来源：Bioengineering and physicochemical optimization of ergothioneine production by Aspergillus oryzae（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（EGT）是组氨酸的稀有含硫衍生物，在医药、食品和护肤领域应用广泛。本研究以工业丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）为底盘，先解析三个EGT合成酶（AoEgtA/B/C）的亚细胞定位，发现AoEgtB的N端113个氨基酸为内在无序区（IDR），其过表达会形成聚集体并拖累产量；随后从12株工程菌中筛出共过表达AoegtA与AoegtC的EgtACO为最优生产菌，在CZYP培养基中5天产量达699 mg/L，并进一步通过添加L-甲硫氨酸、硫酸锌、蓝光照射与重复接种将产量推至1895 mg/L，最后用马铃薯皮和甘薯皮实现低成本生产（293与308 mg/L）。
研究背景
EGT于1909年首次从麦角菌（Claviceps purpurea）中分离，后被证实存在于人及某些动物的红细胞中，但动物、人类和多数植物无法自行合成，只能从膳食中摄取并在特定组织累积。因其在神经退行性疾病、海马神经发生、年龄相关脑损伤、心血管疾病和糖尿病中的保护与治疗潜力，EGT被称为"长寿维生素"。2017年获得GRAS地位后，凭借强抗氧化与抗衰老特性，EGT成为众多护肤品中的多功能成分，尤其在修复皮肤屏障和刺激胶原合成方面发挥作用；其抗氧化活性通过中和自由基、清除活性氧保护细胞免受氧化应激。在食品工业中，EGT同样具备应用前景。面对日益增长的需求，利用微生物进行天然生产成为优化方向，而米曲霉凭借强大的生物工程潜力被视为有吸引力的生产工具。本研究即从基因组与理化因素两个层面考察其对米曲霉EGT产量的影响。
研究方法
2.1 DNA克隆与重组米曲霉菌株的构建
DNA克隆以野生型米曲霉RIB40菌株的基因组DNA为模板。本研究所用米曲霉菌株汇总于表S1。含PAotef1、egfp和AosC的质粒载体通过反向PCR扩增，所用引物为KI1（5’-CATAGTTGATAATTCACTGGCCG-3’）和KI2（5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’），使用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶（Takara）。随后以引物KI3（5’-GACGAGCTGTACAAGATGTCACCGTTGGCTCTTTC-3’）和KI4（5’-GAATTATCAACTATGCTAAAGATCCCGCACTAGGCG-3’）、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara）扩增AoegtA，用In-Fusion HD Cloning Kit（Takara）与上述载体连接，构建pPtGEgAS。类似地，以KI5（5’-GACGAGCTGTACAAGATGATGTCTAATGTTACCCAATCAGCC-3’）和KI6（5’-GAATTATCAACTATGTTAATGTTGACTCCATTCGATCGTG-3’）扩增AoegtB，以KI7（5’-GACGAGCTGTACAAGATGACCACACCCTTCGGAG-3’）和KI8（5’-GAATTATCAACTATGTCAAATCTTCGCAGAAGAAACCC-3’）扩增AoegtC，分别与载体连接构建pPtGEgBS和pPtGEgCS。将pPtGEgAS、pPtGEgBS和pPtGEgCS分别转化NSlDN1菌株，得到GEgtA、GEgtB和GEgtC菌株。接下来为去除egfp，以pPtGEgAS为模板、引物KI1和KI14（5’-CGCACCACCTTCAAAATGTCACCGTTGGCTCTTTCTC-3’）进行反向PCR，再用In-Fusion连接所得片段，构建pPtEgAS。类似地，以pPtGEgBS和pPtGEgCS为模板，分别用引物KI1/KI15（5’-CGCACCACCTTCAAAATGATGTCTAATGTTACCCAATCAGC-3’）和KI1/KI16（5’-CGCACCACCTTCAAAATGACCACACCCTTCGGAG-3’）制备pPtEgBS和pPtEgCS。将pPtEgAS、pPtEgBS和pPtEgCS分别转化NSlDN1菌株，产生EgtAO、EgtBO和EgtCO菌株。此外，通过将AosC标记替换为niaD和ptrA标记，制得pPtEgBN、pPtEgCN和pPtEgCP。随后用pPtEgBN和pPtEgCN转化EgtAO菌株，分别生成EgtABO和EgtACO菌株。最后用pPtEgCP转化EgtABO菌株，生成EgtABCO菌株。
为将EGFP融合至C端，以pPtEgAN为模板、引物KI1和KI25（5’-CTAAAGATCCCGCACTAGGCG-3’）反向PCR扩增载体。随后用引物KI28（5’-GTGCGGGATCTTTAGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’）和KI31（5’-GAATTATCAACTATGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’）扩增egfp，用In-Fusion与上述载体连接，生成pPtEgAGN。类似地，AoegtB载体用引物KI1和KI26（5’-TTAATGTTGACTCCATTCGATCGTG-3’）扩增，AoegtC载体用引物KI1和KI27（5’-TCAAATCTTCGCAGAAGAAACCCC-3’）扩增，分别与egfp连接生成pPtEgBGN和pPtEgCGN。将pPtEgAGN、pPtEgBGN和pPtEgCGN分别转化NSlDS1菌株，生成EgtAG、EgtBG和EgtCG菌株。
pPtEgBS用引物FR19（5’-TTTGAAGGTGGTGCGAACTTTG-3’）和FR40（5’-ATGATGTCTAATGTTACCCAATCAGC-3’）及PrimeSTAR MAX DNA聚合酶反向PCR扩增。随后用引物FR38（5’-CGCACCACCTTCAAAATGGTCAGCAAGGGCGA-3’）和FR39（5’-AACATTAGACATCATCTTGTACAGCTCATCCATGCC-3’）扩增mcherry，用In-Fusion与上述载体连接，构建pPtChEgBS。接着，含PAotef1、mcherry和AosC的质粒载体用引物FR19和FR42（5’-ATGGTCAGCAAGGGCGAAG-3’）及PrimeSTAR MAX DNA聚合酶反向PCR扩增。然后用引物FR40和FR41（5’-GCCCTTGCTGACCATATGTTGACTCCATTCGATCGTG-3’）扩增AoegtB，用In-Fusion与上述载体连接，构建pPtEgBChS。为去除AoEgtB的内在无序区（IDR），用引物FR19和FR43（5’-CGCACCACCTTCAAAATGGGAACGCGACCGATCTATCT-3’）进行反向PCR，经In-Fusion连接，构建pPtEgBΔIDRChS。类似地，为删除AoEgtB的半胱氨酸脱硫酶（CD）结构域，用引物FR42和FR44（5’-GCCCTTGCTGACCATTTGGTCCATGACAGTGGCC-3’）进行反向PCR，经In-Fusion连接，构建pPtEgBΔCDChS。将pPtChEgBS、pPtEgBChS、pPtEgBΔIDRChS和pPtEgBΔCDChS分别转化NSlD1菌株，创建ChEgtB、EgtBCh、EgtBΔIDRCh和EgtBΔCDCh菌株。
【数据】模板：野生型米曲霉RIB40基因组DNA；质粒：pPtGEgAS、pPtGEgBS、pPtGEgCS、pPtEgAS、pPtEgBS、pPtEgCS、pPtEgBN、pPtEgCN、pPtEgCP、pPtEgAGN、pPtEgBGN、pPtEgCGN、pPtChEgBS、pPtEgBChS、pPtEgBΔIDRChS、pPtEgBΔCDChS；菌株：GEgtA、GEgtB、GEgtC、EgtAO、EgtBO、EgtCO、EgtABO、EgtACO、EgtABCO、EgtAG、EgtBG、EgtCG、ChEgtB、EgtBCh、EgtBΔIDRCh、EgtBΔCDCh；删除片段：AoEgtB N端IDR、CD结构域；原文未详述：酶用量与PCR循环参数
2.2 培养条件
米曲霉菌株在Czapek-Dox（CD）培养基上于30°C培养5天。按需补充0.0015%甲硫氨酸以弥补菌株营养缺陷。培养后向平板加入10 mL无菌0.01% Tween 20（SIGMA），用无菌涂布器轻缓混匀，将分生孢子收集于15 mL离心管（VIOLAMO），经Miracloth（Merck）过滤。混合物离心（2000 rpm，5 min），弃上清，向沉淀中加入1 mL无菌水混匀，4°C保存。将10⁶/100 μL分生孢子接种至20 mL DPY培养基（2%糊精、1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%磷酸二氢钾、0.05%七水硫酸镁）或Czapek酵母胨培养基（CZYP：1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%酵母提取物、0.3%硝酸钠、0.1%磷酸二氢钾、0.05%七水硫酸镁、0.05%氯化钾、0.001%七水硫酸亚铁[31]）中，置于100 mL三角瓶，150 rpm培养5天。
【数据】培养基：CD、DPY、CZYP；温度：30°C；时间：5天；甲硫氨酸：0.0015%；Tween 20：0.01%、10 mL；接种量：10⁶/100 μL；装液量：20 mL；转速：150 rpm；离心：2000 rpm、5 min；保存温度：4°C
2.3 HPLC提取与定量EGT
真菌菌丝经Miracloth过滤，用MilliQ水多次洗涤以去除残留生产培养基。去除MilliQ后，将载有菌丝的Miracloth冻干24 h。取0.1 g干燥菌丝置于15 mL管中，加2 mL无菌水，搅拌，98°C加热15 min。混合物于4°C、15,000 rpm离心5 min，回收上清。最后上清经0.45 μm滤膜过滤，收集滤液。EGT定量采用Prominence系统（Shimadzu），配备光电二极管阵列检测器（SPD-M20A）和COSMOSIL填充柱HILIC 4.6 × 250 mm（Nacalai tesque）。流动相使用前超声脱气30 min，为10 mM乙酸铵（A）和100%乙腈（B）。梯度程序：0 min，80% B；15 min，60% B；15.1–20 min，100% B；20.1–25 min，0% B；25.1–35 min，80% B。检测在30°C、流速1 mL/min、检测波长254 nm下进行。EGT标准品（Enzo Life Sciences BML-FR111）用于峰识别。
【数据】菌丝用量：0.1 g；提取液：2 mL无菌水；加热：98°C、15 min；离心：15,000 rpm、4°C、5 min；滤膜：0.45 μm；色谱柱：HILIC 4.6 × 250 mm；流动相：10 mM乙酸铵/100%乙腈；流速：1 mL/min；柱温：30°C；检测波长：254 nm；冻干：24 h
2.4 荧光显微镜观察
荧光显微镜采用ECLIPSE Ti2-A倒置显微镜（Nikon），配备CFI Plan Apo Lambda 100 ×物镜（数值孔径1.45）、DS-Qi2数码相机、LED-DA/FI/TX-A三带滤光片（Semrock：激发FF01–378/474/575；发射FF01–432/523/702；二色镜FF409/493/596-Di02）、LED光源X-LED1及微分干涉相差（DIC）。图像数据由NIS Elements AR软件（Nikon）采集。将约10⁴个观察菌株的分生孢子接种至200 µL相应液体培养基中，培养基置于多聚赖氨酸包被的玻璃底培养皿（Matsunami），30°C过夜培养后进行荧光显微镜观察。
【数据】孢子接种量：约10⁴个；培养基体积：200 µL；温度：30°C；时间：过夜；物镜：100 ×、NA 1.45；培养皿：多聚赖氨酸包被玻璃底
2.5 结构预测分析
为预测EGT合成酶的三维结构、活性位点与内在无序区，使用AlphaFold（https://alphafold.ebi.ac.uk/）、InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）和IUPred3（https://iupred3.elte.hu/）[32]。AoEgtB（UniProt登录号A0A1S9DH15）的预测结构由AlphaFold蛋白结构数据库生成[33,34]。使用InterPro 109.0版分析，在"Applications"栏下选择全部选项进行结构域预测[35,36]。IUPred分析部分原文节选未完整给出。
【数据】数据库：AlphaFold、InterPro 109.0、IUPred3；蛋白：AoEgtB；UniProt：A0A1S9DH15；原文未详述：IUPred具体参数设置
研究结果
3.1 米曲霉EGT合成酶的亚细胞定位分析
EGT生产是一个多因素过程，受影响生产菌株及其产EGT能力的多种理化参数调控。生物工程虽是增强EGT生物合成的有力长期策略，但许多理化培养条件仍是提高产量的基础手段，控制培养条件可进一步放大生物工程取得的进展。为此，本研究先基于米曲霉EGT合成酶的亚细胞定位分析开展生物工程策略，再从构建的转化子中筛选最高产菌株，随后考察一系列理化参数以优化EGT生产。
近期，AoEgt1和AoEgt2被鉴定为米曲霉中粗糙脉孢菌（N. crassa）Egt-1和Egt-2的直系同源物[5,29]。本研究进一步鉴定出Egt-2的一个新米曲霉直系同源物，命名为AoEgtB（AO090020000619）。此外，将米曲霉Egt-1和Egt-2的直系同源物分别命名为AoEgtA（AO090012000265）和AoEgtC（AO090026000291）。首先，为分析这些合成酶的亚细胞定位，将EGFP融合至AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC的N端或C端，构建在Aotef1启动子下过表达这些融合蛋白的菌株。荧光显微镜定位分析显示，AoEgtA和AoEgtC主要定位于细胞质（图1A）。相反，AoEgtB在N端融合EGFP时定位于细胞质，而C端融合时则发生聚集（图1A）。
接下来对AoEgtB的定位作进一步分析。由于已知EGFP通常形成弱二聚体，推测AoEgtB-EGFP可能因融合蛋白结构而形成聚集体[44]。因此，改用单体mCherry作为荧光融合蛋白分析AoEgtB定位；与EGFP情形相同，AoEgtB-mCherry在细胞内观察到聚集（图S1A）。对AoEgtB-mCherry的延时观察显示，点状结构反复发生融合与分离（图S1B）。这些特性是相分离结构的特征，提示AoEgtB-mCherry形成此类结构。基于AoEgtB的一级结构进行三级结构预测，结果提示AoEgtB N端113个氨基酸残基不形成特定三维结构（图1B和1C）。此外，内在无序区（IDR）预测表明AoEgtB N端113个氨基酸残基确为IDR（图1D）。因此，删除AoEgtB N端113个氨基酸残基并将mCherry融合至C端观察时，蛋白均匀定位于细胞质（图1E）。进一步发现，仅将AoEgtB的IDR区域融合至mCherry即可导致聚集体形成（图1E）。这些结果表明，AoEgtB N端区域的IDR是聚集体形成所必需且充分的。
【数据】基因：AoegtA（AO090012000265）、AoEgtB（AO090020000619）、AoEgtC（AO090026000291）；IDR长度：N端113个氨基酸残基；融合标签：EGFP、mCherry；启动子：Aotef1；观察条件：30°C过夜；聚集体行为：点状结构反复融合与分离
3.2 生产菌株筛选与EGT生产培养条件
本研究构建了在米曲霉中单独、两两或三个一组过表达各EGT合成基因（含或不含EGFP融合）的菌株。共构建12株菌，在DPY和CZYP两种不同生产培养基上测试其EGT生产能力（表1）。结果所有菌株均表现出不同的EGT生产能力。过表达AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC的EgtABCO菌株，其EGT产量低于过表达AoEgtA和AoEgtC的EgtACO菌株。推测这是由于AoEgtB过表达引起的IDR效应导致聚集体形成，限制了细胞内酶促反应可用空间，阻碍了高效EGT生产。事实上，EgtACO菌株在DPY和CZYP培养基中EGT产量最高（分别为476.5和699 mg/L）。CZYP培养基中EGT产量更高可归因于硝酸钠、氯化钾和硫酸亚铁的存在，以及其组分丰富，实现了碳摄取与双重氮同化的平衡（有机氮来自酵母提取物和蛋白胨，无机氮来自硝酸钠）。此外，CZYP含可作为酶辅因子的金属以及维持渗透稳定性所需的氯化钾，从而增强酶活性并最终提高EGT产量。
培养周期是影响真菌次级代谢产物生产的关键因素。尤其随培养期延长，代谢物开始累积，营养物质被消耗。如表S2所示，延长培养期对EGT生产有负面影响，无论使用何种培养基，EgtACO菌株均在培养5天后记录到最高浓度。然而CZYP培养基中的EGT产量始终高于DPY培养基。此外，干重随培养期延长而下降。至第7天，营养物质耗竭，自溶开始，数天后形成孢子并进入饥饿状态，对EGT生产产生负面影响。这与先前研究一致：由于第6天进入死亡期，5天是米曲霉生产脂肪酸的最佳收获期[45]。
【数据】菌株数：12株；培养基：DPY、CZYP；EgtACO产量：DPY 476.5 mg/L、CZYP 699 mg/L；最优培养期：5天；EgtABCO产量：低于EgtACO；干重：随培养期延长下降；自溶起始：第7天；死亡期：第6天（文献[45]）
3.3 米曲霉与乳酸菌共培养对EGT生产的影响
与细菌共培养，尤其是与乳酸菌（LAB）共培养，因其对真菌代谢产物生产的影响而成为常见研究策略。竞争与共存可提高酶活性、提升蛋白水平，有时还产生新代谢物[46]。先前研究中，米曲霉与植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）共培养获得最高氨基酸产量[47]。另有报道，米曲霉与L. plantarum共培养增强了酶生产力和发酵能力[48]。另一方面，有研究描述米曲霉Huniang 3.042（作为曲的主要生产菌）与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）WT9及黑曲霉（A. niger）3.350共培养，增强了酶活性并提高了功能成分含量[49]。本研究中，米曲霉EgtACO菌株分别与三种不同乳酸菌属共培养，即植物乳植杆菌JCM 1149、戊糖片球菌JCM 5885和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）JCM 7638。共培养选用DPY培养基而非CZYP培养基，因为DPY培养基中观察到更好的细菌生长（植物乳植杆菌JCM 1149、戊糖片球菌JCM 5885和乳酸乳球菌JCM 7638的OD600分别为1.65 ± 0.17、1.58 ± 0.18和1.43 ± 0.07，而CZYP培养基中三者OD600分别为1.60 ± 0.18、1.44 ± 0.15和1.01 ± 0.12）。暗条件培养结果显示，共培养使EGT产量略有下降（表2）。这可能归因于细菌快速生长消耗营养物质和氨基酸前体，轻微影响其供真菌利用及EGT生产。这一可忽略的变化表明，在这些条件下共培养未对EGT生产产生实质性抑制。蓝光对EGT生产的影响……（原文节选至此中断）。
【数据】共培养菌株：EgtACO + 植物乳植杆菌JCM 1149、戊糖片球菌JCM 5885、乳酸乳球菌JCM 7638；培养基：DPY；OD600：DPY中1.65 ± 0.17、1.58 ± 0.18、1.43 ± 0.07；CZYP中1.60 ± 0.18、1.44 ± 0.15、1.01 ± 0.12；共培养结果：EGT产量略降；原文未详述：共培养具体产量数值（见表2）
3.4 硫酸锌、L-甲硫氨酸、蓝光与重复接种的优化（据摘要与图注）
在生产培养基中补充硫酸锌可提高EgtACO菌株的EGT产量。培养在30°C、150 rpm、黑暗条件下好氧进行5天。
补充L-甲硫氨酸或硫酸锌均改善EGT生产（分别为1468.5或1565 mg/L）。此外，重复接种生产菌株EgtACO并结合蓝光培养是EGT生产的最优条件（1895 mg/L）。
【数据】L-甲硫氨酸添加产量：1468.5 mg/L；硫酸锌添加产量：1565 mg/L；重复接种+蓝光产量：1895 mg/L；培养条件：30°C、150 rpm、黑暗、5天（硫酸锌实验）
3.5 利用农业废弃物经济生产EGT
最后，在最优培养条件下利用农业废弃物——马铃薯皮和甘薯皮，实现了米曲霉EgtACO菌株的低成本EGT生产（分别为293和308 mg/L）。米曲霉EgtACO菌株在DPY（对照1）或CZYP培养基（对照2）中培养，30°C好氧静置培养5天。
【数据】废弃物：马铃薯皮、甘薯皮；产量：马铃薯皮293 mg/L、甘薯皮308 mg/L；对照：DPY（对照1）、CZYP（对照2）；培养：30°C、静置、5天
讨论与解读
本研究围绕米曲霉EGT生产，从基因组与理化两个层面展开优化。核心发现是AoEgtB含N端IDR，其过表达通过形成聚集体对EGT生产产生不利影响——这解释了为何三基因过表达的EgtABCO反而不及双基因的EgtACO。与乳酸菌共培养虽未提升EGT产量，但广谱抗菌活性不抑制生产菌生长，提示细菌素有助于降低长期培养的污染风险。据作者所知，这是首次利用乳酸菌共培养与重复接种优化EGT生产的报道。添加L-甲硫氨酸或硫酸锌分别将产量提升至1468.5与1565 mg/L，重复接种结合蓝光达1895 mg/L，而马铃薯皮与甘薯皮分别提供293与308 mg/L的低成本路线。作者鼓励开展进一步研究以推动这些策略的规模化应用。
编译者解读：该研究的亮点在于把"定位—结构—产量"串成一条线：先通过荧光融合锁定AoEgtB的IDR聚集问题，再据此取舍基因组合，避免了盲目叠加表达盒的常见陷阱。理化优化部分（金属离子、光照、重复接种）成本低、易放大，对工业化有直接参考价值。局限也明显：废弃物产量较优化培养基下降近一个数量级，且共培养与蓝光协同机制尚未在节选中给出分子层面解释。对合成生物学而言，IDR可作为底盘表达盒设计的"负调控元件"纳入考量。
参考来源
期刊：New Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.09.002
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.09.002