来源：Identification of a key glycosyltransferase and de novo biosynthesis of rare oleanane-type pseudoginsenoside RT1 in Saccharomyces cerevisiae（Chinese Herbal Medicines）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
伪人参皂苷RT1是竹节参中一种稀有的乌苏烷型（OA型）皂苷，天然丰度低、提取困难，制约了其开发应用。本研究以β-香树脂醇合酶PjbAS1/PjbAS2为诱饵基因开展共表达分析，从竹节参中锁定并功能鉴定了UDP-木糖基转移酶PjUGT67，证实其催化竹节参皂苷IVa木糖基化生成RT1；同时验证PjCSLM与PjC28UGT分别催化齐墩果酸→CE、CE→IVa，从而串联出OA→CE→IVa→RT1的完整糖基化路线。研究进一步在酿酒酵母中整合OA合成、逐步糖基化与UDP-木糖供给模块，构建工程菌株RT1-02，实现RT1从头合成，产量达17.34 mg/L。
研究背景
人参属植物广泛用于功能性食品、膳食补充剂和药材。人参皂苷是该属的主要活性成分，具有抗癌、免疫调节、抗痴呆、抗衰老和抗过敏等多种生理活性。这类化合物通常分为四环达玛烷型（DM型）和五环乌苏烷型（OA型）两大类。DM型人参皂苷的生物合成网络研究已取得显著进展，而OA型人参皂苷的生物合成途径相对研究不足。
在栽培人参属物种中，西洋参是功能性食品与膳食补充剂中消费量最大的药材之一，其皂苷谱以达玛烷型为主，主要成分如Rb1、Rc、Rd和Re，OA型皂苷一般为次要成分。竹节参则富含OA型人参皂苷，是阐明OA型人参皂苷生物合成途径的理想模式材料。然而，竹节参野生资源有限，加之RT1等稀有OA型皂苷天然含量低、提取效率不高，其应用受到限制。因此，解析RT1的糖基化步骤并通过微生物异源合成实现其生产，具有明确的现实需求。
研究方法
2.1 植物材料、试剂与菌株
竹节参样品于2021年8月采集自中国湖北省恩施土家族苗族自治州，由Zhengtao Wang教授鉴定。采集根茎、侧根、茎、叶四个组织，每个组织设三个独立生物学重复。所有样品保存于上海中医药大学中药研究所。酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C（MATa; his3Δ1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2）作为菌株构建的背景菌株。大肠杆菌Trans1-T1（CD501，TransGen Biotech，北京，中国）用于质粒构建与扩增。大肠杆菌BL21 (DE3) 用于PjUGTs的异源表达。根癌农杆菌GV3101用于本氏烟草浸润实验。所有引物（表S1）由Sangon Biotech（上海，中国）合成。酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、琼脂粉及其他化学品购自OXOID Ltd.（Thermo Fisher Scientific，Basingstoke，英国）。所有化学标准品均为分析参考标准级，纯度≥98%，购自Must Phytochemicals（四川，中国）。所有经密码子优化的异源基因（表S2），包括来自甘草的β-香树脂醇合酶（GgbAS，GenBank: Q9MB42.1）、来自蒺藜苜蓿的β-香树脂醇28-氧化酶/齐墩果酸合酶（MtOAS，GenBank: CBN88268.1）、来自蒺藜苜蓿的NADPH-细胞色素P450还原酶（MtCPR，GenBank: XP_003602898.1）、来自拟南芥的UDP-葡萄糖脱氢酶1（AtUGD1，GenBank: NP_173979.1）以及来自拟南芥的UDP-木糖合酶3（AtUXS3，GenBank: NP_001078768.1），均由Generay Biotech（上海，中国）合成。
【数据】采样时间：2021年8月；采样地点：湖北恩施；组织数：4（根茎、侧根、茎、叶）；生物学重复：每组织3个；标准品纯度：≥98%；酵母背景菌株：CEN.PK2-1C；表达宿主：E. coli BL21 (DE3)；浸润菌株：A. tumefaciens GV3101
2.2 基因共表达分析
为研究PjbAS与PjUGT基因之间的关系，使用base R stats包中的cor函数计算Pearson相关系数。在PjbAS与Non-Redundant（NR）数据库中注释为UGT的转录本之间进行共表达分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。相应相关性数据汇总于表S3。Pearson相关系数r ≥ 0.6的基因被判定为与PjbAS强相关，随后用于构建PjUGT基因共表达网络。共表达网络使用Cytoscape（版本3.10.3）可视化。r ≥ 0.6的阈值作为初步候选筛选的中等标准，最终优先级进一步受NR注释、系统发育位置和序列完整性约束。
【数据】相关系数阈值：r ≥ 0.6；统计工具：R base stats cor函数；网络可视化软件：Cytoscape 3.10.3；数据库：NR
2.3 系统发育分析
拟南芥UGT代表性氨基酸序列采集自"Arabidopsis Cytochrome P450, Cytochrome b5, P450 Reductase, β-Glucosidase, and Glycosyltransferase Site"（https://www.p450.kvl.dk/UGT.shtml）。候选氨基酸序列来自预测的竹节参UGT全长编码序列，纳入系统发育分析。蛋白序列比对使用MUSCLE程序完成，Neighbor-Joining树使用MEGAX程序构建，bootstrap值由10 000次重复计算得出。系统发育树的可视化与注释使用R包ggtree完成。
【数据】bootstrap重复次数：10 000；比对软件：MUSCLE；建树软件：MEGAX；可视化：R ggtree；方法：Neighbor-Joining
2.4 分子克隆、异源表达与蛋白纯化
竹节参根茎总RNA使用TranZolTM试剂盒（ER511，TransGen Biotech，北京，中国）提取，并用Prime Script™ IV 1st Strand cDNA Synthesis Mix（6215A，Takara Biomedical Technology，北京，中国）逆转录为cDNA。设计引物扩增PjUGTs全长cDNA，PCR使用Prime STAR Max Premix DNA Polymerase（R045Q，Takara Biomedical Technology，北京，中国）进行。纯化的PCR产物用Easy Pure PCR Purification kit（EP101，TransGen Biotech，北京，中国）制备，随后插入pCold™TF（trigger factor）冷休克表达载体和pHB-yellow fluorescent protein（YFP）植物表达载体。重组质粒转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞（CD501，TransGen Biotech，北京，中国）。测序验证后，重组质粒pCold-TF-PjUGT转化大肠杆菌BL21 (DE3)（TransGen Biotech，北京，中国）进行异源表达。
转化克隆接种于含5 g/L酵母提取物（LP0021B，OxoidTM，Basingstoke，英国）、10 g/L胰蛋白胨（LP0042B，OxoidTM，Basingstoke，英国）、10 g/L NaCl（10019318，Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.，上海，中国）和50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中，37 ℃振荡培养。当培养物A600达到0.6时，立即于冰水中冷却30 min。加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.5 mmol/L，培养物于15 ℃继续培养24 h。细胞经10 000 r/min离心5 min收获，重悬于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，ST774，Beyotime Biotech Inc，上海，中国），随后用高压均质机在600 bar下破碎。于4 ℃、12 000 r/min离心30 min去除细胞碎片，蛋白使用HisTrap HP His标签柱（17524801，Cytiva，美国）纯化。PjUGT以trigger factor标签表达，用含20–250 mmol/L咪唑的50 mL洗脱缓冲液洗脱。蛋白定量使用Enhanced BCA Protein Assay Kit（P0010S，Beyotime Biotechnology，上海，中国；图S1）进行。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；抗生素：50 μg/mL氨苄青霉素；诱导温度：37 ℃至A600=0.6；冰浴时间：30 min；IPTG浓度：0.5 mmol/L；诱导温度/时间：15 ℃、24 h；收菌离心：10 000 r/min、5 min；破碎压力：600 bar；除碎片离心：12 000 r/min、30 min、4 ℃；洗脱咪唑：20–250 mmol/L；缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl pH 7.0
2.5 酶活测定
在不同条件下表征PjUGT67的酶活，以确定其最佳操作参数。酶反应标准体积为100 μL，包含50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 7.0，C0221B，Beyotime Biotech Inc，上海，中国）、50 μg纯化PjUGT67、0.5 mmol/L糖基供体和0.1 mmol/L糖基受体。为确定最适pH，反应于35.0 ℃进行30 min，pH范围5.00至10.00，使用柠檬酸–柠檬酸钠（pH 5.0–6.0）、Na2HPO4-NaH2PO4（pH 6.0–8.0）、Tris-HCl（pH 8.0–9.0）和Na2CO3-NaHCO3（pH 9.0–10.0）缓冲体系。最适反应温度通过在确定的pH范围内、25 ℃至40 ℃下进行反应来评估。每个条件设三次重复实验。反应通过加入冰冷甲醇终止，并于12 000 r/min离心30 min。上清液用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱（LC/MS）分析。
为测定PjUGT67的动力学参数，酶反应在200 μL反应体系中进行，含50 μg纯化重组PjUGT67、1.0 mmol/L UDP-Xyl和不同浓度的竹节参皂苷IVa（0–100 μmol/L）。反应于35 °C恒温进行30 min，缓冲液为50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4（pH 7.0）。加入200 μL甲醇终止反应。所有实验均设三次重复。使用标准化合物浓度梯度构建校准曲线（图S2）以定量反应产物。动力学参数通过将实验数据拟合至Michaelis-Menten方程计算，并通过协同作图分析进一步验证。
【数据】反应体积：100 μL；缓冲液：50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 pH 7.0；酶量：50 μg；糖基供体：0.5 mmol/L；糖基受体：0.1 mmol/L；pH范围：5.00–10.00；最适pH考察温度/时间：35.0 ℃、30 min；温度范围：25–40 ℃；终止：冰冷甲醇；离心：12 000 r/min、30 min；动力学反应体积：200 μL；UDP-Xyl：1.0 mmol/L；IVa浓度范围：0–100 μmol/L；动力学温度/时间：35 °C、30 min；终止甲醇：200 μL；重复：三次
2.6 亚细胞定位实验
携带pHB-EYFP和pHB-PjUGT67-EYFP的农杆菌菌株在含抗生素的10 mL LB培养基中培养（原文节选至此，后续步骤未详述）。
【数据】培养基体积：10 mL；培养基：LB；载体：pHB-EYFP、pHB-PjUGT67-EYFP；原文未详述：抗生素种类与浓度、培养温度时间、浸润条件
研究结果
3.1 关键功能基因挖掘
OA型人参皂苷被鉴定为竹节参的特征代谢物，并呈现明显的组织特异性分布：根茎中积累最高，侧根中等，茎和叶中仅痕量水平（图1 A–C）。定量代谢物数据来自我们此前已发表的研究（Huang et al., 2023），并在本研究中与转录组数据进行整合分析复用。由于β-香树脂醇合酶（bAS）催化形成β-香树脂醇——RT1及其他OA型人参皂苷的关键三萜骨架，它被认为是OA型人参皂苷生物合成途径中的关键上游酶。为鉴定竹节参中相应的bAS基因，利用不同组织进行转录组分析，并以GgbAS（NCBI登录号：AB037203.1）为查询序列进行BLAST搜索，鉴定出两个同源转录本，命名为PjbAS1和PjbAS2。表达模式分析显示，PjbAS1和PjbAS2均表现出与OA型人参皂苷分布模式高度一致的组织特异性表达谱：根茎中表达最高，侧根中等，茎和叶中低得多（图1D）。代谢物积累与基因表达之间的这种对应关系进一步支持PjbAS1和PjbAS2参与OA型人参皂苷生物合成。
此外，既往研究表明，生物合成途径上下游步骤的基因往往表现出高度相关的表达谱，这为通过共表达分析发现途径基因提供了有用基础。因此，选择PjbAS1和PjbAS2作为诱饵基因进行后续共表达分析，以鉴定参与RT1生物合成的未揭示关键UDP-木糖基转移酶。本研究中，PjbAS1和PjbAS2分别用于与竹节参转录组中其他转录本进行相关性分析。应用两条具体标准筛选候选基因以供进一步研究：（1）与PjbAS1和PjbAS2均高共表达的基因（每个转录本的Pearson相关系数≥0.6）；（2）在Non-redundant（NR）数据库中注释为糖基转移酶的基因。随后构建基因共表达网络，以可视化PjbAS1、PjbAS2与满足两条标准的79个候选基因之间的关系（图1E）。
为评估候选基因的进化关系并推断其潜在功能，使用候选PjUGTs的推导氨基酸序列与拟南芥代表性UGTs，通过Neighbor-Joining法构建系统发育树（图1F）。候选PjUGTs分布于多个UGT家族，包括UGT71、UGT72、UGT73、UGT74、UGT80、UGT81、UGT91和UGT92，表明共表达分析检索到功能多样的糖基转移酶候选集。然而，并非所有这些候选基因同等可能参与RT1生物合成。其中，UGT73家族受到特别关注，因为许多已功能表征的五环三萜糖基转移酶属于该分支。既往研究表明，UGT73成员通常催化五环三萜的糖基化，包括齐墩果酸、常春藤皂苷及相关骨架C-3、C-23和C-28等位置的修饰。在系统发育树中，PjUGT67和PjUGT186均位于UGT73家族内，使其比其他分布在更远缘UGT分支中的共表达PjUGTs更可能是三萜皂苷糖基化的候选者。然而，PjUGT186未选作进一步功能表征，因为其预测编码序列明显短于植物家族1 UGTs的典型长度，提示其可能代表不完整或截短的转录本。相比之下，PjUGT67编码具有预期序列特征的全长UGT，因此是最适合生化验证的候选者。通过比较，其他候选PjUGTs虽被共表达分析保留，但归属于与已知五环三萜活性UGT73酶关联较不密切的UGT家族。综上，系统发育位置、序列完整性和UGT73分支的功能先例共同支持PjUGT67作为后续功能分析的最高优先级候选者。
【数据】组织分布：根茎最高、侧根中等、茎叶痕量；bAS同源转录本：2个（PjbAS1、PjbAS2）；Pearson阈值：r ≥ 0.6；候选基因数：79个；候选UGT家族：UGT71、72、73、74、80、81、91、92；重点关注家族：UGT73；GgbAS登录号：AB037203.1
3.2 PjUGT67的功能表征
PjUGT67的编码序列（CDS）从竹节参根茎cDNA扩增，克隆至表达载体pCold TF进行异源表达。为表征其酶功能，携带N端6×His标签的重组PjUGT67在大肠杆菌中表达。细胞破碎后，融合蛋白通过固定化金属亲和层析纯化。SDS-PAGE分析显示，纯化的融合蛋白（含trigger factor标签）表观分子量约为108.5 kDa（图S3）。重组PjUGT67的酶活按方法部分所述测定。将IVa与重组PjUGT67和UDP-Xyl共孵育后，HPLC鉴定出一个新产物，其保留时间与RT1标准品一致（图2 A–B）。进一步LC-MS分析确认了该产物的身份。如图2C所示，主要碎片离子出现在m/z 926.344 3 [M−H]−、m/z 763.312 0 [M−H−Glc]−、m/z 613.280 3 [M−H−Glc−Xyl−H2O]−和m/z 455.282 2 [M−H−Glc−Xyl−GluA]−，与RT1标准品的特征碎裂模式一致。该碎裂途径表明C-28葡萄糖基部分优先断裂，随后C-3糖链末端木糖基残基丢失并伴随脱水，继而去除C-3葡萄糖醛酸基残基生成苷元相关离子。
综上，这些结果表明PjUGT67作为UDP-木糖基转移酶，能够催化IVa转化为RT1。尽管体外实验证明PjUGT67催化IVa到RT1的转化，仍需直接的植物体内遗传验证以确认其在竹节参中的生理作用。此外，PjUGT67的功能表征为在酵母中重建RT1途径提供了重要基础，并支持该稀有乌苏烷型人参皂苷异源从头生产的可行性。
【数据】融合蛋白表观分子量：约108.5 kDa；标签：N端6×His；产物离子：m/z 926.344 3 [M−H]−、763.312 0 [M−H−Glc]−、613.280 3 [M−H−Glc−Xyl−H2O]−、455.282 2 [M−H−Glc−Xyl−GluA]−；底物：IVa（MW 794.97）；产物：RT1（MW 927.08）；供体：UDP-Xyl
3.3 PjUGT67的酶学性质与亚细胞定位
为进一步明确PjUGT67的催化特征并更好理解其在RT1生物合成中的作用，我们系统表征了其生化性质、底物范围、糖基供体偏好和亚细胞定位。这些分析不仅旨在评估PjUGT67的体外酶学行为，也旨在为理解该UGT如何参与竹节参中RT1形成的最终糖基化步骤提供机制见解。首先评估一系列温度以确定PjUGT67的最适反应温度。该酶在35 ℃时表现最大活性（图3A）。当温度升高至35 ℃以上时，其活性逐渐下降，可能由于高温下蛋白稳定性降低或部分变性所致，这在嗜温植物酶中常见。PjUGT67的最适pH为7.0（图3B），在酸性（pH 5）和碱性（pH 9–10）条件下活性均显著下降。
【数据】最适温度：35 ℃；最适pH：7.0；酸性条件：pH 5活性显著下降；碱性条件：pH 9–10活性显著下降；原文未详述：动力学参数具体数值（Km、Vmax、kcat）
3.4 PjUGT67的底物宽泛性
（原文节选至此，后续结果内容未详述。）
【数据】原文未详述：本节具体实验数值
讨论与解读
本研究将PjUGT67鉴定为参与末端糖基化步骤的候选UDP-糖基转移酶，支持竹节参中RT1的糖基化路线假设。结合PjCSLM和PjC28UGT的功能验证，结果为从OA到CE、IVa、最终到RT1的连续糖基化步骤提供了生化证据。基于这些发现，通过整合OA生物合成、逐步糖基化和UDP-Xyl供给，建立了基于酵母的RT1从头生物合成系统。工程菌株RT1-02成功生产RT1，产量为17.34 mg/L，证明了微生物生产RT1的可行性。总体而言，该工作为所提出的RT1糖基化途径提供了生化支持，建立了微生物RT1生物合成的实用路线，并为未来OA型人参皂苷生物合成与生产研究提供了有用的酶学和工程资源。
编译者解读：该研究的亮点在于"酶学鉴定—途径串联—酵母重构"的闭环设计：以共表达分析加系统发育定位从79个候选中锁定PjUGT67，再用体外酶学与LC-MS碎裂谱确证木糖基化功能，最后把三个糖基化步骤与UDP-木糖供给模块一起装入酵母，17.34 mg/L的产量虽处实验室水平，但验证了稀有OA型皂苷异源合成的可行性。局限亦明显：PjUGT67的植物体内遗传验证尚未完成，且产量距工业化尚有数量级差距，后续需在供体供给通量与前体竞争分流上继续工程化改造。
参考来源
期刊：Chinese Herbal Medicines, 2026
DOI: 10.1016/j.chmed.2026.10.007
DOI: 10.1016/j.chmed.2026.10.007