来源：An efficient RUBY-based transient transformation system in Ginkgo biloba leaves facilitates functional dissection of flavonoid biosynthesis（aBIOTECH）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
银杏是富含黄酮类药用成分的裸子植物，但缺乏高效遗传转化体系长期制约其基因功能研究。本研究在银杏叶片中建立了农杆菌介导的RUBY可视化瞬时转化系统，筛选出高毒力菌株AGL1，并系统优化了菌液浓度、侵染液pH、DTT浓度和苗龄等参数，最高转化效率达72%。利用该系统对两个黄酮醇合酶基因和转录因子GbMYB123进行了功能验证，为银杏及难转化木本植物的基因功能研究提供了快速平台。
研究背景
银杏是全球广泛栽培的古老裸子植物，其叶片富含黄酮类和萜内酯类次生代谢物，在医药、化妆品和天然产物工业中应用广泛。叶片是银杏黄酮生物合成与积累的主要器官，但该物种的功能研究受限于生物学特性：稳定的遗传转化体系尚未建立，现有瞬时转化方法效率低且不稳定。转录组等高通量手段虽已鉴定出大量黄酮生物合成候选基因，其功能验证却主要依赖拟南芥和本氏烟草等异源体系。银杏作为裸子植物，与这些被子植物模式种存在显著进化分歧，异源体系难以完整再现银杏特有的遗传背景、前体供应和代谢调控网络，可能影响功能推断的准确性，也阻碍了该经济物种的精准分子改良。因此，亟需在银杏自身建立高效、可视、快速的转化与功能验证平台。
研究方法
植物材料
银杏种子采自扬州大学银杏实验基地，砂藏保存。为促进萌发，将贮藏种子用15% NaClO溶液消毒20 min，随后用清水冲洗三次后播种。冲洗后的种子平铺于覆盖湿纱布的托盘上，上面再盖一层湿纱布以保持湿润环境，托盘置于人工气候培养箱中，25 °C、16 h光照/8 h黑暗周期培养7–14天。挑选萌发种子，置于人工气候培养箱中培养，温度设定为25 °C（光照）/18 °C（黑暗）。
【数据】消毒剂：15% NaClO；消毒时间：20 min；冲洗次数：3次；萌发温度：25 °C；光周期：16 h光照/8 h黑暗；萌发时间：7–14天；培养温度：25 °C（光）/18 °C（暗）
由于在野生型拟南芥中观察到明显的转基因沉默，遗传转化在rdr6背景中进行，以降低RNA依赖的沉默途径对外源基因表达的影响。拟南芥种子播于蛭石、珍珠岩和营养土按1:1:1（v/v/v）混合的基质中，4 °C黑暗放置2天，然后转移至培养室（23 °C，16 h光照/8 h黑暗周期）。
【数据】拟南芥背景：rdr6；基质配比：蛭石:珍珠岩:营养土=1:1:1（v/v/v）；春化温度：4 °C；春化时间：2天；培养温度：23 °C；光周期：16 h光照/8 h黑暗
杨树84K（Populus alba × Populus tremula var. glandulosa）用于遗传转化。野生型和转基因组培杨树苗炼苗2天后移栽至土壤。移栽时清除根部残留培养基，用透明一次性塑料杯覆盖幼苗，成活后移除塑料杯。
【数据】杨树品种：84K（Populus alba × Populus tremula var. glandulosa）；炼苗时间：2天；覆盖物：透明一次性塑料杯
农杆菌介导的银杏叶片瞬时转化
最初测试两种农杆菌菌株（GV3101和AGL1），并使用35S::RUBY报告系统可视化成功转化的叶片。将农杆菌菌落接种于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28 °C、220 rpm摇床培养24 h；次日取1 mL一级培养物转接至50 mL含抗生素的新鲜LB培养基中，相同条件下过夜培养。农杆菌AGL1表现出远高于GV3101的转化效率，因此用于后续实验以优化其他转化参数，即菌液OD600、侵染培养基pH、DTT添加和苗龄。
【数据】菌株：GV3101、AGL1；培养基：LB液体培养基；抗生素：卡那霉素、利福平；培养温度：28 °C；转速：220 rpm；一级培养时间：24 h；二级培养：过夜；报告系统：35S::RUBY
将携带RUBY报告基因的AGL1单菌落接种于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28 °C、220 rpm摇床培养24 h。扩大培养后于室温、2,800 × g离心10 min，弃上清。菌体重悬于侵染培养基中，该培养基含100 μM乙酰丁香酮、四分之一强度Murashige and Skoog、10 mM MgCl2、1%蔗糖和0.01% Silwet-77。用该混合液制备不同光密度（OD600 = 0.2、0.4、0.6、0.8和1.0）的接种液，随后采用注射递送法施加于银杏幼苗叶片。
【数据】菌株：AGL1；培养温度：28 °C；转速：220 rpm；培养时间：24 h；离心力：2,800 × g；离心时间：10 min；离心温度：室温；乙酰丁香酮：100 μM；MS强度：1/4；MgCl2：10 mM；蔗糖：1%；Silwet-77：0.01%；OD600梯度：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
为评估pH对转化的影响，将缓冲液pH调节至5.8和6.8。在侵染缓冲液中测试不同浓度DTT（1 mM、5 mM和10 mM）。使用播种后20、40和60天的银杏幼苗确定最适转化生长阶段。转化体系建立后，采用40日龄银杏幼苗进行后续基因功能验证实验。pACT2::FGFP和35S::FGFP载体用于候选基因的功能表征。注射相应构建体的叶片于侵染后4天采收，用于RT–qPCR定量目标基因表达和测定黄酮含量。
【数据】pH：5.8、6.8；DTT浓度：1 mM、5 mM、10 mM；苗龄：20、40、60天；后续实验苗龄：40天；载体：pACT2::FGFP、35S::FGFP；采样时间：侵染后4天
启动子元件分析与系统发育树构建
使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测GbMYB123启动子中的顺式作用元件，并用TBtools可视化。使用Pfam（http://pfam.xfam.org/）预测蛋白结构域。使用Clustal X 2.1和DNAMAN进行多氨基酸序列比对，在MEGA 11中采用邻接法和1,000次bootstrap重复构建系统发育树。
【数据】启动子分析工具：PlantCARE；可视化工具：TBtools；结构域预测：Pfam；比对工具：Clustal X 2.1、DNAMAN；系统发育软件：MEGA 11；方法：邻接法；bootstrap重复：1,000次
基因克隆与载体构建
以银杏cDNA为模板，使用LA Taq Kit（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）按厂家方案扩增GbMYB123的编码序列（CDS）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Scientific, Union City, CA, USA）纯化。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech, Nanjing, China）将GbMYB123的CDS克隆至经BamHI酶切的pACT2::FGFP或35S::FGFP过表达载体（表S1）。使用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）从叶片中提取DNA。
【数据】模板：银杏cDNA；扩增试剂盒：LA Taq Kit（Takara）；纯化试剂盒：AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen）；克隆试剂盒：ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme）；限制性内切酶：BamHI；载体：pACT2::FGFP、35S::FGFP；DNA提取试剂盒：DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）
RNA-seq
分别用pACT2::FGFP-GbMYB123载体和pACT2::FGFP空载体瞬时转化银杏叶片后，通过RT–qPCR确认转化成功。注射后4天采集叶片进行转录组测序。使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa, Dalian, China）按厂家说明从三个生物学重复中提取总RNA。cDNA文库按此前描述的方法构建，并在HiSeq 4000平台（Illumina, San Diego, CA, USA）测序。原始reads经过滤去除接头序列、含未知核苷酸的reads以及低质量碱基超过50%的reads。过滤后的reads使用HISAT2比对至银杏基因组。基因表达以FPKM定量。使用edgeR包鉴定GbMYB123过表达样本与对照样本间的DEGs，阈值为|log2(fold change)| ≥ 1且校正P ≤ 0.2。所有DEGs使用Blast2GO注释并映射至KEGG通路。基因表达热图使用TBtools构建。
【数据】采样时间：注射后4天；生物学重复：3个；RNA提取试剂盒：MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa）；测序平台：HiSeq 4000（Illumina）；比对工具：HISAT2；定量单位：FPKM；DEG鉴定工具：edgeR；阈值：|log2(fold change)| ≥ 1，校正P ≤ 0.2；注释工具：Blast2GO；热图工具：TBtools
RT–qPCR
使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme）按厂家方案提取总RNA。以GAPDH为内参基因，使用Primer Premier 5.0设计目标基因引物（表S1）。RT–qPCR在CFX96 Real-Time System（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）上使用PerfectStart Green qPCR SuperMix Kit（TransGen Biotech Co. Ltd.）进行。相对基因表达采用2−ΔΔCt法计算。
【数据】RNA提取试剂盒：FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme）；内参基因：GAPDH；引物设计软件：Primer Premier 5.0；仪器：CFX96 Real-Time System（Bio-Rad）；试剂盒：PerfectStart Green qPCR SuperMix Kit（TransGen）；计算方法：2−ΔΔCt
亚细胞定位
扩增不含终止密码子的GbMYB123全长CDS，克隆至pACT2::FGFP（或35S::FGFP）表达载体。将重组质粒（35S::FGFP-GbMYB123）和核定位标记质粒（35S::mCherry-NLS）分别转化至农杆菌AGL1。农杆菌培养至OD600为1.0，室温2,800 × g离心10 min，重悬于含10 mM MgCl2、10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）和150 μM乙酰丁香酮的溶液中。含35S::FGFP-GbMYB123和35S::mCherry-NLS的菌悬液按等体积比混合，用1 mL无针注射器轻柔注射至4–5周龄本氏烟草叶片下表皮。侵染植株黑暗放置12 h后转移至正常生长条件（23 °C，16 h光照/8 h黑暗）培养48 h。DAPI核染色时，注射35S::FGFP-GbMYB123的叶片于60 hpi通过下表皮注射DAPI Staining Solution（DAPI; Beyotime, C1006），黑暗孵育30 min。使用共聚焦显微镜（LSM 880; Zeiss, Oberkochen, Germany）观察GFP、mCherry和DAPI荧光。
【数据】菌株：AGL1；菌液OD600：1.0；离心力：2,800 × g；离心时间：10 min；离心温度：室温；MgCl2：10 mM；MES：10 mM；乙酰丁香酮：150 μM；烟草苗龄：4–5周；共注射体积比：1:1；黑暗时间：12 h；正常培养温度：23 °C；光周期：16 h光照/8 h黑暗；培养时间：48 h；DAPI注射时间：60 hpi；DAPI孵育：黑暗30 min；显微镜：LSM 880（Zeiss）
农杆菌介导的银杏愈伤组织瞬时转化
（原文节选至此，后续步骤原文未详述。）
【数据】原文未详述
研究结果
农杆菌介导的银杏叶片瞬时转化
农杆菌介导转化的成功在很大程度上取决于菌株的兼容性和毒力。为确定银杏幼苗转化的最适菌株，我们使用RUBY可视化报告系统评估GV3101和AGL1的转化效率（图1A）。用微量注射器将这些菌株导入40日龄幼苗顶部三片叶（图1B）。侵染后48小时（hpi），注射AGL1菌株的叶片可见明显红色着色。着色区域随时间逐渐扩大、颜色加深，表明甜菜红素持续积累至168 hpi。相比之下，注射GV3101的叶片未检测到红色着色（图1C–D）。为进一步评估该体系的可行性，我们将UV-GFP载体瞬时转化至银杏叶片。UV光照下48 hpi可见明显绿色荧光，84 hpi达到峰值，120 hpi时显著减弱（图1E）。与GFP荧光的快速周转不同，RUBY报告基因产生的甜菜红素红色色素沉着持续强烈长达7天，这可能归因于甜菜红素的化学稳定性。综上，这些结果表明AGL1菌株能高效介导银杏叶片的瞬时转化。
【数据】苗龄：40天；注射叶片数：顶部3片；菌株：GV3101、AGL1；红色着色检测时间：48 hpi；甜菜红素持续积累：至168 hpi；GFP荧光检测：48 hpi可见，84 hpi峰值，120 hpi显著减弱；红色色素持续：长达7天
叶片转化效率优化
为进一步提高银杏叶片瞬时表达效率，我们优化了其他参数：接种液光密度、侵染培养基pH、二硫苏糖醇（DTT）添加和苗龄。每个因素均对转化效率有显著影响。首先，通过评估光密度（OD600）梯度确定AGL1的最佳接种浓度。转化效率按显示可见红色着色的叶片数占转化叶片总数的比例计算。OD600 = 0.6时观察到最高转化效率61%。较低OD600值0.2和0.4的效率分别为28%和22%，推测因细菌量不足以有效诱导转化。效率在较高OD600值下也下降：OD600 = 0.8时为39%，OD600 = 1.0时为28%（图2A和E）。其次，我们评估了不同pH水平对转化效率的影响。pH 5.8的弱酸性环境产生较高效率：OD600 = 0.6时为67%，OD600 = 1.0时为39%。相比之下，pH 6.8的近中性环境在OD600 = 0.6时效率为22%，OD600 = 1.0时为28%（图2B和F）。这与酸性环境促进vir基因系统激活的既有认识一致。由于银杏叶片富含黄酮类等次生代谢物，我们在侵染缓冲液中补充了不同浓度DTT（1 mM、5 mM和10 mM），通过减轻植物防御反应提高转化效率。添加5 mM DTT产生最高转化效率：OD600 = 0.6时为72%，OD600 = 1.0时为44%。最低浓度1 mM DTT效果较差，OD600 = 0.6时效率仅17%，OD600 = 1.0时为33%，可能因不足以充分抑制植物防御机制。较高浓度10 mM也产生较低效率：OD600 = 0.6时为39%，OD600 = 1.0时为11%（图2C和G）。最后，我们使用20、40和60日龄幼苗评估苗龄对转化效率的影响。40日龄幼苗表现出最高转化效率（56%），可能因其发育充分但仍对农杆菌侵染敏感。相比之下，20日龄幼苗转化效率较低（22%），可能因其发育阶段较早；60日龄幼苗最低（11%）（图2D和H）。综上，银杏叶片最有效转化条件为AGL1接种液OD600 = 0.6、40日龄幼苗、pH 5.8含5 mM DTT的侵染缓冲液。
【数据】OD600梯度：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0；对应效率：28%、22%、61%、39%、28%；pH 5.8效率：OD600=0.6时67%，OD600=1.0时39%；pH 6.8效率：OD600=0.6时22%，OD600=1.0时28%；DTT 1 mM效率：OD600=0.6时17%，OD600=1.0时33%；DTT 5 mM效率：OD600=0.6时72%，OD600=1.0时44%；DTT 10 mM效率：OD600=0.6时39%，OD600=1.0时11%；苗龄20天效率：22%；苗龄40天效率：56%；苗龄60天效率：11%
瞬时系统用于关键黄酮结构基因功能验证
为评估所建平台的实用性，我们对两个GbFLS基因（Gb_01811和Gb_06949）进行了功能分析，这两个基因处于黄酮生物合成途径的核心位置。我们将每个基因单独插入pACT2::FGFP载体，并利用瞬时转化系统将构建体导入银杏叶片。与对照相比，GbFLS过表达显著提高总黄酮含量：Gb_01811提高15.6%，Gb_06949提高24.0%（图3）。这些结果证实了这两个结构基因的已知功能，也证明了该平台用于银杏高通量功能基因组学的可靠性。
【数据】基因：Gb_01811、Gb_06949；载体：pACT2::FGFP；总黄酮含量提升：Gb_01811为15.6%，Gb_06949为24.0%
黄酮调控转录因子GbMYB123的鉴定与表征
R2R3-MYB亚家族是植物MYB转录因子家族中最大的亚家族，在调控植物生长发育、次生代谢途径、逆境响应和激素信号中起关键作用。在拟南芥中，S4、S5、S6和S7 R2R3-MYB亚组成员已被证明参与黄酮生物合成。系统发育分析显示，银杏基因Gb_22883与拟南芥AtMYB123序列相似性最高，因此将其命名为GbMYB123（图S1A）。多氨基酸序列比对显示，与其他物种的R2R3-MYB蛋白一样，GbMYB123含有高度保守的R2和R3 DNA结合结构域，证实其属于R2R3-MYB家族成员（图S1B）。GbMYB123启动子区顺式作用元件分析鉴定出多个响应植物激素（如茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸）和非生物胁迫（如干旱和缺氧）的调控基序。该启动子还含有光响应元件、分生组织表达相关元件以及与玉米醇溶蛋白代谢调控相关的元件（图S1C），暗示该基因可能参与多种生理过程和胁迫响应。GbMYB123在银杏芽和茎中的表达显著高于其他组织（图S1D），提示其可能在该物种顶端生长或次生发育中发挥作用。Cell-PLoc 2.0软件预测GbMYB123定位于细胞核。为通过实验评估该预测，我们构建了pACT2::FGFP-GbMYB123表达载体并转化拟南芥获得纯合转基因株系。如图S1E所示，GbMYB123融合蛋白定位于细胞膜和细胞核。为排除载体特异性假象，我们还将GbMYB123插入35S::FGFP载体并转化杨树。与先前观察一致，GbMYB123在转基因杨树细胞中定位于细胞膜和细胞核（图S1F）。随后，我们在本氏烟草叶片表皮细胞中瞬时共表达35S::FGFP-GbMYB123与核标记构建体35S::mCherry-NLS，并进行DAPI核复染。共聚焦显微镜成像证实，GbMYB123的绿色荧光信号在细胞核中与mCherry-NLS和DAPI均重叠，同时也清晰勾勒出细胞膜（图S1G和H）。综上，这些结果证实GbMYB123定位于细胞核和细胞膜。
【数据】基因编号：Gb_22883（GbMYB123）；同源基因：拟南芥AtMYB123；保守结构域：R2、R3；启动子元件：茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸响应元件，干旱、缺氧响应元件，光响应元件；高表达组织：芽、茎；预测软件：Cell-PLoc 2.0；定位载体：pACT2::FGFP、35S::FGFP；验证物种：拟南芥、杨树、本氏烟草；共表达标记：35S::mCherry-NLS；复染：DAPI；显微观察：共聚焦显微镜
GbMYB123的异源与内源验证
为进一步评估银杏转化体系并直接评估GbMYB123在其天然宿主中的调控作用，我……（原文节选至此，后续内容原文未详述。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究建立了基于RUBY报告系统的银杏完整叶片高效瞬时转化体系，并验证了其用于快速功能分析和转录组分析以鉴定候选基因的实用性。农杆菌菌株选择是转化成功的首要决定因素，尤其在难转化木本物种中。历史上遗传转化工作主要依赖GV3101等毒力较低的无毒菌株，但本研究的实证结果显示GV3101完全无法介导可观察的转化，而高毒力菌株AGL1使RUBY和UV-GFP报告基因在银杏叶片中强健表达（图1D–E）。这种侵染效率的显著差异可能归因于两菌株固有的生理特性。AGL1具有C58染色体背景，携带高毒力pTiBo542质粒的无毒衍生体，其T-DNA转移能力显著高于GV3101。我们的观察还提示AGL1在完整银杏叶片中表现出较低的组织毒性，避免了通常在裸子植物中阻断转化过程的急性局部过敏反应和组织坏死（图1）。除菌株外，侵染过程中的生化微环境也影响T-DNA递送效率。银杏叶片天然含有丰富的……（原文节选至此，后续讨论内容原文未详述。）
【数据】菌株：GV3101、AGL1；AGL1背景：C58染色体；质粒：pTiBo542无毒衍生体；报告基因：RUBY、UV-GFP
编译者解读：该研究用RUBY甜菜红素可视化报告基因绕过了传统筛选标记和 destructive 检测，把银杏叶片转化效率优化到72%，方法学上胜在"可见即成功"的直观与快速。选择高毒力AGL1而非通用GV3101，对裸子植物难转化问题给出了可复制的菌株策略；DTT抑制防御反应也是针对富含次生代谢物组织的合理设计。局限在于瞬时体系无法获得稳定遗传材料，且转化效率仍受苗龄与组织限制，用于大规模筛选时通量有待提升。
参考来源
期刊：aBIOTECH（2026）
DOI：10.1016/j.abiote.2026.100107
DOI: 10.1016/j.abiote.2026.100107