来源：Fumagillin, an antimicrobial compound isolated from jute endophytic fungi Aspergillus fumigatus MBL_F107（The Microbe）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
多重耐药菌的快速出现使新型抗生素研发迫在眉睫。本研究从孟加拉国本地黄麻茎组织中分离到一株内生真菌MBL_F107，经形态学与ITS序列系统发育分析鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。以乙酸乙酯萃取发酵液、经反相HPLC纯化后，通过FTIR、LC-ESI-MS及一维/二维NMR完成结构解析，确证活性化合物为夫马洁林（fumagillin），单同位素质量为458.2 Da。该化合物对MRSA及多种革兰氏阳性、阴性菌均具活性，并表现出抗植物病原真菌能力；在100 °C及pH 4.0–10.6范围内保持活性。报告菌株β-半乳糖苷酶实验提示其抑制蛋白质合成，FE-SEM观察到靶细胞明显形变。这是首次从黄麻内生烟曲霉中分离到夫马洁林。
研究背景
全球抗生素耐药病例持续攀升，临床上60–70%的医院分离金黄色葡萄球菌菌株已被发现为多重耐药。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）被WHO列为优先病原体，其多重耐药性、高死亡率以及在医疗机构与社区环境中的广泛流行构成全球健康威胁。寻找新抗生素及减少耐药感染传播的创造性途径已成当务之急。
内生菌因能抑制植物病原菌、促进植物在逆境中定植与生长而备受关注。这类以细菌和真菌为主的微生物栖居于植物组织内，通常不引起可见病害症状，而是与宿主建立共生关系；它们可通过上调防御相关基因触发植物系统抗性，增强植物对病原体的先天免疫。内生真菌还被公认为结构多样性生物活性次级代谢产物的高产者，具有抗菌等多种活性。本研究即以黄麻内生真菌为对象，旨在提取、纯化并表征其抗菌化合物，评价其对MRSA及其他菌株的生物活性。
研究方法
2.1 真菌分离与鉴定
烟曲霉MBL_F107分离自孟加拉国本地采集的黄麻。取靠近根部的幼嫩黄麻茎，流水下彻底冲洗以去除附着土壤与碎屑。将茎切成小段，浸入70%乙醇1 min进行表面消毒，随后浸入3%次氯酸钠5 min，再于70%乙醇中二次漂洗30 s（Zhao et al. 2012）。组织随后用无菌蒸馏水冲洗3至5次，在无菌条件下于无菌滤纸上干燥。然后置于含氨苄青霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，28 °C培养箱中培养4天。为验证表面消毒程序的有效性，将最终冲洗水涂布于PDA平板，检查有无污染菌生长。
真菌通过形态学与分子方法表征。形态学表征时，先用乳酸酚对真菌染色，再用EVOS™ FL彩色成像系统（40倍放大）观察。记录烟曲霉的关键诊断特征，包括单列瓶梗、柱状分生孢子头以及表面具细粗糙纹的分生孢子。
为确认分类学身份，进行分子分析。基因组DNA用酚-氯仿法提取，随后经硅胶柱纯化。真菌通用条形码内转录间隔区（ITS）用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）经PCR扩增。PCR反应体积50 µL，含25.0 µL DreamTaq Green Master Mix（Thermofisher Scientific，美国）、2.5 µL 10 µM引物对、500 ng DNA模板，终体积50 µL用无核酸酶水补足。PCR循环条件为：95 °C初始变性5 min，随后35个循环的95 °C变性30 s、56 °C退火30 s、72 °C延伸40 s，最后72 °C终延伸5 min。扩增产物用FavorPrep PCR Purification Mini Kit（Favorgen，台湾）纯化，经Sanger测序，所得一致序列与NCBI ITS数据库比对。
为确定菌株MBL_F107的精确分类位置，从NCBI获取有效发表曲霉属物种的参考ITS序列，以Rhodotorula dairenensis和Fusarium solani为外群为树定根。系统发育树用MEGA12（Kumar et al. 2024）中实现的两种不同算法重建。多序列比对用ClustalW完成。最大似然（ML）树用Tamura-Nei核苷酸替换模型推断（Larkin et al. 2007）。进化分支支持率用1000次重复的bootstrap分析评估。所得系统发育树用iTOL可视化与格式化（Letunic and Bork, 2024）。
【数据】菌株：Aspergillus fumigatus MBL_F107；表面消毒：70%乙醇1 min、3%次氯酸钠5 min、70%乙醇30 s；培养基：PDA+氨苄青霉素；温度：28 °C；时间：4天；PCR体积：50 µL；模板DNA：500 ng；引物浓度：10 µM；变性：95 °C 5 min；循环：35次（95 °C 30 s、56 °C 30 s、72 °C 40 s）；终延伸：72 °C 5 min；bootstrap：1000次重复；序列数：53条
2.2 发酵、提取与化合物纯化
菌株MBL_F107在PDA培养基上28 °C培养4天。取一小块琼脂块接入1 L Erlenmeyer瓶，加入马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）。肉汤在摇床中180 rpm、28 °C培养14天。培养物经滤纸（Whatman® Schleicher & Schuell无灰）过滤，收集滤液。向滤液中加入等体积乙酸乙酯萃取胞外代谢产物，随后置于摇床180 rpm振荡6 h。用分液漏斗收集胞外代谢产物的有机相，转入500 mL圆底烧瓶。溶剂（乙酸乙酯）用旋转真空蒸发仪（IKA® RV 10）在250 psi压力、35 °C下蒸发，随后冻干。收集干燥的固体胞外提取物，溶于100%甲醇与DMSO备用。
纯化通过Thermo Fisher Ultimate-3000反相HPLC在Phenomenex Luna 5 u C18柱（250 × 4.00 mm，5微米，孔径100 Å）上进行，流速1.0 mL/min，采用ACN/TFA水梯度洗脱（ACN：0 min：30%；5 min：30%；25 min：70%；30 min：70%；35 min：30%；40 min：30%）。用HPLC再纯化以确认，流速0.3 mL/min，ACN/TFA水梯度洗脱（ACN：0 min：30%；5 min：30%；10 min：70%；15 min：78%；40 min：87%；45 min：90%；47 min：30%；50 min：30%）。馏分用冻干机干燥，纯化化合物溶于甲醇与DMSO备用。
【数据】培养基：PDA/PDB；培养温度：28 °C；固体培养时间：4天；液体培养：180 rpm、28 °C、14天；萃取溶剂：乙酸乙酯（等体积）；振荡萃取：180 rpm、6 h；蒸发压力：250 psi；蒸发温度：35 °C；色谱柱：Phenomenex Luna 5 u C18（250 × 4.00 mm，5 µm，100 Å）；流速：1.0 mL/min（再纯化0.3 mL/min）；梯度：ACN 30%→70%→30%
2.3 化合物的FTIR、LC-ESI-MS与NMR波谱数据
纯化化合物的FT-IR用IR Prestige-21傅里叶变换红外分光光度计（Shimadzu，日本）记录，以确定存在的官能团。化合物的ESI MS分析用Agilent 6400 Series Triple Quadrupole LC/MS系统完成。NMR谱在Bruker Ascend 600上以CD3OD为溶剂采集。1H NMR在600 MHz采集，13C NMR与DEPT-135在150 MHz记录。化学位移（δ）以百万分之一（ppm）表示，耦合常数（J）以赫兹（Hz）报告。另记录二维NMR（COSY、NOESY、TOCSY、HSQC、HMBC）谱用于详细结构分析。
【数据】仪器：IR Prestige-21 FTIR、Agilent 6400 Triple Quadrupole LC/MS、Bruker Ascend 600；溶剂：CD3OD；1H NMR：600 MHz；13C NMR/DEPT-135：150 MHz；二维谱：COSY、NOESY、TOCSY、HSQC、HMBC
2.4 生物活性评价
#### 2.4.1 抗菌与抗真菌活性
粗提物与纯化化合物的生物活性用琼脂孔扩散法在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）（Oxoid）培养基上针对一系列革兰氏阳性与阴性菌检测，包括Staphylococcus simulans 22、Staphylococcus aureus SG511、Staphylococcus carnosus TM300、Micrococcus luteus DSM1790、Lactococcus lactis NCTC497、E. coli BL21和Shigella flexneri。纯化化合物的生物活性还针对MRSA检测。对上述细菌以及Bacillus subtilis Plial和Bacillus subtilis PyheI测定MIC，供后续实验使用。
为测定抗真菌活性，将纯化化合物与马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Oxoid）培养基混合。取5 mL含纯化化合物的PDA倒入三隔板培养皿的每一隔室，待其凝固。随后在各隔室接种病原真菌（Macrophomina phaseolina、Aspergillus niger）。所有实验均做双份。
【数据】培养基：TSA（细菌）、PDA（真菌）；测试菌：S. simulans 22、S. aureus SG511、S. carnosus TM300、M. luteus DSM1790、L. lactis NCTC497、E. coli BL21、S. flexneri、MRSA、B. subtilis Plial、B. subtilis PyheI；真菌：M. phaseolina、A. niger；PDA用量：5 mL/隔室；重复：双份
#### 2.4.2 热稳定性与pH稳定性测定
纯化化合物用热循环仪（ProFlex PCR system，Thermo Fisher Scientific）在不同温度（30 °C、37 °C、55 °C和100 °C）加热20 min。随后针对革兰氏阳性菌S. aureus SG511检测热处理后化合物的活性，并进行Re-HPLC以确认化合物稳定性。类似地，为测定pH对生物活性的影响，将化合物分别溶于乙酸盐缓冲液（pH 4.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和碳酸氢盐缓冲液（pH 10.6）中，37 °C孵育4 h。随后针对革兰氏阳性菌S. aureus SG511检测活性，并进行Re-HPLC以确认化合物稳定性。
【数据】加热温度：30 °C、37 °C、55 °C、100 °C；加热时间：20 min；测试菌：S. aureus SG511；缓冲液pH：4.0、7.4、10.6；孵育：37 °C、4 h；验证方法：Re-HPLC
2.5 作用机制
#### 2.5.1 作用模式评估
为确定化合物对革兰氏阳性菌Micrococcus luteus DSM1790的作用模式（抑菌还是杀菌），在细菌生长曲线对数中期施加8×MIC。处理与未处理样品每2 h测定600 nm光密度（OD600），持续26 h。同时在各时间点通过系列稀释与平板计数测定活菌数，以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示。所有实验做三次独立生物学重复（n = 3）。数据以平均值±标准差表示。
【数据】测试菌：M. luteus DSM1790；剂量：8×MIC；生长阶段：对数中期；OD600监测：每2 h、共26 h；活菌计数：CFU/mL；重复：n = 3；统计：mean ± SD
研究结果
3.1 分离内生真菌的鉴定
在EVOS™ FL彩色成像系统40倍放大下可见真菌柱状分生孢子头、分生孢子梗、孢子与菌丝（补充图S1）。对真菌内生菌分离株MBL_F107的一致序列进行BLASTn搜索，初步比对显示与曲霉属成员高度序列相似。为精确确定其分类位置并解析属内进化关系，基于最终包含53条核苷酸序列的数据集，用最大似然（ML）法重建了综合多分类群系统发育树。在ML树中，该分离株与Aspergillus fumigatus ATCC 1022及Aspergillus oerlinghausenensis CBS 139183聚于一个独立单系分支。具体而言，MBL_F107与A. fumigatus ATCC 1022形成姐妹群关系，获得97.4%的极高bootstrap支持值（图1）。外群Rhodotorula dairenensis与Fusarium solani成功为树定根，确认了所评价曲霉属物种的单系性。节点分支处的高bootstrap值（97.4%）强烈提示分离株MBL_F107可被确信地鉴定为Aspergillus fumigatus。
【数据】序列数：53条；方法：ML（Tamura-Nei模型）；bootstrap：97.4%；参考菌株：A. fumigatus ATCC 1022、A. oerlinghausenensis CBS 139183；外群：R. dairenensis、F. solani；放大倍数：40×
3.2 纯化化合物的结构表征
分离的活性化合物在335和351 nm处显示特征紫外吸收（补充图S2）。ATR-FTIR显示特征性羟基、烷基、酮与烯烃伸缩振动（补充图S3）。ESI-MS显示准分子离子m/z 459.1 [M + H]⁺和457.2 [M–H]⁻，与分子量458.2 Da一致（补充图S4A、S4B）。分子式C26H34O7由13C NMR支持，显示26个碳，其中21个为质子化碳（DEPT-135；补充图S7）。
1H NMR分析（补充图S5）显示三个脂肪族甲基（δ 1.76、1.68、1.20）、三个亚甲基（δ 1.92、2.21、2.15）和一个脂肪族次甲基（δ 1.98）。δ 2.56、2.99处的信号归属为环氧基团质子，δ 3.41提示毗邻醚基团的质子。δ 5.25（C20）处信号属于连接双键的质子，δ 5.7（C11）提示毗邻（-COOH）基团的质子。C2、C9处质子化学位移为δ 6.05、5.98，为连接-COOH基团的双键。由13C NMR数据，δ 7.39、7.34、6.79、6.75、6.62、6.62处信号提示含共轭双键的链（C2至C9）。对13C（补充图S6）、DEPT-135（补充图S7）和HSQC（补充图S11）谱的详细分析表明存在羧基碳（δ 170.2，C1）、羰基碳（δ 167.7，C10），以及10个sp²杂化碳（δ 145.5、145.4、141.0、140.6、136.0、135.1、134.9、124.1、123.6、119.8）、15个sp³杂化碳，其中2个R=CH−O−（δ 80.8、68.1、62.4）、3个RC−O−（δ 60.6、60.5）。质子与碳NMR数据同参考数据的比较见表1。
1H-1H COSY谱（补充图S8）提示跨越C2–C9碳的线性链存在强相关，H2与H3、H3与H4、H4与H5、H5与H6、H6与H7、H7与H8及H8与H9之间的相关确认了该片段质子的顺序排列。在六元环（C11-C16）内，H13与H12、H12与H11、H11与H16、H16与H15之间COSY相关明显，确立了该环系的环状连接。C18-C20之间观察到的额外相关提示另一条侧链。所有观察到的COSY相关示于图2，全面展示了分子内质子-质子相互作用。
在1H-13C HMBC谱（补充图S12）中，观察到许多异核（1H对13C）相关。H2/H3与C1以及H4与C3/C2/C6、H5与C3/C7、H8与C6/C10、H9与C10/C7之间的相关提示含10个碳的长侧链。H13/H15与C14以及H16/H15与C11、H15与C16之间的相关证明6碳同环。H26与C14相关揭示连接六元环的环氧乙烷，H25/H16与C16/C25之间相关产生连接六元环的甲氧基甲基。H24与C17、C15、C18以及H18与C15、H19与C17/C20/C18、H23/H22/H19与C21、H22/H23与C20之间相关证明另一条连接六元环的侧链。所有HMBC相关及化合物最终结构描绘于图2，详细呈现了确认分子骨架的关键异核相互作用。化合物结构解析最初由参考质子与碳NMR数据（Halász et al. 2000）引导，提示纯化化合物为夫马洁林。为进一步验证该归属，包括COSY、HSQC和HMBC在内的综合二维NMR分析提供了图2所示质子与碳环境间的详细相关。
【数据】UV吸收：335、351 nm；ESI-MS：m/z 459.1 [M+H]⁺、457.2 [M–H]⁻；分子量：458.2 Da；分子式：C26H34O7；碳数：26（21个质子化）；羧基碳：δ 170.2（C1）；羰基碳：δ 167.7（C10）；sp²碳：10个；sp³碳：15个；1H NMR：600 MHz；13C NMR：150 MHz
3.3 抗菌特性评价
真菌提取物对革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌均显示生物活性。37 °C过夜孵育后，提取物周围可见清晰抑菌圈。夫马洁林在反相HPLC中的保留时间为24.91 min（补充图S2）。夫马洁林对一系列革兰氏阳性与阴性菌显示活性（表S1）。尤须指出，其对革兰氏阳性菌有活性。夫马洁林对一系列细菌的MIC见表2和补充图S13。此外，其对MRSA显示生物活性。本研究发现夫马洁林有效抑制MRSA等耐药菌——MRSA是许多人类难治性感染的元凶，对广谱抗生素显示耐药（Siddiqui and Koirala, 2023）。此外，其对Macrophomina phaseolina和Aspergillus niger等病原体表现出强效抗真菌活性（补充图S14）。Macrophomina phaseolina是一种全球分布的土传真菌，可侵染100多科500余种植物，引起茎腐、根腐、炭疽病和苗枯等病害（Ghosh et al. 2018）。其在高温（30–35 °C）和低土壤湿度（低于60%）下繁盛，显著降低大豆和高粱等作物产量（Kaur et al. 2012）。
【数据】HPLC保留时间：24.91 min；孵育：37 °C过夜；活性谱：革兰氏阳性菌（强）、革兰氏阴性菌、MRSA；抗真菌靶标：M. phaseolina、A. niger；M. phaseolina侵染：100余科500余种植物；其适生温度：30–35 °C；土壤湿度：低于60%
3.4 不同温度与pH下的抗菌活性
经不同温度（-30 °C、37 °C、55 °C和100 °C）处理的夫马洁林对细菌的抑菌圈几乎相似（补充图S15）。本实验以25 °C为对照温度，夫马洁林在此温度下显示最大活性。热处理样品的Re-HPLC显示色谱图与UV-Vis光谱与处理前相似。有报道称夫马洁林在较高温度下降解并丧失活性，但本研究发现其在较高温度下保留生物活性（Guruceaga et al. 2019）。因此，其在高温下发挥作用并抑制Macrophomina phaseolina生长的能力提示其作为生物防治剂管理这一 notorious 病原菌的潜力。经酸性（pH 4.0）、中性（pH 7.4）和碱性（pH 10.6）溶液处理后其仍显示活性，HPLC色谱图与UV-Vis光谱与未处理样品保持相似（补充图S15）。
【数据】热处理温度：-30 °C、37 °C、55 °C、100 °C；对照温度：25 °C；pH处理：4.0、7.4、10.6；验证：Re-HPLC色谱图与UV-Vis光谱；结果：抑菌圈几乎相似、活性保留
3.5 对Micrococcus luteus DSM1790的杀菌效应与细胞结构形变
在对数中期施加8×MIC后，通过监测OD₆₀₀与活菌CFU/mL评估夫马洁林对M. luteus DSM1790生长的影响，持续26 h（图3A、3B）。未处理对照培养物中，OD₆₀₀从0.197 ± 0.017稳步上升至峰值1.765 ± 0.17
【数据】测试菌：M. luteus DSM1790；剂量：8×MIC；监测时长：26 h；对照OD₆₀₀：0.197 ± 0.017升至1.765 ± 0.17；指标：OD₆₀₀、CFU/mL
3.6 报告菌株实验
使用B. subtilis PyheI与B. subtilis Plial报告菌株的显色平板实验显示，夫马洁林孔周围在B. subtilis PyheI平板上出现清晰蓝色环，与链霉素相似（图4A）。在B. subtilis Plial平板上，nisin抑菌圈周围出现蓝色环，但夫马洁林未出现
【数据】报告菌株：B. subtilis PyheI、B. subtilis Plial；对照抗生素：链霉素、nisin；读出：蓝色环（显色）；结果：PyheI平板出现蓝色环、Plial平板未出现
讨论与解读
本研究从黄麻内生真菌Aspergillus fumigatus MBL_F107中纯化并表征了次级代谢产物夫马洁林，采用RP-HPLC、FTIR、ESI-MS及一维/二维NMR联用完成结构确证。夫马洁林对MRSA及多种细菌显示抗菌活性，对植物病原真菌Macrophomina phaseolina亦有可观抗真菌活性。稳定性研究证明其在多种理化条件下具有耐受性，机制研究揭示其抑制蛋白质合成。作者指出，尽管本研究显示了夫马洁林的抗菌潜力，但仍需与已上市抗MRSA抗生素进行对比评价，并开展全面的细胞毒性、遗传毒性及体内安全性评估，才能充分评估其药物开发潜力。这是首次从黄麻内生真菌Aspergillus fumigatus MBL_F107中分离到夫马洁林，该内生真菌作为抗菌化合物的天然来源似具重要意义。
编译者解读：该工作的方法学价值在于"内生菌分离—发酵萃取—色谱纯化—波谱解析—活性/机制/稳定性评价"的完整链路，且用B. subtilis双报告菌株把作用机制锁定到蛋白质合成抑制，比单纯MIC筛选更具说服力。夫马洁林是已知化合物，其新意主要在"新来源+稳定性表型"——100 °C与宽pH下活性保留，为农业生物防治（尤其针对M. phaseolina）提供了低成本发酵来源的可能。局限也明显：缺细胞毒性与体内安全性数据，作为药物先导物尚早；作为农用生防剂，田间效力与环境归趋未验证。
参考来源
期刊：The Microbe（2026）
DOI：10.1016/j.microb.2026.100791
DOI: 10.1016/j.microb.2026.100791