-葡聚糖组装）和卡尔科弗卢白（CFW，结合几丁质并破坏微纤丝），检验PeTPS2过表达是否赋予增强的细胞壁胁迫抗性。WT和PeTPS2过表达菌株培养于含1 mg/mL CR或300 μg/mL CFW的PDA培养基，25 °C培养7天，评估细胞壁胁迫下的生长表现。冷胁迫处理：菌株先在PDA培养基上25 °C培养3天，再转至4 °C培养5天。通过测量菌落直径监测菌丝生长。每个菌落用数显游标卡尺测量两条垂直直径，每次测量减去原始接种块直径，最终菌落直径取平均值。
【数据】CR浓度：1 mg/mL；CFW浓度：300 μg/mL；细胞壁胁迫培养温度：25 °C；时间：7天；冷胁迫：25 °C预培养3天→4 °C处理5天；测量工具：数显游标卡尺
2.6 蘑菇处理
成熟杏鲍菇子实体（70–80%成熟度）由韶关星威生物科技有限公司（广东，中国）提供，立即运至实验室。预实验确定最佳海藻糖处理浓度。选取大小外观均匀、无可见机械损伤的蘑菇，随机分组。样品分别浸入5、10、20、50、100和200 mM海藻糖溶液各5 min。处理后轻轻去除表面残留液。对照样品在相同条件下浸入无菌水5 min。处理后所有样品密封于聚乙烯袋，4 °C、相对湿度90–95%贮藏12天。贮藏0、3、6、9、12天随机采集6个生物学重复。采集后立即液氮速冻，−80 °C保存待分析。
【数据】成熟度：70–80%；海藻糖浓度梯度：5、10、20、50、100、200 mM；浸渍时间：5 min；贮藏温度：4 °C；相对湿度：90–95%；贮藏时间：12天；采样时间点：0、3、6、9、12天；生物学重复：6个；保存温度：−80 °C
2.7 色泽（L*、ΔE）、褐变指数和硬度测定
色泽参数（L、a、b）用色差计（CR-400，Konica Minolta Sensing Inc.，日本）测定。褐变指数（BI）和总色差（ΔE）按Oms-Oliu等（2008）方法计算。BI = 100 × (X−0.31/0.17)，其中X = (a+1.75 L) / (5.645 L+ a−3.012 b)。ΔE = [ΔL² + Δa² + Δb²]^1/2，其中ΔL=L0−Lt，Δa=a0−at，Δb=b0−bt（t代表贮藏时间点：1、2、3、4、5，对应测量天数）。L值表示亮度，a表示红绿 chromaticity，b*表示黄蓝 chromaticity。蘑菇硬度用TA.XT Plus质构仪（Stable Micro Systems，Surrey，英国）按Wang等（2019）压缩法测定。硬度由力-时间曲线获得，以牛顿（N）表示。
【数据】仪器：CR-400色差计、TA.XT Plus质构仪；参数：L、a、b、BI、ΔE；硬度单位：N；计算式：BI = 100 × (X−0.31/0.17)；ΔE = [ΔL² + Δa² + Δb²]^1/2
2.8 失重率、电解质泄漏率和丙二醛（MDA）含量测定
贮藏期间每3天测定失重，以相对于初始重量的减少百分比表示。电解质泄漏按Li等（2016）方法测定：取2 g切成均匀块的蘑菇组织，浸入25 mL无菌水，25 °C孵育30 min，记录初始电导率（P0）。随后水浴煮沸30 min释放总电解质，测定最终电导率（P1）。电解质泄漏率按公式(P0/P1) × 100%计算。MDA测定：样品（2.0 g）在5%（w/v）三氯乙酸（TCA）中匀浆，离心后上清与0.67%（w/v）TCA煮沸反应30 min。于450、532和600 nm测定吸光度，结果以mmol·kg⁻¹表示。
【数据】失重测定间隔：3天；组织量：2 g；浸泡体积：25 mL无菌水；孵育温度：25 °C；时间：30 min；煮沸时间：30 min；TCA浓度：5%（w/v）匀浆、0.67%（w/v）反应；检测波长：450、532、600 nm；MDA单位：mmol·kg⁻¹
2.9 还原糖、总糖和总可溶性多糖含量分析
还原糖和总糖含量采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，以葡萄糖为标准品。
【数据】方法：DNS法；标准品：葡萄糖；原文节选至此截止，后续步骤原文未详述
研究结果
3.1 采后贮藏期间海藻糖及基因表达变化
海藻糖作为重要应激响应代谢物，在非生物胁迫下常被诱导积累。与此一致，本结果显示采后低温贮藏触发了杏鲍菇显著的海藻糖代谢响应。如图1A所示，子实体中海藻糖含量呈先积累后逐渐下降的特征趋势。贮藏早期（0–9天）海藻糖水平显著上升，第9天达最大值，较第0天高约70.46%。此后海藻糖含量逐渐下降，至第12天回落至接近初始水平。海藻糖积累的变化与海藻糖生物合成关键基因的转录调控密切相关。qRT-PCR分析显示，海藻糖-6-磷酸合成酶基因PeTPS1和PeTPS2在冷藏期间表达显著诱导（图1B）。其中PeTPS2在前6天内快速响应，第6天表达达峰，较初始水平增加约2.58倍。PeTPS1表达模式相似，但整个贮藏期转录丰度略低于PeTPS2。两基因表达谱与海藻糖积累阶段高度一致，提示低温胁迫激活了杏鲍菇内源海藻糖生物合成。相反，PeTPS3表达在冷暴露后立即被强烈抑制，整个贮藏期维持低水平。同时，海藻糖降解与代谢基因转录在冷藏期间显著下调。海藻糖磷酸化酶（PeTreP）表达在第3天大幅下降并持续受抑。PeNTH1和PeNTH2转录随时间逐步下降，第12天降至最低。综上，低温贮藏通过协同激活特定生物合成基因（尤其是PeTPS1和PeTPS2）并抑制海藻糖降解途径，触发内源海藻糖积累。
【数据】海藻糖峰值：第9天，较第0天高70.46%；PeTPS2表达峰值：第6天，较初始增加2.58倍；PeTPS1表达略低于PeTPS2；PeTPS3：冷暴露后立即抑制并维持低水平；PeTreP：第3天大幅下降；PeNTH1/PeNTH2：第12天降至最低；贮藏时间：0–12天
3.2 PeTPS蛋白的系统发育与保守结构域分析
为阐明PeTPS蛋白的进化关系与结构特征，构建了包含杏鲍菇、肺形侧耳、灰树花和酿酒酵母TPS序列的系统发育树，并通过InterPro进行结构域架构分析（图S1）。系统发育分类将TPS蛋白归为两大分支。Class I包括PeTPS1、PpTPS1、GfTPS1和典型酵母合成酶ScTPS1。与InterPro结构域注释一致，该分支所有成员均含单个TPS结构域（IPR001830或IPR012766）。Class II包括PeTPS2和PeTPS3。PeTPS2与GfTPS2和PpTPS2进化亲缘关系近，而PeTPS3与ScTPS2和GfTPS3形成亚分支。InterPro预测证实Class II成员含双分TPS-TPP结构域架构（IPR001830、IPR003337和IPR003332）。尽管杏鲍菇中鉴定到多个TPS基因，PeTPS2在低温胁迫下转录诱导最显著，暗示其在冷介导海藻糖积累中的关键作用。因此选取PeTPS2进行进一步功能表征。PeTPS2全长CDS为2886 bp，编码961个氨基酸蛋白（107.54 kDa）。结构分析证实PeTPS2含N端糖基转移酶家族20结构域（TPS）和C端海藻糖-磷酸酶结构域（TPP）（图S2A）。机制上，TPS结构域（α,α-海藻糖-磷酸合成酶，EC 2.4.1.15）催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成海藻糖-6-磷酸（T6P），而TPP结构域（海藻糖-6-磷酸酶，EC 3.1.3.12）介导T6P后续去磷酸化生成游离海藻糖。双功能结构域的存在提示PeTPS2是杏鲍菇胁迫诱导海藻糖生物合成所必需的。
【数据】PeTPS2 CDS长度：2886 bp；编码蛋白：961个氨基酸；分子量：107.54 kDa；结构域：N端TPS（IPR001830等）、C端TPP（IPR003337、IPR003332）；酶EC号：TPS EC 2.4.1.15、TPP EC 3.1.3.12；系统发育bootstrap：1000次
3.3 PeTPS2过表达增强胁迫下菌丝生长与细胞壁完整性
为进一步验证PeTPS2生物学功能，构建了过表达菌株。选取PeTPS2表达分别增加4.04倍和3.96倍的两个转化子用于后续实验，命名为OEPeTPS2–15和OEPeTPS2–16（图S2B和C）。PeTPS2过表达导致海藻糖积累显著增加。与WT相比，OEPeTPS2–15和OEPeTPS2–16海藻糖含量分别增加92.59%和96.62%（图2A），表明PeTPS2过表达显著增强海藻糖生物合成。鉴于海藻糖是抵御环境胁迫的重要保护剂，进一步评估了OEPeTPS2菌株在非生物胁迫和细胞壁破坏胁迫下的生长表现。如图2B和C所示，PeTPS2过表达菌株基础菌丝生长速率显著高于WT。在刚果红（CR）和卡尔科弗卢白（CFW）诱导的细胞壁胁迫下，OEPeTPS2–15和OEPeTPS2–16生长速率仍显著高于WT，分别增加67.28%和30.51%。这些结果提示PeTPS2过表达部分缓解了细胞壁完整性受损引起的生长抑制。低温胁迫下，过表达菌株生长速率较WT高19.63%，表明PeTPS2也参与冷胁迫适应响应。基于对细胞壁靶向剂的耐受性，推测PeTPS2介导的海藻糖代谢激活直接改变细胞壁组成。为验证此假设，进一步分析细胞壁组成，确定海藻糖积累是否促进结构强化。与增强的抗逆性一致，过表达菌株几丁质和β-1,3-葡聚糖含量均显著高于WT（图2D和E）。OEPeTPS2–15和OEPeTPS2–16中几丁质含量分别增加92.14%和78.46%，β-1,3-葡聚糖含量分别增加104.07%和77.66%。由于几丁质和β-1,3-葡聚糖构成真菌细胞壁的基础骨架结构，其水平升高为更坚硬稳定的细胞壁基质提供了具体生化基础，支撑了观察到的CR、CFW和冷胁迫抗性。
【数据】转化子表达倍数：OEPeTPS2–15为4.04倍、OEPeTPS2–16为3.96倍；海藻糖增幅：92.59%、96.62%；CR/CFW胁迫下生长速率增幅：67.28%、30.51%；低温生长速率增幅：19.63%；几丁质增幅：92.14%、78.46%；β-1,3-葡聚糖增幅：104.07%、77.66%；培养条件：PDA，25 °C，7天（细胞壁胁迫）；4 °C 5天（冷胁迫）
3.4 海藻糖处理改善采后杏鲍菇品质
为评估海藻糖对采后杏鲍菇的保鲜效果，用不同浓度海藻糖溶液预处理后于4 °C贮藏。视觉评估显示，对照组在贮藏前6天维持可接受的外观品质（图3A）。至第9天，对照组蘑菇出现明显脱水、表面皱缩和局部褐变。第12天，子实体整体严重褐变，尤其切口基部区域出现明显萎缩。相比之下，海藻糖处理组整体品质显著改善，以10 mM和20 mM效果最佳。整个贮藏期，这些处理组蘑菇脱水皱缩轻微，褐变症状大幅减轻。其他处理组至第12天菌褶和切面出现局部褐变。褐变和硬度的定量分析进一步证实了……
【数据】海藻糖处理浓度：5、10、20、50、100、200 mM；最佳浓度：10 mM和20 mM；贮藏温度：4 °C；贮藏时间：12天；对照劣变时间点：第9天脱水皱缩、第12天严重褐变；原文节选至此截止，定量数据原文未详述
3.5 海藻糖处理维持采后杏鲍菇营养品质
（原文节选未包含此节文字，图4对应内容原文未详述）
【数据】原文未详述
3.6 采后贮藏期间微观与超微结构变化
（原文节选未包含此节文字，图5对应内容原文未详述）
【数据】原文未详述
3.7 外源海藻糖对细胞壁组分及降解酶活性的影响
（原文节选未包含此节文字，图6对应内容原文未详述）
【数据】原文未详述
3.8 海藻糖合成与细胞壁相关基因转录谱
（原文节选未包含此节文字，图7对应内容原文未详述）
【数据】原文未详述
讨论与解读
低温贮藏广泛用于延长货架期，但同时也施加冷胁迫，诱发一系列生理代谢响应。本研究中，冷藏期间海藻糖含量显著升高、海藻糖合成基因显著诱导，这与海藻糖作为应激响应代谢物在广泛生物中的既定角色一致。在真菌、植物和昆虫中，海藻糖可稳定蛋白质和生物膜，防止脱水胁迫下的分子聚集。海藻糖是公认的胁迫保护性代谢物，在不利条件下稳定生物分子和细胞。本研究结果提示，内源海藻糖生物合成构成杏鲍菇对采后冷胁迫的重要适应响应。内源海藻糖积累可能作为多重保护策略：既作为结构稳定剂维持膜和细胞壁完整性，又作为潜在碳/能量缓冲，在不利冷藏条件下提供细胞保护。此外，Class I TPS被广泛认为是海藻糖代谢的限速酶，在……中起关键作用（原文节选至此截止）。
编译者解读：该研究以PeTPS2为枢纽，把海藻糖代谢与细胞壁结构稳态联系起来，思路清晰：先找冷响应基因，再做过表达功能验证，最后用外源处理落地保鲜。双功能TPS-TPP结构域的鉴定为后续酶工程改造提供了明确靶点。局限在于过表达株仅在菌丝水平验证，子实体阶段的遗传效应尚未呈现；外源处理浓度窗口较窄（10–20 mM），工业化浸泡的成本与残留问题也需评估。总体而言，代谢导向的保鲜策略在食用菌中值得推进。
参考来源
期刊：Postharvest Biology and Technology, 2027
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114775
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114775