来源：A fluorescence biosensor based on iron ball-enhanced microdroplet generation system and deep learning for fast and sensitive detection of foodborne pathogens（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
传统细菌检测依赖精密芯片与复杂微流控，液滴均一度要求苛刻，荧光信号分析效率低、准确性不足。这项研究用铁球辅助涡旋乳化替代芯片式液滴生成，再以YOLOv11深度学习模型自动识别液滴荧光图像，结合荧光强度与液滴面积双参数叠加模型，在45分钟内完成鼠伤寒沙门氏菌检测，检出限达4.2 CFU/mL，线性范围10¹–10⁵ CFU/mL。方法学上"去芯片化"与"AI读图"两条线索合并，值得一看。
研究背景
致病菌是食品安全的主要威胁，肉、蛋、奶等动物源性产品在供应链各环节均易受污染。现有检测手段各有短板：培养平板法结果较准，却耗时费力；酶联免疫吸附试验（ELISA）依托抗原抗体特异反应可实现高通量，但易受交叉污染干扰；聚合酶链反应（PCR）能在短时间内指数扩增DNA、显著提升灵敏度，却通常需要复杂的DNA前处理和热循环设备。快速、简便、灵敏的新型检测方法因此成为需求焦点。
近年来等温核酸扩增技术发展迅速，重组酶聚合酶扩增（RPA）、重组酶辅助扩增（RAA）、滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）等均可在恒温条件下完成扩增，摆脱了对热循环仪的依赖。但这些技术走向现场检测，仍受制于信号读出环节的硬件成本与操作复杂度。本研究将铁球辅助液滴生成与深度学习图像分析结合，试图同时拆掉"精密芯片"和"人工判读"两道门槛。
研究方法
2.1 细菌培养与DNA提取
选取以下菌株作为研究对象：鼠伤寒沙门氏菌（S.T.，ATCC 14028）作为靶标菌；蜡样芽孢杆菌（B.C.，ATCC 11778）、大肠杆菌O157:H7（E.C.，ATCC 43888）、单增李斯特菌（L.M.，ATCC 13932）和金黄色葡萄球菌（S.A.，ATCC 25293）作为非靶标菌。所有细菌均在高压灭菌的LB肉汤（AOBOX，中国）中于37 °C培养18 h。按照基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，中国）说明书操作：先以10000 rpm离心1 min浓缩菌体，随后采用磁珠法进行DNA提取与纯化。收集的DNA浓度用NanoDrop仪器（Thermo Fisher Scientific，美国）测定，之后于−20 °C保存以供后续实验使用。
【数据】菌株：S.T. ATCC 14028、B.C. ATCC 11778、E.C. ATCC 43888、L.M. ATCC 13932、S.A. ATCC 25293；培养基：LB肉汤；温度：37°C；时间：18h；离心：10000rpm、1min；DNA保存温度：−20°C
2.2 靶基因与引物设计
选择S.T.的invA基因作为RAA扩增的靶基因。使用Primer Premier 5软件（Premier Biosoft，美国）设计特异性引物对，参数设定为：引物长度18–22 bp，GC含量60%，熔解温度（Tm）50 °C。所设计引物随后通过Primer-blast（NCBI）进行全面分析验证，以确保特异性且不与非靶标序列发生交叉反应。为实现实时检测，采用FAM-BHQ荧光淬灭系统，并将其特异性修饰于探针上。探针使用SnapGene软件（GSL Biotech，美国）精心设计，使其与靶基因扩增区域完全互补。引物与探针序列见表S1。
【数据】靶基因：invA；引物长度：18–22bp；GC含量：60%；Tm：50°C；荧光系统：FAM-BHQ；原文未详述引物具体序列（见表S1）
2.3 RAA扩增反应
DNA等温快速扩增试剂盒（荧光型）购自常州扩增未来（中国），内含重组酶、聚合酶、单链DNA结合蛋白（SSB）以及其他必要的共反应因子和缓冲液。50 μL RAA扩增反应体系按如下配方配制：29.4 μL Reaction Buffer A、1.5 μL正向引物（10 μM）、1.5 μL反向引物（10 μM）、1.8 μL FAM标记荧光探针（10 μM）、5 μL模板DNA、8.3 μL无核酸酶蒸馏水（ddH₂O）、2.5 μL Enzyme Buffer B。各组分按上述顺序小心移入无菌薄壁管中。
【数据】反应体系：50μL；Buffer A：29.4μL；正向引物：1.5μL（10μM）；反向引物：1.5μL（10μM）；FAM探针：1.8μL（10μM）；模板DNA：5μL；ddH₂O：8.3μL；Enzyme Buffer B：2.5μL
2.4 液滴生成
本研究开发了铁球强化液滴生成系统，将铁球加入油相与水相试剂的混合物中，涡旋混合诱导形成微液滴，作为DNA扩增反应腔室。这一简单方法可规避传统液滴生成微流控芯片的高成本与复杂操作。液滴生成步骤如下：首先，取10 μL RAA反应体系试剂加入含0.04 g铁球（直径0.4 mm）的5 μL油中，形成油水两相；随后将混合物置于涡旋混合器上处理40 s以形成微液滴。铁球的加入可确保充分乳化并将试剂分割成液滴，进一步增强每个液滴内的反应效率，从而产生更强的信号（图1C）。
【数据】RAA试剂：10μL；油相：5μL；铁球质量：0.04g；铁球直径：0.4mm；涡旋时间：40s
2.5 图像采集
成功生成的微液滴被转移至一个简易观察芯片（图S2），在定制设计的帕尔贴加热器加热下完成扩增。随后将观察芯片置于倒置荧光显微镜（ZEISS，德国）下，含FAM标记DNA的荧光液滴在488 nm激发下被观察和成像（放大倍数40×；曝光时间10 s），结果见图S3。PDMS材料优异的光学透明性使液滴动态与形态特征得以高分辨率可视化，便于对微液滴进行精确分析。
【数据】激发波长：488nm；放大倍数：40×；曝光时间：10s；芯片材料：PDMS；加热方式：帕尔贴加热器
2.6 图像预处理
倒置荧光显微镜采集的荧光图像存在较强的绿色背景和部分红蓝色噪点，降低了数据集质量，会干扰深度学习训练。为此，本研究将一种新型双边阈值滤波算法——由空间上下文引导的上、下强度阈值定义——与HSV色彩空间相结合以应对上述问题（图S4）。首先使用OpenCV将采集的荧光液滴图像转换为二维矩阵。随后手动绘制包围某个代表性绿色液滴及其周围背景的矩形框进行选取。应用HSV颜色阈值，下界设为[35, 100, 70]，上界设为[85, 255, 255]，有效去除样本框内的背景像素。该滤波流程随后应用于图像中所有其他液滴。HSV阈值经代表性荧光图像手动优化后，在所有实验中固定不变。一旦确定，双边阈值滤波算法即自动应用于所有图像，无需进一步手动调整。最终获得无背景干扰的干净荧光液滴图像，为高质量数据集构建和深度学习分析提供了坚实基础。
【数据】HSV下界：[35, 100, 70]；HSV上界：[85, 255, 255]；处理工具：OpenCV；阈值确定方式：代表性图像手动优化后固定
2.7 深度学习分析
深度学习模型（图S5）基于PyTorch 2.1.2、在Python 3.10环境下使用Ultralytics框架实现。模型训练与推理在一台配备Intel Xeon Gold 6330 N CPU、24 GB显存的NVIDIA GeForce RTX 4090 GPU、64 GB系统内存的工作站上进行，操作系统为Rocky Linux 9.4。采用CUDA 12.1与cuDNN 8.9.02加速模型训练与推理。详细软硬件配置汇总于表S2。
【数据】框架：Ultralytics/PyTorch 2.1.2；Python：3.10；CPU：Intel Xeon Gold 6330 N；GPU：RTX 4090（24GB显存）；内存：64GB；系统：Rocky Linux 9.4；CUDA：12.1；cuDNN：8.9.02
2.8 细菌样品检测
为评估该生物传感器的实际性能，按照相关国家标准方法制备加标样品：牛肉、鸡肉、生菜、牛奶、猪肉和鸡蛋购自当地超市（中国杭州），水样取自河流（杭州钱塘江）。首先，按前述方法提取浓度为3.1 × 10¹至3.1 × 10⁵ CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌DNA模板。用提取的DNA配制完整RAA反应体系后，取10 μL反应混合物转移至管中，随后加入5 μL油和0.04 g、直径0.4 mm的铁球，将管置于涡旋装置上生成液滴。涡旋40 s后，液滴注入简易芯片，用帕尔贴加热器于39 °C孵育30 min。接着，用倒置荧光显微镜在488 nm激光、10 s曝光下采集芯片内液滴的荧光图像。经图像双边阈值滤波算法消除背景后，图像输入基于YOLOv11的深度学习模型，分析荧光信号以准确定量沙门氏菌浓度。
【数据】检测浓度范围：3.1×10¹–3.1×10⁵ CFU/mL；反应体积：10μL；油：5μL；铁球：0.04g、0.4mm；涡旋：40s；孵育温度：39°C；孵育时间：30min；激发：488nm；曝光：10s；样品基质：牛肉、鸡肉、生菜、牛奶、猪肉、鸡蛋、河水
研究结果
3.1 微液滴生成系统的机制与优化
本研究开发了一种铁球强化系统，用于快速生成尺寸不均一的微液滴。如图2(A)所示，在离心管中加入油、试剂和铁球后，混合物经涡旋混合器处理生成微液滴，可提升液滴分割效率。在此过程中，过大的液体会被铁球切分形成小液滴，进而增强液滴内RAA扩增所提供的信号。如图2(B)所示，实验验证了铁球在微液滴生成系统中的实际作用：记录铁球与水（400 μL）、油（200 μL）混合物在60 s内的涡旋过程，并与无铁球涡旋进行对比。如图2(B)所示，水油涡旋得以实现，其中乳化在50 s后可观察到；而铁球辅助下的水油涡旋在10 s后即充分完成。结果表明，铁球的加入增强了水油乳化效果。
【数据】水：400μL；油：200μL；无铁球乳化时间：50s；有铁球乳化完成时间：10s；对比时间窗：60s
3.2 液滴优化
传统涡旋诱导微液滴形成依赖旋转剪切力，并需精确平衡流体动力学与界面张力以实现可控液滴生成。该方法兼具两大优势：可产生高度单分散的微液滴，并可通过调节振荡参数与流体性质精确控制液滴尺寸与生成速率。由于更小的液滴能带来更高的DNA扩增效率和更亮的荧光，尽可能优化各项参数以抑制大液滴形成、促进更多小尺寸液滴生成十分必要。改进后液滴生成时间缩短，同时保持优异稳定性。首先尝试不同涡旋时间，包括10 s、20 s、40 s和60 s，以获得更小尺寸的液滴。从液滴图像（图S6）看，最佳反应时间为40 s，此时小液滴与大液滴之间的直径差异最小、液滴尺寸众数最小（图2C）。随后尝试不同水油比，包括4:1、2:1、1:1、0.5:1，以确保合适比例并进一步减小液滴尺寸。显然，最佳比例为2:1，其尺寸差异与众数均最小（图2D）。接着测试铁球尺寸与质量对尺寸变化的显著影响，直径0.4 mm（图2E）、质量0.04 g的铁球在微液滴生成中表现出最优尺寸（图2F）。尽管RAA试剂具有粘性，但混合物与铁球一起涡旋时更容易形成液滴。由于液滴内扩增可大大降低负信号对正信号稀释的影响，且液滴尺寸越小、荧光信噪比越高、荧光信号越明显，因而更有利于荧光信号的计算与分析。为定量评估铁球辅助液滴生成策略的性能，对有无铁球辅助所生成液滴的尺寸分布进行了统计分析。如图S7所示，无铁球时生成的液滴尺寸分布宽泛，部分液滴直径超过300 μm，平均直径121.4 ± 106.6 μm（CV = 87%），表明尺寸异质性显著。相比之下，加入铁球后液滴尺寸明显减小、均一度提高，平均直径13.7 ± 6.4 μm（CV = 45%），大多数液滴集中在30 μm以下。这种液滴生成性能的提升可用经典液滴破碎理论解释。根据韦伯数（We = ρu²d/γ）与毛细数（Ca = μu/γ），当流体动力克服界面张力时液滴破碎被促进。在涡旋辅助乳化过程中，铁球的持续运动产生反复机械碰撞与局部高剪切区域，从而提高乳液体系内的特征流速与剪切速率。于是作用于水相的破坏力增强，促进液滴变形与破碎，同时抑制超大液滴形成。铁球加入后平均液滴尺寸与变异系数的显著下降与该理论解释一致，表明铁球辅助乳化显著提升了液滴破碎效率并改善了液滴生成的重现性。最终，优化方法能够可靠地大量生成小尺寸微反应器，为更高效的细菌DNA扩增创造了有利条件。
【数据】涡旋时间：10/20/40/60s（最优40s）；水油比：4:1、2:1、1:1、0.5:1（最优2:1）；铁球直径：0.4mm；铁球质量：0.04g；无铁球平均直径：121.4±106.6μm（CV=87%）；有铁球平均直径：13.7±6.4μm（CV=45%）；无铁球部分液滴：>300μm；有铁球多数液滴：<30μm
3.3 RAA优化
液滴尺寸优化完成后，需在小尺寸微液滴中进行重组酶聚合酶DNA扩增。RAA扩增反应中，FAM荧光团标记于DNA上，随后用488 nm激发光照射液滴即显示绿色荧光。为获得更高的系统信噪比，对反应条件进行优化以增强荧光信号强度，从而生成更亮液滴并降低背景干扰。试剂体积显著影响反应结果，因此有必要调整RAA试剂组分。首先测试不同用量的正向与反向引物（1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL、2.5 μL和3.0 μL），基于荧光强度分析选择1.5 μL为最佳体积（图3A）。类似地，探针用量在1.2 μL、1.5 μL、1.8 μL、2.1 μL和2.4 μL中评估，1.8 μL表现出最高荧光信号，因而被选用于后续实验（图3B）。此外，反应温度测试了33 °C、36 °C、39 °C、42 °C和45 °C，39 °C表现最佳（图3C）。最后比较不同孵育时间（20 min、25 min、30 min、35 min和40 min），确定30 min为最佳反应时长（图3D）。反应条件优化后，获得了荧光信号更显著的液滴图像，为更好的深度学习训练与信号分析奠定了基础。
【数据】引物用量：1.0/1.5/2.0/2.5/3.0μL（最优1.5μL）；探针用量：1.2/1.5/1.8/2.1/2.4μL（最优1.8μL）；温度：33/36/39/42/45°C（最优39°C）；孵育时间：20/25/30/35/40min（最优30min）
3.4 数据集构建
高质量数据集对图像目标识别影响很大，可间接提升目标检测准确率[24]。在优化液滴尺寸与反应条件后，用倒置荧光显微镜采集图像。整个信号分析流程包括：图像采集、背景去除、模型训练与实际检测（图4A）。采集的图像在荧光信号定量前经几何与强度校正。然而，荧光显微图像常受大量绿色背景干扰污染，对需要高质量训练数据的深度学习应用构成显著挑战。为消除绿色背景，开发了一种创新的双边阈值滤波算法并结合HSV色彩空间变换。如图4B所示，该算法通过空间域与色彩域处理技术的新颖集成，在有效抑制背景伪影的同时保留目标信号。由于深度学习训练需要大量……
【数据】分析流程：图像采集→背景去除→模型训练→实际检测；背景去除方法：双边阈值滤波+HSV色彩空间；原文节选至此中断，后续数据原文未详述
3.5 细菌检测性能评估
图5展示了该传感器用于沙门氏菌检测的评估结果。在3.1 × 10¹–3.1 × 10⁵ CFU/mL浓度范围内，传感器采集的荧光图像、转换后的灰度图像及强度分析结果如图5(A)所示。图5(B)比较了传统荧光方法与本工作的检测表现。图5(C)给出了传感器信号与沙门氏菌浓度之间的线性模型。原文节选未提供该部分的具体数值描述。
【数据】检测浓度范围：3.1×10¹–3.1×10⁵ CFU/mL；LOD：4.2 CFU/mL（见摘要与讨论）；线性范围：10¹–10⁵ CFU/mL（见摘要）；其余数值原文节选未详述
讨论与解读
研究将本平台与近年报道的代表性食源性致病菌检测方法进行了对比，涵盖传统方法（ELISA、qPCR、SERS）、数字微流控技术（dPCR、dLAMP）、电化学传感器、CRISPR/Cas12a系统以及AI辅助免疫荧光方法（表2）。本平台在45分钟总检测时间内实现4.2 CFU/mL的检出限。SERS读出更快（20 min），但灵敏度明显受损（136 CFU/mL）；qPCR（10 CFU/mL）与CRISPR/Cas12a（24.8 CFU/mL）虽灵敏度高，却需要150–180 min的检测时间。传统数字微流控系统（dPCR、dLAMP）与电化学传感器高度依赖微流控芯片、专用液滴生成硬件或复杂表面修饰，处理时间在80–90 min。相比之下，本方法完全无需芯片，借助铁球涡旋辅助乳化策略快速生成微流控液滴，不需昂贵的微加工，也不要求精确的液滴均一性控制。与现有AI辅助检测系统（如Faster R-CNN分析的免疫荧光，耗时150 min、LOD为55 CFU/mL）相比，本工作将RAA与……
【数据】本平台：LOD 4.2 CFU/mL、总时间45min；SERS：20min、136 CFU/mL；qPCR：10 CFU/mL、150–180min；CRISPR/Cas12a：24.8 CFU/mL、150–180min；dPCR/dLAMP与电化学：80–90min；Faster R-CNN免疫荧光：150min、55 CFU/mL
编译者解读：这项工作的聪明之处在于"降硬件"——用铁球涡旋替代微流控芯片，把液滴生成从精密制造问题变成耗材问题，CV从87%降到45%虽仍不算单分散，但配合AI读图恰好把"不均一"从缺陷转为可容忍变量。双参数叠加模型是对液滴异质性的务实补偿。局限也明显：铁球批间一致性、涡旋设备便携化、YOLOv11模型在真实基质中的泛化能力，都是走向现场检测前必须回答的问题。
参考来源
期刊：Microchemical Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119227
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119227