来源：Isolation of complementary thermophilic Bacillus strains and their role in accelerating humification of livestock manure composting（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
常规堆肥升温慢、腐殖化不足、产品品质低。本研究从>70 °C猪粪堆肥中分离出四株耐热纤维素分解芽孢杆菌（耐温40–70 °C，纤维素酶活>1915.6 μg·min⁻¹·g⁻¹），复配成菌剂进行堆肥验证。接种处理高温期延长、有机质降解加快，腐殖质含量提高32.1%、腐殖化指数提高58.3%。宏基因组揭示"高温期芽孢杆菌主导产前体—降温期放线菌主导聚合"的两阶段调控模式。
研究背景
畜禽粪便是重要的有机碳与养分库，但常规堆肥效率低下且存在环境问题：操作温度低、腐熟周期长、腐殖化能力弱，导致碳大量矿化、温室气体排放，终产品农艺价值有限。基于耐热微生物接种的高温堆肥被视为突破上述限制的有效策略——可将堆体温度提升至70 °C以上，加速有机质矿化。
问题在于菌源。现有耐热微生物多分离自地热环境或污水污泥，而非粪污基质本身；适应畜禽堆肥的本土耐热菌株严重不足，制约高效堆肥菌剂的开发。已有研究报告从畜禽粪便堆肥系统中回收耐热细菌，但这些菌株耐温范围较窄或纤维素酶活性偏低。更关键的是，少有研究系统解析接种菌群如何在堆肥不同阶段协调有机降解与后续腐殖质聚合。本研究即针对这两个缺口：分离本土耐热纤维素分解芽孢杆菌，复配验证其促腐殖化效果，并用宏基因组解析阶段转换的分子机制。
研究方法
2.1 堆肥材料与性质
猪粪于2025年5月采自杭州市萧山区杭州沃土有机肥料有限公司。锯末购自当地市场，作为辅料调节堆肥物料含水率与C/N。其基础理化性质见表1。
【数据】采样时间：2025年5月；采样地点：杭州市萧山区；原料：猪粪+锯末；理化性质：原文见表1（节选未列具体数值）
2.2 耐热微生物菌剂的筛选、鉴定与制备
#### 2.2.1 菌株分离、纯化与鉴定
耐热细菌分离自中国浙江省湖州市某有机肥料厂的高温猪粪堆肥样品（>70 °C）。将堆肥悬液在70 °C液体培养基中孵育以富集目标耐热菌株，并在相同孵育条件下连续三次转接至新鲜培养基。经三次连续富集培养后，富集菌悬液按10⁻¹至10⁻⁵梯度稀释，取等分样涂布于LB琼脂平板，50 °C培养。挑取形态各异的单菌落，在新鲜LB琼脂上于55 °C连续划线五次纯化，获得纯培养物。纯化菌株的基因组DNA使用细菌DNA提取试剂盒（生工生物，上海，中国）按说明书提取。16S rRNA基因用通用引物27F和1492R进行PCR扩增。合格PCR产物进行双向测序，所得序列比对NCBI GenBank数据库进行种属鉴定。最终鉴定出四株耐热芽孢杆菌：凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、史密斯芽孢杆菌（Bacillus smithii）、人参土芽孢杆菌（Bacillus ginsengihumi）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
【数据】富集温度：70 °C；稀释梯度：10⁻¹–10⁻⁵；涂布培养温度：50 °C；纯化划线温度：55 °C；划线次数：5次；引物：27F/1492R；菌株数：4株
#### 2.2.2 不同温度下菌株生长性能与纤维素酶活分析
各分离株的耐热性在LB肉汤（初始pH = 7.0）中评价。种子液按标准化接种比例接入新鲜培养基，随后在20、30、40、50、60、70 °C六个温度梯度下于180 rpm旋转摇床孵育。整个48 h培养期间每8 h监测OD600值量化细菌生长，以未接种LB培养基为空白对照进行分光光度零点校正。所有实验组均设生物学三重复。纤维素酶活测定时，各菌株在其最适培养条件下培养，收获发酵液并离心收集无细胞上清作为粗胞外酶液。纤维素酶活通过还原糖释放法使用商业检测试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司，中国）定量，所有操作严格按厂家方案执行。每个测定设三重复。
【数据】培养基：LB肉汤；初始pH：7.0；温度梯度：20/30/40/50/60/70 °C；转速：180 rpm；监测间隔：8 h；培养时长：48 h；重复数：3；纤维素酶检测方法：还原糖释放法
#### 2.2.3 碳源利用能力鉴定
分离株的碳源利用谱用BIOLOG GEN III MicroPlate系统（Biolog公司，美国）表征。接种前，各菌株在BUG琼脂培养基上于50 °C预活化24–48 h。挑取单菌落悬浮于无菌IF-A接种液中，用DensiChek Plus浊度计（bioMérieux，法国）将细胞悬液浊度标准化至90–98%透光率。取100 μL标准化菌悬液加入GEN III板各孔，50 °C静置孵育48 h。需要说明的是，选择50 °C作为统一孵育温度是为模拟实际畜禽粪污堆肥中温向高温过渡阶段的典型温度，从而在相同的堆肥相关条件下进行跨菌株碳源利用比较，而非在各分离株各自最适生长温度下测试。底物利用通过BIOLOG自动读数系统分光光度定量，紫色形成表示碳源利用阳性。所有BIOLOG试验设生物学三重复。
【数据】预活化温度：50 °C；预活化时间：24–48 h；浊度标准：90–98%透光率；接种体积：100 μL/孔；孵育温度：50 °C；孵育时间：48 h；重复数：3
#### 2.2.4 复合耐热微生物菌剂的制备
四株菌间拮抗性用平板对峙法检测。70 °C共孵育48 h后未观察到抑菌圈。随后各菌株分别在LB肉汤中50 °C培养24 h，培养物按1:1:1:1体积比混合制备复合耐热菌剂（OD600 = 1.3），用于后续堆肥。
【数据】拮抗检测温度：70 °C；拮抗检测时间：48 h；抑菌圈：无；各菌培养温度：50 °C；各菌培养时间：24 h；混合体积比：1:1:1:1；菌剂OD600：1.3
2.3 堆肥实验设计与采样方法
堆肥实验在定制反应器中进行，有效总容积50 L（高0.6 m，内径0.5 m；图S3）。每个反应器配备外围热管理和强制曝气系统。简言之，反应器外壁完全包裹1 cm厚保温棉以减少向外热损失，模拟中试规模堆体的热条件。顶部法兰安装可拆卸密封盖；盖中央预留开口用于原位温度探头插入和定期混合样采集。连续强制曝气从反应器底部通过穿孔布气板供给，维持堆肥全程好氧条件。反应器出口敞开于大气，不收集气体。堆体温度每日通过顶部中央开口用手持温度探头在物料表面下30 cm深处手动测定。设置两个处理以阐明制备的耐热菌剂如何影响猪粪堆肥全程腐殖化。处理TC接受复合耐热菌剂（OD600 = 1.3，四株菌按1:1:1:1体积比混合），CK为不接种对照，接受等体积无菌LB肉汤以消除培养基来源效应。鲜猪粪与锯末按鲜质量比8:2混合制备堆肥原料。混合后，两处理初始基质性质调至含水率约62%、C/N 22.5、pH 7.9。TC按堆肥原料鲜质量的5%添加制备菌剂，CK不加菌剂；两处理其余操作条件保持一致。连续曝气速率0.02 m³/(min·m³)。均质原料装入各反应器启动堆肥，运行30 d。第7、14、21天人工翻堆，每日固定采样时间记录堆温一次。第0、2、6、9、12、16、19、22、29天通过五点采样法从多个深度采集混合堆样。每个混合样充分混匀后分三份：第一份4 °C保存用于即时鲜样检测，第二份风干、粉碎、过筛后用于理化测定，第三份−80 °C冻存用于后续微生物与宏基因组分析。
【数据】反应器容积：50 L；高：0.6 m；内径：0.5 m；保温棉厚度：1 cm；测温深度：30 cm；粪锯比：8:2（鲜质量）；含水率：约62%；C/N：22.5；pH：7.9；接种量：5%（鲜质量）；曝气速率：0.02 m³/(min·m³)；堆肥时长：30 d；翻堆日：第7/14/21天；采样日：第0/2/6/9/12/16/19/22/29天；采样方法：五点法；保存温度：4 °C / −80 °C
2.4 理化参数分析
所有理化指标按中国农业行业标准NY/T 525-2021有机肥料测定。堆温每日用便携式温度计在堆体表面下30 cm深处记录。含水率通过新鲜样品在强制通风烘箱105 °C干燥约8 h至恒重测定。风干粉碎堆样的总氮（TN）用凯氏消煮-蒸馏法在Kjeltec 8400凯氏分析仪（FOSS，希勒勒，丹麦）上定量。总有机碳（TOC）采用重铬酸钾-硫酸法测定（原文节选至此）。
【数据】标准：NY/T 525-2021；测温深度：30 cm；干燥温度：105 °C；干燥时间：约8 h；TN方法：凯氏消煮-蒸馏法；仪器：Kjeltec 8400；TOC方法：重铬酸钾-硫酸法
研究结果
3.1 耐热菌的耐温性与产纤维素酶活性分析
从猪粪堆肥高温期（>70 °C）分离出四株耐热纤维素分解细菌。基于16S rRNA基因测序，鉴定为凝结芽孢杆菌（2-1）、史密斯芽孢杆菌（5-1）、人参土芽孢杆菌（6-1）和枯草芽孢杆菌（7-1）。形态特征见图S1。四株分离株的耐热性在20–70 °C温度梯度下系统评估（图1a–d）。菌株2-1和5-1表现广温性，在20–60 °C范围内维持旺盛生长，最适温度分别为60 °C和40 °C。相反，菌株6-1和7-1表现窄温嗜热性，生长峰值集中在50–60 °C；菌株7-1即使在70 °C仍保持强劲增殖（OD600 > 0.5）。这种分化的热适应形成互补的生态位分区：菌株2-1和5-1支撑堆肥前期中温向高温过渡，菌株6-1和7-1主导超高温阶段。这种温度分层功能互补使菌群在整个堆肥轨迹中维持持续代谢活性，为动态温度条件下加速有机降解与腐殖化提供稳健的微生物基础。
分离株均表现出分泌高活性纤维素酶的能力，证实其在木质纤维素降解中的关键作用（图1e）。菌株2-1纤维素酶活最高（1915.6 μg·min⁻¹·g⁻¹），其次为5-1（1643.6 μg·min⁻¹·g⁻¹）、6-1（1351.9 μg·min⁻¹·g⁻¹）和7-1（1237.6 μg·min⁻¹·g⁻¹），形成清晰的功能梯度。高温条件下分泌如此高活性的纤维素酶，对高效分解堆肥混合物中难降解木质纤维素组分（如锯末）至关重要。其活性比原生堆肥微生物组典型原位纤维素酶活（约250 μg·g⁻¹·min⁻¹）高6–8倍，显示出卓越的降解优势。这一显著差异可归因于两个主要因素：其一，纯培养条件消除了复杂堆肥基质固有的限制因素，如营养竞争和抑制剂存在，从而为菌株充分发挥酶潜能提供最优环境；其二，原位测定反映的是整个微生物群落的综合酶活。相比之下，本研究聚焦特定高性能产纤维素酶菌株。尽管存在这些方法学差异，该比较仍凸显了利用此类高效菌株作为菌剂提升降解效率、克服堆肥系统原生微生物群落固有局限的巨大潜力。
总体而言，四株分离芽孢杆菌表现出突出的耐热性、高纤维素分解活性和独特的代谢互补性（图1、图S2）。这些整合的功能性状赋予菌群对动态堆肥环境的强适应力和提升木质纤维素降解与腐殖化效率的卓越潜力。因此，它们是开发高性能、环境适应型畜禽粪污堆肥菌剂的有前景候选者。该合成菌群加速有机分解和促进腐殖质形成的功效在后续堆肥实验中进一步评价。需要指出，图1中的生理数据来自各单株分离物。平板对峙试验确认无拮抗，保证四株菌共存。其分化的耐温性与高纤维素分解活性为菌群功能奠定生理基础。四株菌组合的整合性能最终通过其在实际堆肥中对升温、有机降解和腐殖化的显著促进效果得到验证。混合培养生长与酶活的进一步体外表征将在未来工作中开展。
【数据】分离温度：>70 °C；温度梯度：20–70 °C；菌株2-1最适温度：60 °C；菌株5-1最适温度：40 °C；菌株6-1/7-1生长峰值：50–60 °C；菌株7-1在70 °C的OD600：>0.5；纤维素酶活：2-1为1915.6、5-1为1643.6、6-1为1351.9、7-1为1237.6 μg·min⁻¹·g⁻¹；对比原位酶活：约250 μg·g⁻¹·min⁻¹；倍数：6–8倍；共孵育拮抗检测：70 °C、48 h、无抑菌圈
3.2 堆肥过程中堆肥性质的变化
温度是堆肥中控制微生物活性和有机质转化的关键因素。如图2(a)所示，对照组（CK）呈典型升温-降温曲线，第16天峰值65 °C。相反，高温堆肥组（TC）第1天即达75.1 °C，并维持70 °C以上4天。这一快速升温可能归因于接种的耐热芽孢杆菌易于利用易降解底物并释放代谢热。TC处理使堆肥提前约11天进入降温期，第23天基本腐熟完成，而CK直到第29天才降温。这些结果证实耐热菌剂有效加速堆肥进程，并建立了有利于有机降解的延长高温窗口。
pH和电导率（EC）在微生物代谢和有机质分解中起关键作用。TC组pH在第1–6天快速升至峰值8.8（图2b），主要由于氨挥发和有机酸降解。第10天后pH开始下降，可能与氨化减弱或有机质（OM）分解为低分子量有机酸有关。CK组pH自第9天开始急剧上升。随时间推移，伴随OM持续分解（图2e），两组最终pH均稳定在8.3左右，处于适宜植物生长应用的标准范围内。两处理EC总体呈下降趋势（图2d）。TC组EC前8天快速下降，随后稳定在约2.5 mS·cm⁻¹。CK组EC降至2.28 mS·cm⁻¹。TC中稳定且较低的EC反映菌剂诱导的更有效矿化和养分固定。含水率和有机质（OM）含量均随时间下降（图2d–e）。TC含水率从62.2%降至36.2%（降幅41.8%），CK从61.6%降至40.5%，而CK为34.2%。OM降解率TC为22.9%、CK为21.6%，这一堆体有机质损失的差异无统计学显著性。即便如此，TC对难降解木质纤维素组分表现出更高效的分解。该优势源于接种芽孢杆菌的高纤维素酶活、延长的超高温条件以及上调的碳降解功能基因。这种分解将碳流导向腐殖质前体生成而非过度矿化，对腐殖质形成至关重要。CK组总氮（TN）含量呈上升趋势。TC中TN在高温期因高温下氨挥发先下降，随后随有机质分解和氮浓缩逐渐上升。腐熟时TC的TN达2.6%，略高于CK的2.4%，提示氮保持改善。堆肥结束时TC组TN（2.6%）高于CK组（2.4%），表明添加耐热菌剂促进了堆肥中的氮固定与保持。C/N比下降（原文节选至此）。
【数据】CK峰值温度：65 °C（第16天）；TC第1天温度：75.1 °C；TC维持>70 °C：4天；TC提前降温：约11天；TC腐熟完成：第23天；CK降温：第29天；TC pH峰值：8.8（第1–6天）；最终pH：两组约8.3；TC EC稳定值：约2.5 mS·cm⁻¹；CK EC：2.28 mS·cm⁻¹；TC含水率：62.2%→36.2%（降41.8%）；CK含水率：61.6%→40.5%；CK最终含水率：34.2%；OM降解率：TC 22.9%、CK 21.6%；TC终TN：2.6%；CK终TN：2.4%
3.3 腐殖化参数变化
堆肥过程中腐殖化参数的变化见图3。原文节选未提供该部分具体文字描述。
【数据】原文节选未详述（腐殖化参数具体数值见摘要：腐殖质含量提高32.1%、腐殖化指数提高58.3%）
3.4 细菌群落演替
TC与CK组堆肥过程中细菌群落演替见图4，包括Chao1、Shannon指数、PCoA、门水平与属水平相对丰度。原文节选未提供该部分具体文字描述。
【数据】原文节选未详述（摘要数据：接种芽孢杆菌在高温期相对丰度89.7%；降温期放线菌相对丰度54.6%）
3.5 关键代谢基因与腐殖质组分的相关性
13个关键代谢基因相对丰度的动态变化及其与腐殖质组分（FA、HA、HS、DP、HI等）的Spearman相关热图见图5。原文节选未提供该部分具体文字描述。
【数据】关键代谢基因数：13个；相关性方法：Spearman相关；原文节选未详述具体相关系数
3.6 KEGG功能预测
基于PICRUSt2的堆肥微生物群落KEGG功能预测见图6，包括Level 1功能类别平均相对丰度和前10位代谢功能基因丰度分布。原文节选未提供该部分具体文字描述。
【数据】预测工具：PICRUSt2；功能层级：Level 1；展示类别：前10位代谢功能；原文节选未详述具体丰度数值
讨论与解读
本研究针对常规堆肥腐殖化效率低的问题，分离筛选出四株耐温范围宽（40–70 °C）、纤维素酶活高（最高1915.6 μg·min⁻¹·g⁻¹）的耐热芽孢杆菌，复配成高效复合菌剂。接种该菌群不仅显著提升高温期堆肥温度和有机质降解率，还使腐殖质含量和腐殖化指数分别提高32.1%和58.3%。宏基因组分析揭示菌剂编排了两阶段代谢转换：高温期芽孢杆菌主导，上调降解与碳固定相关基因，加速前体形成；降温期放线菌接管，强化碳固定-氮同化耦联通路，促进芳香族氨基酸代谢，最终驱动腐殖质聚合。研究系统阐明了超高温堆肥中"分解—聚合"代谢转换的微生物调控机制，为堆肥腐殖化的靶向调控提供理论依据；所开发菌群可作为设计畜禽粪污定制菌剂的关键技术资源，具备增强碳封存与提升堆肥产品品质的潜力。
编译者解读：该研究的亮点在于"本土菌源+阶段互补"的设计逻辑——四株菌按耐温谱分工覆盖中温至超高温全程，而非追求单株最优，这比商业通用菌剂更契合堆肥动态温度场。宏基因组把腐殖化拆成"前体生成"与"聚合"两段归因于不同菌群，为分阶段精准接种提供了可验证的靶点。局限也明显：菌群功能验证停留在堆肥表型与基因预测层面，混合培养的体外酶活与代谢互作未实测；腐殖化参数的化学表征细节在节选中缺失，两阶段机制的直接代谢证据仍需补强。
参考来源
期刊：Bioresource Technology Reports, 2026
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.103075
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.103075