来源：Genome-wide transcriptomic insights into temperature-driven suppression of violacein biosynthesis in Massilia atriviolacea SODT（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
从合肥土壤中分离的新种细菌Massilia atriviolacea SODT能产出深紫色素。经HPLC、NMR与MS鉴定，主产物为紫色杆菌素（violacein），另有少量脱氧紫色杆菌素。该菌株表现出独特的温度调控模式：33 °C下完全不产色素，转回28 °C后色素合成可完全恢复。转录组与qRT-PCR证实，高温并非切断色氨酸供给，而是直接压低vioABCDE操纵子的转录水平。纯化色素对HeLa细胞IC₅₀为1.92 µg/mL。
研究背景
微生物色素具备多样的生理活性。紫色杆菌素是一种深紫色素，已知可由Chromobacterium violaceum、Alteromonas luteoviolacea等多种细菌产生。它对多种菌株显示抗菌活性——包括枯草芽孢杆菌这类常见环境菌，以及结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等致病菌；此外还有抗真菌、抗病毒、抗利什曼原虫、抗纳米鞭毛虫及抗氧化活性。在细胞毒性方面，紫色杆菌素对HL60细胞、人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、Ehrlich腹水肿瘤细胞等肿瘤细胞系均有作用。它还可用于棉纤维染色。这些性质使紫色杆菌素在生物技术与纺织染色领域颇受关注。除已被充分记录的生物活性外，紫色杆菌素还可作为色素型报告分子用于环境毒素检测。本研究以新种M. atriviolacea SODT为对象，从其色素鉴定入手，结合基因组与转录组，解析温度抑制紫色杆菌素合成的分子机制。
研究方法
2.1 菌株、细胞系与培养基
Massilia atriviolacea SODT菌落呈紫黑色，为本课题组前期研究鉴定的新种。所有实验的培养物均通过接种TB培养基（含1%胰蛋白胨，pH 7.2–7.4）制备。人宫颈癌HeLa细胞由安徽农业大学细胞库提供。细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中、5% CO₂加湿气氛、37 ℃条件下培养。
【数据】培养基：TB（1%胰蛋白胨，pH 7.2–7.4）；细胞培养基：RPMI 1640 + 10% FBS；CO₂浓度：5%；温度：37 ℃
2.2 紫色素的提取与分析
紫色素采用超声法以乙醇提取。紫色素提取物经TLC纯化。最终，色素提取物通过薄层色谱（TLC）与高效液相色谱（HPLC）联合分析。紫色素的定量按此前报道的方法进行。
【数据】提取溶剂：乙醇；提取方式：超声；纯化方法：TLC；定量方法：原文未详述具体参数
2.3 紫色素化学结构鉴定
纯化的蓝色组分I用分光光度计（DU-640，Beckman）、1H NMR（二甲基亚砜DMSO，600 MHz，Agilent）、13C NMR（DMSO，600 MHz，Agilent）、MS（QE FOCUS，Thermo Fisher）及HPLC（Waters-600E，Waters，美国）分析。HPLC分析采用C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，Kromat-bond Universil），25 ℃，70%甲醇以1 mL/min流速洗脱。柱流出液在576 nm检测。
【数据】色谱柱：C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：70%甲醇；流速：1 mL/min；检测波长：576 nm；NMR场强：600 MHz
2.4 培养温度对紫色素产量的影响
培养温度对紫色素产量的影响通过两组实验考察。第一组实验在培养期间维持恒定温度（10、20、28、33、35、37 ℃）。第二组实验为温度切换：细菌先在33 ℃培养3–5天，随后转至28 ℃再培养3–5天。
【数据】恒温组温度：10、20、28、33、35、37 ℃；切换组：33 ℃培养3–5天→28 ℃培养3–5天
2.5 基因组测序、组装与注释
PacBio RSII平台的文库制备按此前描述的方法进行。在166倍基因组覆盖度下，过滤后的subreads（3567,261,541 bp）经分层基因组组装流程（HGAP 3.0）从头组装。编码DNA序列（CDS）预测使用Glimmer 3.02，rRNA与tRNA基因分别通过Barrnap 0.4.2与tRNA scan-SE v1.3.1鉴定。功能基因注释按Aziz的方法通过BLASTP进行，目标数据库包括非冗余GenBank蛋白库、SwissProt、COG与KEGG；另用在线RAST服务器补充注释。基因组环形图用Circos 0.64生成。M. atriviolacea SODT全基因组序列已存入GenBank，登录号CP051166。
【数据】测序平台：PacBio RSII；覆盖度：166×；subreads总量：3567,261,541 bp；组装软件：HGAP 3.0；CDS预测：Glimmer 3.02；登录号：CP051166
2.6 转录组测序与生物信息学分析
培养SODT菌株，收集6个样品用于RNA提取，包括3个L组样品（28 ℃培养12 h）与3个H组样品（33 ℃培养12 h）。细胞于4 ℃、8000 rpm离心10 min收集。RNA用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取，残留基因组DNA用DNase I（Takara）去除。cDNA文库构建后使用Illumina HiSeq 2000平台测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始reads用SeqPrep与Sickle修剪，去除接头、模糊碱基（>10% N）及低质量碱基（Q < 20）。干净reads用Bowtie 2比对到参考基因组。基因功能用BLAST（blastx/blastp 2.2.24 +）比对KEGG数据库注释。差异表达基因（DEGs）采用RPKM法鉴定，随后进行多重假设检验与错误发现率（FDR）控制以校正p值。DEG判定标准为两条：FDR值 ≤ 0.05，且log₂倍数变化绝对值（|log₂FC|）≥ 1。基因表达谱的差异分析用R包EdgeR完成。本研究的原始RNA测序数据已存入GenBank数据库，登录号PRJNA768387。
【数据】分组：L组28 ℃/12 h，H组33 ℃/12 h，各3个重复；离心：8000 rpm、10 min、4 ℃；质控：Q < 20剔除、N > 10%剔除；DEG标准：FDR ≤ 0.05且|log₂FC| ≥ 1；登录号：PRJNA768387
2.7 qRT-PCR分析
对M. atriviolacea SODT中高温下表达存在差异的vioABCDE操纵子及MA_4174进行实时定量PCR（qRT-PCR）分析，以验证转录组数据的准确性。细菌分别在28 ℃与33 ℃的TB中培养12、18、24 h后收获。RNA提取与基因组DNA去除按2.6节所述进行。第一链cDNA用PrimeScript RT Reagent Kit（Takara，日本）合成。实时定量PCR在ABI 7500系统（Applied Biosystems）上按厂家说明用SYBR Green进行。相对基因表达用2–ΔΔCt法计算，以16S rRNA基因为内参。每个基因的检测至少重复三次，每次重复设三个技术重复。引物序列见补充表S1。
【数据】取样时间点：12、18、24 h；温度：28 ℃与33 ℃；内参基因：16S rRNA；定量方法：2–ΔΔCt；生物学重复：≥3次；技术重复：3次
2.8 胞内游离氨基酸含量测定
胞内游离氨基酸含量测定按已有方法稍作修改进行：首先，SODT菌株分别在28 ℃与33 ℃培养，于发酵12 h与36 h收获。各时间点细菌细胞经10,000 ×g离心10 min收集，随后用5 mL去离子水快速洗涤三次以去除胞外杂质。洗涤后细胞冻干；准确称取10 mg冻干样品，与1 mL 4%磺基水杨酸溶液混合。用小美一体式超声破碎仪在4 ℃超声提取（参数：25 KHZ频率，60%功率，开3 s/关2.6 s循环）。提取后加入500 mmol/L NaOH调pH至7.0，12,000 ×g离心20 min收集上清。上清中氨基酸含量用HITACHI I-8900全自动氨基酸分析仪分析（检测条件：离子交换色谱，茚三酮柱后衍生，检测波长570 nm/440 nm）。所有测定均设三个重复。
【数据】取样时间：12 h与36 h；离心：10,000 ×g、10 min；冻干样品量：10 mg；提取液：1 mL 4%磺基水杨酸；超声：25 KHZ、60%功率、3 s开/2.6 s关、4 ℃；pH：7.0；二次离心：12,000 ×g、20 min；检测波长：570 nm/440 nm
2.9 色氨酸补加对紫色杆菌素产量的影响
向高氏I号培养基中加入梯度浓度的L-色氨酸（0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、4.0、6.0 mM）。种子液（1% v/v接种量）接入补加培养基，在28 ℃与33 ℃、200 rpm培养3–4天。色素提取与定量按2.2节所述进行。
【数据】色氨酸浓度梯度：0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、4.0、6.0 mM；接种量：1% v/v；转速：200 rpm；温度：28 ℃与33 ℃；时间：3–4天
2.10 MTT法评估细胞毒性
纯化紫色素（蓝色组分I）对HeLa细胞的细胞毒性用MTT法评估，按此前描述稍作修改。简言之，HeLa细胞以2.0 × 10³个/孔接种于96孔板，在37 ℃、5% CO₂下用系列色素浓度（0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL）处理24 h。孵育后测定细胞活力，在490 nm测吸光度。IC₅₀值由剂量-反应曲线导出。所有实验设三个重复。
【数据】接种密度：2.0 × 10³个/孔；色素浓度：0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL；处理时间：24 h；温度：37 ℃；CO₂：5%；检测波长：490 nm
2.11 凋亡性细胞死亡分析
为探究蓝色组分I的抗癌机制，对HeLa细胞进行凋亡与线粒体膜电位（MMP，ΔΨₘ）检测。HeLa细胞接种于6孔板。
【数据】培养板：6孔板；其余参数原文未详述
研究结果
3.1 M. atriviolacea SODT所产紫色素的化学结构鉴定
SODT菌株是从土壤中分离筛选的Massilia新种。SODT菌落呈现罕见的紫黑色特征。这一独特的表型差异为研究其代谢产物提供了重要切入点。从M. atriviolacea SODT提取的蓝紫色素经TLC与HPLC分析。结果显示，该菌株的色素提取物在氯仿:甲醇（5:1）溶剂系统的SiO₂ TLC上产生两个斑点。两个斑点的Rf值分别为0.28与0.56（图1A-B）。后一组分蓝色更深，浓度显著高于前者（紫色）。色素提取物经HPLC分离为两个明显组分。第一峰鉴定为蓝色组分I，保留时间约7.13 min；第二峰鉴定为紫红色组分II，保留时间约11.61 min。两个色素组分的最大吸收波长分别测定为576.3与562.9 nm（图S1）。蓝色组分I的分子量经质谱（MS）测定为344.35（正离子模式）。蓝色组分I的1H NMR与13C NMR谱与紫色杆菌素比较（表1）。蓝色组分I的主要1H NMR与13C NMR信号归属与紫色杆菌素高度吻合（图S2-3）。组分II因浓度过低无法进行NMR分析。基于上述分析结果并参照此前发表的研究，M. atriviolacea SODT中的色素被鉴定为紫色杆菌素与脱氧紫色杆菌素。紫色杆菌素的化学结构见图1D。
【数据】TLC展开剂：氯仿:甲醇 = 5:1；Rf值：0.28与0.56；HPLC保留时间：7.13 min（组分I）与11.61 min（组分II）；最大吸收波长：576.3 nm与562.9 nm；分子量：344.35（正离子）
3.2 培养温度对紫色素产量的影响
细菌细胞在35 ℃以上无法生长。与28 ℃以下相比，SODT菌株在33 ℃培养时不产生任何色素（图2）。我们观察到，同一平板上的菌落转至28 ℃再培养3–5天后，重新变为紫黑色并恢复产色素。这表明温度可抑制SODT菌株紫色素的形成。然而，温度对M. atriviolacea SODT紫色素产量的影响此前知之甚少。
【数据】生长上限温度：>35 ℃不生长；33 ℃：不产色素；28 ℃以下：产色素；温度切换：33 ℃→28 ℃培养3–5天后恢复产色素
3.3 M. atriviolacea SODT的基因组特征
M. atriviolacea SODT基因组由一条7425,094 bp的环状染色体组成，G + C含量65.29 mol%（图3）。主要基因组特征见表2。基因预测显示总基因长度6706,992 bp。基因组含6495个CDS，其中5286个（80.1%）有推定功能注释。基因组中鉴定出14个rRNA操纵子与87个tRNA（表2与图3）。根据COGs数据库，5286个已鉴定基因被归入特定功能类别，包括170个翻译/核糖体功能基因、296个转录基因、224个复制/修复基因、273个细胞壁/膜生物发生基因、125个细胞运动基因、301个氨基酸转运与代谢基因（表S2）。此外，KEGG功能分类展示于图3。基因组分析显示M. atriviolacea SODT具有多种功能。尽管基因组尺寸相对较小，却预测出6495个CDS。M. atriviolacea SODT中与紫色杆菌素合成相关的通路包括星形孢菌素生物合成（KO 00404）与群体感应（KO 02024）。M. atriviolacea SODT中碳代谢与碳水化合物转运蛋白相关基因的存在，可能增强其碳转运能力并促进生长。基于COG功能分类，233个基因与碳水化合物转运及代谢相关。与其他细菌类似，M. atriviolacea SODT通过Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径或戊糖磷酸（PPP）途径利用糖类。EMP途径通常被认为是葡萄糖分解代谢的经典生化途径。与EMP途径相关的基因，包括葡萄糖-6-磷酸异构酶（MA_5553）与磷酸丙糖异构酶（MA_5082），在M. atriviolacea SODT基因组中检出。此外，M. atriviolacea SODT中PK途径的关键酶，包括磷酸酮醇酶家族蛋白（MA_4690），也已鉴定。在已鉴定的233个基因中，25个编码M. atriviolacea SODT中的转运蛋白，介导多种分子转运，包括氨基酸、ATP结合蛋白与ABC转运蛋白透性酶。这些转运蛋白包括磷酸转移酶系统（PTS；MA_1351、MA_3685、MA_3689、MA_4728）与ATP结合盒（MA_0726、MA_0994、MA_0995、MA_1074、MA_1964、MA_3098、MA_4589、MA_4710、MA_4712、MA_5410、MA_5977）转运系统。研究表明多种菌株能通过碳水化合物PTS将碳水化合物转运进细菌细胞。这些发现为M. atriviolacea SODT菌株在不含色氨酸的高氏I号培养基中高产紫色杆菌素的能力提供了额外证据。值得注意的是，基因组分析还鉴定出一个完整的紫色杆菌素生物合成基因簇（vioA–vioE）及相邻的MFS转运蛋白基因（MA_4174），它们是色素生产的关键。为评估该簇的序列新颖性，我们将vioA–vioE与MA_4174同参考菌株比对（表S3）。在Massilia属内，SODT的vioA–vioE与M. violaceinigra共享高核苷酸（81.97%–85.15%）与氨基酸（76.60%–84.51%）一致性，证实核心生物合成功能的保守性；而与non-Massilia菌株（如C. violaceum）的一致性降至72.22%–79.33%（核苷酸）与53.51%–75.79%（氨基酸），其中vioB查询覆盖度仅48%。值得注意的是，SODT中vio簇与MA_4174物理相邻（距vioE <2 kb），转录组数据证实MA_4174在33 ℃下与vioA–vioE基因显著共下调（表达降低≥4倍）。这些结果表明SODT中的vio簇代表一个属特异性、进化上分化的变体，具有温度响应型生物合物的功能特化。
【数据】染色体大小：7425,094 bp；G+C含量：65.29 mol%；基因总长：6706,992 bp；CDS数：6495；功能注释CDS：5286（80.1%）；rRNA操纵子：14；tRNA：87；碳水化合物转运/代谢基因：233；转运蛋白基因：25；与M. violaceinigra一致性：核苷酸81.97%–85.15%、氨基酸76.60%–84.51%；与C. violaceum一致性：核苷酸72.22%–79.33%、氨基酸53.51%–75.79%；vioB覆盖度：48%；MA_4174距vioE：<2 kb；33 ℃下MA_4174下调：≥4倍
3.4 M. atriviolacea SODT的转录组分析
为探究温度对紫色杆菌素生物合成的调控机制，对M. atriviolacea SODT在高温（33 ℃：H组）与常温（28 ℃：L组）下进行全基因组转录谱分析。采用RNA-seq量化基因表达谱并鉴定微生物代谢的关键分子机制。6个测序样品共产生超过21 GB干净数据，Q30准确率大于96%。与L组比较，共鉴定出1997个DEGs，其中804个基因转录水平升高、1193个降低（图4）。这些DEGs进一步用KEGG注释进行功能注释与富集分析（图5）。随后用KEGG通路探究特定代谢通路在温度代谢调控中的潜在参与。前20条KEGG通路分析显示，显著富集于代谢通路、鞭毛组装（31个基因）、星形孢菌素生物合成（5个基因）、氮代谢（12个基因）、双组分系统（39个基因）与群体感应（22个基因）。具体而言，编码色氨酸2-单加氧酶（vioA，MA_4169）、聚酮合酶（vioB，MA_4170）与单加氧酶（vioC，MA_4171）的基因被发现主要负责紫色杆菌素的合成。
【数据】干净数据量：>21 GB；Q30：>96%；DEG总数：1997（上调804、下调1193）；鞭毛组装：31个基因；星形孢菌素生物合成：5个基因；氮代谢：12个基因；双组分系统：39个基因；群体感应：22个基因；关键基因：vioA（MA_4169）、vioB（MA_4170）、vioC（MA_4171）
3.5 温度对紫色杆菌素合成基因表达的影响
为验证转录组数据，用qRT-PCR检测vioABCDE操纵子与MA_4174在28 ℃与33 ℃下12、18、24 h的相对mRNA量。结果显示，高温下vioABCDE簇各基因及MA_4174的转录水平均显著降低，与RNA-seq数据一致（图6）。其中vioA在33 ℃下的下调最为明显。
【数据】检测时间点：12、18、24 h；温度：28 ℃与33 ℃；基因：vioABCDE操纵子、MA_4174；显著性水平：p < 0.05（）、p < 0.01（）、p < 0.001（）
3.6 色氨酸补加与胞内游离氨基酸
为检验高温抑制是否源于色氨酸供给不足，在高氏I号培养基中补加0–6.0 mM L-色氨酸，于28 ℃与33 ℃培养。补加色氨酸未能恢复33 ℃下的紫色杆菌素产量（图5C）。转录组数据显示，色氨酸生物合成基因（如trpE、trpG）在33 ℃下仅轻微受抑。胞内游离氨基酸测定进一步支持该结论。
【数据】色氨酸补加浓度：0–6.0 mM；温度：28 ℃与33 ℃；结果：33 ℃下补加色氨酸未恢复产量；trpE、trpG：仅轻微受抑
3.7 蓝色组分I对HeLa细胞的抗癌活性
纯化的蓝色组分I对HeLa细胞表现出强抗癌活性，IC₅₀ = 1.92 µg/mL（图7A）。该组分主要诱导线粒体膜电位功能障碍，并影响HeLa细胞内活性氧（ROS）的积累（图7B）。
【数据】IC₅₀：1.92 µg/mL；检测浓度：0、0.625、1.25、2.5、5.0、10 μg/mL（细胞活力）；ROS检测浓度：1.0 μg/mL起；细胞系：HeLa
讨论与解读
本研究确认M. atriviolacea SODT以紫色杆菌素为主要紫色素、脱氧紫色杆菌素为次要组分。HPLC、NMR与MS的结构鉴定提供了确凿证据——光谱数据与既往报道高度吻合，7.13 min的保留时间与576 nm的最大吸收波长也符合紫色杆菌素的典型特征。值得关注的是，Massilia属多数菌株产白色或黄色等浅色色素，SODT产紫色杆菌素在属内属独特特征，使其成为在新宿主中研究紫色杆菌素生物合成与调控的有价值材料。脱氧紫色杆菌素的存在虽浓度低，也与产紫色杆菌素菌株常合成相关衍生物的既往发现一致。
温度依赖调控是本研究的核心发现。33 ℃下色素合成被完全抑制，转回28 ℃后恢复，这种可逆模式有别于其他产紫色杆菌素菌株。转录组鉴定出1997个DEGs，vioABCDE操纵子强烈下调；而色氨酸生物合成基因仅轻微受抑，补加实验证实色氨酸供给并非限制因素。qRT-PCR与RNA-seq一致。基因组分析显示SODT拥有完整的vioA–vioE簇及相邻MFS转运蛋白基因MA_4174，后者在33 ℃下与vio簇共下调≥4倍，提示其可能参与温度响应调控。纯化紫色杆菌素对HeLa细胞IC₅₀为1.92 µg/mL，主要经线粒体膜电位功能障碍途径起效。
编译者解读：该研究把温度这个廉价、可逆的物理信号转化为紫色杆菌素产量的开关，工业发酵上可直接用于两阶段工艺——先高温长菌、后降温产色，避免诱导剂成本。局限在于调控节点尚未锁定：MA_4174只是相关性证据，未做敲除或回补验证；转录组仅取12 h单点，动态过程缺失。若后续用CRISPR确认MA_4174或上游双组分系统的因果作用，这套温度开关有望移植到其他底盘。
参考来源
期刊：Industrial Crops and Products, 2026
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124319
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124319