来源：Endophytic Aspergillus niger and Aspergillus oryzae improve growth, antioxidant defense, and ion homeostasis in maize under salinity stress（Plant Science）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
土壤盐渍化威胁全球约8亿公顷耕地，玉米作为盐敏感作物受害尤重。本研究从辣木种子中分离到两株内生真菌MA2（黑曲霉）与MA5（米曲霉），二者在盐胁迫下仍高产IAA、脯氨酸、酚类与黄酮。200 mM NaCl胁迫下接种这两株真菌，玉米的光合色素、生长量、激素平衡与离子稳态得到恢复，MDA下降，抗氧化系统增强。主成分分析（PC1=62.40%，PC2=24.81%）清晰区分了接种与非接种处理。研究为利用内生真菌缓解作物盐害提供了可操作的微生物接种方案。
研究背景
全球约800 million公顷土地受盐渍化影响，沿海低地使用咸水灌溉进一步压缩了作物产能。盐胁迫对植物的打击是多层面的：根区高盐先引发渗透胁迫，导致气孔关闭、光合机构受损、叶绿素合成下降；Na⁺在诸多作物（包括玉米）中是盐毒害的首要离子，它干扰生化过程并挤占K⁺、Ca²⁺的吸收位点。植物对盐胁迫的响应是动态过程，取决于胁迫来源、强度及植物自身的解读方式。种子萌发与幼苗建成阶段对盐分尤为敏感，干旱半干旱地区降雨少、蒸散强，这一问题被进一步放大。在此背景下，利用内生微生物提升作物耐盐性被视为可持续的替代路径——内生真菌栖居植物组织内部，可通过分泌植物激素、渗透调节物质与次生代谢物，协同宿主应对生物与非生物胁迫。本研究即从辣木种子中筛选促生内生真菌，系统评估其在盐胁迫下对玉米生长、代谢、抗氧化与离子平衡的调控效果。
研究方法
2.1 从辣木（Moringa oleifera L.）中分离内生真菌
促生内生真菌自巴基斯坦拉合尔市（坐标31°15–31°45′N，74°0–74°39′E）采集的辣木种子中提取，方法同前人描述（Rahman et al., 2025）。为确保内生菌鉴定准确，种子经仔细解剖后，用70%乙醇表面消毒60 s、2% NaClO消毒120 s，随后用高压灭菌蒸馏水冲洗，以消除非内生微生物。消毒后的种子组织被小心切块，置于Hagem minimal培养基上、25 °C培养7天。从消毒种子组织长出的菌落被转接至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，同温度下继代培养1周。纯化的真菌分离株随后接种于Czapek培养基，30 °C、120 rpm培养1周，方法同前人（Rahman et al., 2025）。所得培养物将上清液与真菌生物量分离，保存于−70 °C用于代谢与生化分析。
【数据】种子来源：辣木，巴基斯坦拉合尔（31°15–31°45′N，74°0–74°39′E）；表面消毒：70%乙醇60 s、2% NaClO 120 s；分离培养基：Hagem minimal；分离温度：25°C；分离时间：7天；纯化培养基：PDA；纯化温度：25°C；纯化时间：1周；液体培养：Czapek，30°C、120 rpm、1周；保存温度：−70°C
2.2 真菌分离株的分子鉴定
采用DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，Valencia，CA，USA）按Zhang等（2010）所述流程从真菌细胞中提取基因组DNA。通过ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）与ITS4（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）引物（White et al., 1990）对rDNA基因ITS区测序以鉴定真菌。随后用CLUSTAL W检索并比对近缘序列。系统发育与分子进化分析通过MEGA version 'X'软件完成（Kumar et al., 2016）。
【数据】DNA提取试剂盒：DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）；引物：ITS1/ITS4；比对软件：CLUSTAL W；进化分析软件：MEGA version 'X'；原文未详述PCR体系与循环参数
2.3 内生真菌的显微与宏观表征
种子携带内生真菌的结构与形态特征通过标准光学显微技术评估。样品用Olympus双目显微镜（NSL-CX23，东京，日本）在40×与100×放大倍数下观察。为对特定真菌结构进行全面的显微分析，采用乳酸酚棉蓝染色液，流程同前人描述（Gul et al., 2023）。
【数据】显微镜：Olympus NSL-CX23；放大倍数：40×、100×；染色液：乳酸酚棉蓝；培养温度/时间：原文未详述
2.4 内生真菌代谢物筛选
采用Salkowski法评估MA2与MA5分离株的生长素（IAA）产量，按前文所述在535 nm处测定分光光度活性。实验开始时，将浓度为1 × 10⁸ spores/mL的MA5与MA2孢子悬液接入50 mL含特定组分的Czapek培养基。接种培养物在温控培养箱中、30 °C、150 rpm培养7天。培养结束后离心，上清过滤收集真菌培养滤液（FCF）。FCF酸化后用乙酸乙酯萃取、蒸干、溶于甲醇。Salkowski试剂与培养滤液混合，暗处孵育至出现红色，随后用紫外分光光度计在535 nm测定OD值。以Salkowski试剂加Czapek培养基为对照，用已知浓度IAA建立标准曲线（Benizri et al., 1998）。脯氨酸含量按前法测定，即将FCF与磺基水杨酸结合（Bates et al., 1973a）。黄酮含量按Khatiwora等（2012）方法在415 nm定量。总酚含量按前法测定（Khatiwora et al., 2012）：取1 mL MA2或MA5的FCF加入10 mL甲醇，混匀后离心；离心后加入500 µl 50% Folin–Ciocalteu试剂与2 mL 20% Na₂CO₃，混合物加热1 min，用分光光度法在650 nm记录OD值。
【数据】孢子悬液浓度：1 × 10⁸ spores/mL；培养基体积：50 mL Czapek；培养条件：30°C、150 rpm、7天；IAA检测波长：535 nm；黄酮检测波长：415 nm；总酚检测波长：650 nm；显色试剂：Salkowski试剂、Folin–Ciocalteu试剂（50%，500 µl）、Na₂CO₃（20%，2 mL）；加热时间：1 min；原文未详述标准曲线浓度梯度
2.5 植物–微生物生物测定
#### 2.5.1 真菌关联植物生物测定
玉米品种Gulabathi种子采自ARI农业研究所（白沙瓦），经彻底清洗：灭菌蒸馏水冲洗3次、70%乙醇消毒、精制水再冲洗3次。随后，播种于土壤的种子按每500 g土壤混合3 g真菌生物量的比例接种。对照植株浇灌与处理组等量的水。实验在12个塑料容器中进行，每容器直径8.5 cm、深12.5 cm，装500 g灭菌砂壤土，理化性质与Table 1一致。每处理12盆，每盆4株幼苗，每处理共120株幼苗。从MA2与MA5植株提取的孢子悬液（5 × 10⁷ spores/mL）按每株1 mL接种，每盆3粒种子，每天接种，连续7天。对照容器加入等量水。本研究的设计依据是既往研究显示玉米对盐胁迫敏感（Gul et al., 2023）。
【数据】玉米品种：Gulabathi；种子来源：ARI（白沙瓦）；土壤用量：500 g灭菌砂壤土/盆；盆规格：直径8.5 cm、深12.5 cm；真菌生物量：3 g/500 g土壤；孢子悬液浓度：5 × 10⁷ spores/mL；接种量：1 mL/株；每盆种子：3粒；接种天数：7天；每处理盆数：12盆；每盆幼苗：4株；每处理幼苗：120株
#### 2.5.2 盐胁迫处理
玉米已被认定为盐敏感植物，补充200 mM氯化钠（NaCl）后表现生长迟缓（Gul et al., 2023）。本研究中，通过引入内生真菌（黑曲霉MA2与米曲霉MA5）考察含200 mM NaCl的盐溶液对玉米生长的影响。流程为：灭菌种子在玻璃培养皿中萌发，萌发幼苗转移至混有真菌生物量的土盆，并持续接种从MA2与MA5提取的液体孢子悬液与菌丝生物量，培养10天。每株幼苗接受1 mL孢子悬液，每盆3株幼苗、1 g生物量/盆。盐处理为每天补充2 mL 200 mM NaCl，随后恢复期10天；对照植株则浇水。实验共设8个处理，含未受盐胁迫的对照。1. CK=对照；2. MA2=接种内生真菌；3. MA5=接种内生真菌；4. MA2与MA5=内生真菌联合接种；5. NaCl=盐胁迫（200 mM NaCl）；6. NaCl+MA2=盐胁迫+接种内生真菌；7. NaCl+MA5=盐胁迫+接种内生真菌；8. NaCl+MA2与MA5=盐胁迫+内生真菌联合接种。
形态与生理观测在4个时间点记录：1. 盐处理0天、真菌施用0天（8 DAG）；2. 盐处理0天、真菌施用8天（15 DAG）；3. 盐处理7天、真菌施用15天（22 DAG）；4. 盐处理后7天（恢复期）、真菌施用后20天（29 DAG）。恢复7天后记录形态、生化与生理分析结果（29 DAG）。地上部与根分离，用自来水冲洗去除土壤与杂质以估算鲜重；干重则在60 °C烘干3天后测定。
【数据】盐浓度：200 mM NaCl；盐处理量：2 mL/天；恢复期：10天；真菌培养时长：10天；孢子悬液：1 mL/株；生物量：1 g/盆；每盆幼苗：3株；处理数：8个；观测时间点：8、15、22、29 DAG；干重烘干：60°C、3天
#### 2.5.3 玉米幼苗的形态、生理、代谢与离子特征
含200 mM NaCl的盐溶液对玉米生长的影响，通过引入内生真菌（黑曲霉MA2与米曲霉MA5）从形态、生理、代谢与离子属性方面考察，所采用的分析方法见补充材料2.5.3–2.5.12。
【数据】盐浓度：200 mM NaCl；分析方法：见补充材料2.5.3–2.5.12；其余参数原文未详述
2.6 统计分析
实验设计采用因子设计……（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】设计类型：因子设计；其余参数原文未详述
研究结果
3.1 内生真菌的分离、鉴定、表征与筛选
内生真菌栖居于叶片、根、茎、种子等植物组织内部，可增强植物发育与抗性机制，以缓解生物与非生物胁迫。本研究从辣木种子获得的12株真菌分离物中，选取6株具独特特征的分离物进一步研究。此前已通过植物生物测定考察了多项生长参数。其中MA2与MA5在Czapek培养基中产生最大生物量、生长响应最强，故被选入后续植物生物测定。所选分离株（MA2与MA5）先通过菌落质地、生长模式、颜色、菌丝颜色、孢子囊颜色与孢子形态等视觉特征初步鉴定，见图1A。通过系统发育分析，内生真菌在分子水平得到表征。从真菌菌丝体分离基因组DNA，经rDNA测序识别内生菌。MA2序列同源性与黑曲霉（Aspergillus niger）相似，MA5与米曲霉（Aspergillus oryzae）相似，NCBI GenBank登录号分别为MA5 PV616999、MA2 PV616998（图1A–D）。
胁迫条件下，6株真菌分离物中MA2与MA5的培养滤液（CFs）产生相对较高的生物量与促生代谢物。Czapek培养基中培养的MA2的IAA最高达22.11 mg mL⁻¹，脯氨酸13.63 μg mL⁻¹，酚类188.1 μg mL⁻¹，总蛋白120.62 μg mL⁻¹，黄酮116.552 μg mL⁻¹，水杨酸0.76 mg mL⁻¹，总可溶性糖162.8 μg mL⁻¹；而盐条件下培养的真菌分离物产生更多IAA（28.46 mg mL⁻¹）、脯氨酸（14.89 μg mL⁻¹）、酚类（218.33 μg mL⁻¹）、总蛋白（128.59 μg mL⁻¹）、黄酮（132.552 μg mL⁻¹）、水杨酸（0.89 mg mL⁻¹）与总可溶性糖（182.38 μg mL⁻¹）。对照条件下Czapek培养基中MA5的CFs含充足IAA，即23.15 mg mL⁻¹，脯氨酸、酚类、总蛋白、黄酮、水杨酸与总可溶性糖分别为14.65 μg mL⁻¹、221.3 μg mL⁻¹、84.40 μg mL⁻¹、125.76 μg mL⁻¹、0.709 mg mL⁻¹与155.60 μg mL⁻¹。胁迫条件下MA5的CFs产生IAA 29.05 mg mL⁻¹，脯氨酸、酚类、总蛋白、黄酮、水杨酸与总可溶性糖分别为15.80 μg mL⁻¹、227.65 μg mL⁻¹、112.40 μg mL⁻¹、136.33 μg mL⁻¹、0.79 mg mL⁻¹与181.05 μg mL⁻¹（图2A–H）。
【数据】筛选分离物：12株中选6株，最终选MA2、MA5；GenBank登录号：MA2 PV616998、MA5 PV616999；MA2对照：IAA 22.11 mg/mL、脯氨酸13.63 μg/mL、酚类188.1 μg/mL、总蛋白120.62 μg/mL、黄酮116.552 μg/mL、水杨酸0.76 mg/mL、总可溶性糖162.8 μg/mL；MA2盐条件：IAA 28.46 mg/mL、脯氨酸14.89 μg/mL、酚类218.33 μg/mL、总蛋白128.59 μg/mL、黄酮132.552 μg/mL、水杨酸0.89 mg/mL、总可溶性糖182.38 μg/mL；MA5对照：IAA 23.15 mg/mL、脯氨酸14.65 μg/mL、酚类221.3 μg/mL、总蛋白84.40 μg/mL、黄酮125.76 μg/mL、水杨酸0.709 mg/mL、总可溶性糖155.60 μg/mL；MA5盐条件：IAA 29.05 mg/mL、脯氨酸15.80 μg/mL、酚类227.65 μg/mL、总蛋白112.40 μg/mL、黄酮136.33 μg/mL、水杨酸0.79 mg/mL、总可溶性糖181.05 μg/mL
3.2 盐胁迫下MA2与MA5同玉米根、叶组织的关联
盐胁迫下接种MA2与MA5的玉米生长响应优于盐胁迫下非接种植株及对照。图3A展示盐胁迫下与MA2、MA5真菌分离物关联的玉米植株表型。为进一步确认MA2与MA5在玉米根部的定殖，进行了内生菌再分离及再分离内生菌的菌落形态观察。显微评估证实MA2与MA5内生菌与接种植株根、叶组织的关联（图3B）。此外，还考察了MA2与MA5分离物对盐胁迫下玉米气孔解剖的影响。与非接种胁迫对照（SC）玉米相比，MA2与MA5分离物（单独或联合）接种使盐胁迫下气孔开度趋于适宜，表现为气孔关闭（图3C）。
【数据】处理：MA2、MA5单独及联合；盐浓度：200 mM NaCl；检测指标：内生菌再分离、菌落形态、显微定殖、气孔解剖；数值：原文未详述
3.3 盐胁迫下MA2与MA5对玉米光合特性的影响
与未胁迫对照相比，盐胁迫玉米的光合色素——叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素与类胡萝卜素——生物合成受到显著（p ≤ 0.05）抑制。叶绿素a从4.5降至2.33 mg g⁻¹ FW，叶绿素b从2.13降至1.3 mg g⁻¹ FW，总叶绿素从6.63降至3.7 mg g⁻¹ FW，类胡萝卜素从1.7降至1.25 mg g⁻¹ FW（对照 vs. 非接种NaCl胁迫植株）。相反，与各自非接种对照相比，接种MA2与MA5在正常与盐胁迫条件下均显著提高玉米四种色素的合成。具体而言，盐胁迫下MA2与MA5联合接种显著（p ≤ 0.05）提高叶绿素a（4.55 mg g⁻¹ FW）、叶绿素b（2.5 mg g⁻¹ FW）、总叶绿素（7.04 mg g⁻¹ FW）与类胡萝卜素（2.55 mg g⁻¹ FW）含量，而非接种盐胁迫对照（SC）植株相应值分别为2.3、1.31、3.67与1.18 mg g⁻¹ FW（图3D–G）。
【数据】对照→盐胁迫：叶绿素a 4.5→2.33 mg/g FW、叶绿素b 2.13→1.3 mg/g FW、总叶绿素6.63→3.7 mg/g FW、类胡萝卜素1.7→1.25 mg/g FW；MA2+MA5盐胁迫：叶绿素a 4.55 mg/g FW、叶绿素b 2.5 mg/g FW、总叶绿素7.04 mg/g FW、类胡萝卜素2.55 mg/g FW；非接种盐胁迫对照：2.3、1.31、3.67、1.18 mg/g FW；显著性：p ≤ 0.05
3.4 盐胁迫下MA2与MA5对玉米生长的影响
盐胁迫下玉米生长性能显著下降。与非接种、未胁迫对照相比，单株地上部长度（11.7 cm vs. 对照18.5 cm）、单株根长（4.5 cm vs. 对照8.8 cm）、单株地上部鲜重（0.76 g vs. 对照1.63 g）、单株地上部干重（0.39 g vs. 对照0.84 g）、单株根鲜重（0.82 g vs. 对照0.92 g）与单株根干重（0.038 g vs. 对照0.032 g）均显著（p ≤ 0.05）降低。然而，与各自未处理对照相比，MA2与MA5联合接种在两种条件下均显著（p ≤ 0.05）提高所测全部生长参数。特别是盐胁迫下MA2与MA5联合接种较非接种胁迫对照显著（p ≤ 0.05）提高玉米单株地上部长度（24.5 cm vs. 胁迫对照11.73 cm）、单株根长（11 cm vs. 胁迫对照4.5 cm）、单株地上部鲜重（2.4 g vs. 胁迫对照0.76 g）、单株地上部干重（1.22 g vs. 胁迫对照0.39 g）、单株根鲜重（1.33 g vs. 胁迫对照0.82 g）与单株根干重（0.056 g vs. 胁迫对照0.032 g）（图4A–F）。
【数据】盐胁迫 vs 对照：地上部长度11.7 vs 18.5 cm、根长4.5 vs 8.8 cm、地上部鲜重0.76 vs 1.63 g、地上部干重0.39 vs 0.84 g、根鲜重0.82 vs 0.92 g、根干重0.038 vs 0.032 g；MA2+MA5盐胁迫 vs 胁迫对照：地上部长度24.5 vs 11.73 cm、根长11 vs 4.5 cm、地上部鲜重2.4 vs 0.76 g、地上部干重1.22 vs 0.39 g、根鲜重1.33 vs 0.82 g、根干重0.056 vs 0.032 g；显著性：p ≤ 0.05
3.5 盐胁迫下MA2与MA5对初级代谢物的影响
胁迫条件下，玉米植株与生长相关的初级代谢物显著（p ≤ 0.05）下降：总蛋白（120.79 μg·g⁻¹ FW降至106.84 μg·g⁻¹ FW）、脂质（0.22 mg·g⁻¹ FW降至0.17 mg·g⁻¹ FW）以及总可溶性糖（30.32 μg·g⁻¹ FW降至28.71 μg·g⁻¹ FW），与未胁迫（NaCl）对照（C）相比。在两种情形（盐胁迫与对照）下，MA2与MA5联合接种均使玉米总脂质、糖与蛋白等初级代谢产物合成较非接种对照（C）显著升高。盐胁迫下MA2与MA5联合接种显著（p ≤ 0.05）提高初级代谢产物产量：总脂质（0.386 mg/g vs. 胁迫对照0.17 mg/g FW）、蛋白（147.54 μg/g vs. 对照106.84 μg/g FW）与总可溶性糖（50.8 μg/g vs. 对照28.71 μg/g FW），与非接种（内生菌）胁迫对照（SC）玉米相比（图5A–C）。
【数据】对照→盐胁迫：总蛋白120.79→106.84 μg/g FW、脂质0.22→0.17 mg/g FW、总可溶性糖30.32→28.71 μg/g FW；MA2+MA5盐胁迫：总脂质0.386 mg/g、蛋白147.54 μg/g、总可溶性糖50.8 μg/g；对照值：0.17 mg/g、106.84 μg/g、28.71 μg/g；显著性：p ≤ 0.05
3.6 盐胁迫下MA2与MA5对渗透调节物质合成的影响
结果显示，与未胁迫对照玉米相比，盐胁迫下渗透调节物质脯氨酸的合成与积累显著（p ≤ 0.05）增加（非接种CK植株中NaCl下0.041 mg/g FW vs. 对照条件下0.031 mg/g FW）。与各自非接种对照相比，内生菌MA2与MA5联合接种在正常与盐条件下均显著提高脯氨酸合成，脯氨酸积累最高值出现在MA2与MA5联合处理……（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】脯氨酸：NaCl 0.041 mg/g FW vs 对照0.031 mg/g FW；显著性：p ≤ 0.05；其余数值原文未详述
讨论与解读
利用内生真菌提升玉米等盐敏感作物的生长，被视为在全球盐渍环境下促进可持续作物生产的可行途径。MA2与MA5两株内生真菌改善了玉米耐盐性，逆转了盐胁迫下非接种植株生长与生物量的下降。盐分主要通过高Na⁺/Cl⁻吸收与渗透胁迫伤害植物，降低水分吸收、膨压与光合作用；而根系可在结构与遗传层面适应，限制有害离子进入。本研究中盐胁迫显著降低玉米生长响应。Na⁺的排除与运输调控对植物至关重要——生长受阻的原因之一可能是过量Na⁺导致钾、钙等额外矿质吸收下降，盐与氯水平进一步升高，造成营养失衡。盐胁迫通过扰乱Na⁺稳态、损害钾/钙吸收、诱导ROS介导的氧化损伤、减少叶片数、生物量与水势，显著抑制玉米生长并导致减产。内生真菌关联帮助植物维持……（原文节选至此）
编译者解读：该研究的方法学价值在于把"菌株筛选—代谢物定量—盆栽表型—离子/抗氧化指标—PCA"串成一条完整证据链，且代谢物筛选直接在盐条件下复测，避免了只报对照条件的常见偏倚。局限也明显：仅一个玉米品种、单盐浓度、盆栽尺度，田间验证缺失；两株真菌的定殖量未做定量，联合接种的协同机制仍停留在生理表型层面。对合成生物学而言，MA2/MA5的IAA与渗透调节物高产性状是可直接挖掘的底盘或基因元件来源。
参考来源
期刊：Plant Science（2027）
DOI：10.1016/j.plantsci.2026.113508
DOI: 10.1016/j.plantsci.2026.113508