来源：A tri-modular biocatalytic workflow for PET valorization: From depolymerization and enhanced uptake to organized biosynthesis（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
PET生物升级回收受制于三个紧密耦合的环节：解聚、底物跨膜递送与生物合成转化。该研究构建了一条半集成、分步式的全细胞—酶法联合工作流：先在革兰氏阴性菌表面展示工程化PETase并共表达胞内MHET水解酶，获得高纯度TPA料流；再用游离FtpM将TPA瞬态酯化为MMT以绕过膜通透性瓶颈，胞内再生TPA后经CipB支架组织多酶级联转化为没食子酸。全流程最终以96%转化率产出4.8 mM没食子酸。
研究背景
PET是最常见、用量最大的聚酯塑料之一，其抗自然降解能力极强，废弃积累对生态与健康构成长期威胁。机械与化学回收能耗高，还可能带来二次污染，难以兼顾可持续减废与资源回收。温和条件下的生物降解因此被视为有前景的替代路线。目前已鉴定的PET水解酶包括IsPETase、TfCut2、LCC、TurboPETase等，多为角质酶或类角质酶水解酶，催化机制相似，将PET解聚为BHET、MHET、TPA和乙二醇的混合物。与此配套，MHETase及相关酯酶被开发用于消除抑制性中间体MHET、推动水解平衡向TPA和EG移动，从而提高PET生物降解与回收效率。不过，解聚只是起点——革兰氏阴性宿主对TPA的外膜通透性低，且下游合成途径效率有限，如何把解聚、递送与转化三步真正串起来，仍是PET生物升级回收的核心难题。
研究方法
2.1 通用材料、菌株与试剂
实验使用无定形PET膜（0.25 mm，Goodfellow GmbH，伦敦，英国）、商业PET粉末（DuPont，上海，中国）以及消费后PET瓶膜（农夫山泉）。聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）粉末购自商业渠道。BHET、MHET、TPA、MMT、DMT、IPTG、刚果红（CR）及其他生化试剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（上海，中国）。所用细菌菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Shuffle T7、大肠杆菌DH5α和大肠杆菌MG1655(DE3)。
【数据】PET膜厚度：0.25 mm；商业PET粉末结晶度：48.1%；瓶源PET粉末结晶度：12.5%；消费后PET瓶膜结晶度：35.9%；无定形PET膜结晶度：5.67%；菌株：BL21(DE3)、Shuffle T7、DH5α、MG1655(DE3)；试剂来源：上海阿拉丁；原文未详述其他试剂浓度
2.2 模块1：胞外PET解聚界面
#### 2.2.1 卷曲展示PETase生物催化剂的构建
PET解聚模块构建于大肠杆菌MG1655(DE3) ΔcsgA中，该菌株通过CRISPR/Cas9介导的染色体csgA缺失获得[28]。选择K-12 MG1655背景是为了便于构建ΔcsgA卷曲展示底盘。将TurboPETase、ThermoPETase、FAST-PETase和Thermobifida fusca角质酶（TfCut）[29]分别通过柔性连接肽与CsgA融合，克隆入pRSFDuet-1，分别得到MC-Turbo、MC-Thermo、MC-FAST和MC-TfCut（图S1A）。连接肽用于最小化空间干扰，同时保持独立折叠与底物可及性。随后将TfCa插入每个PETase质粒的第二个克隆位点，生成MCT-Turbo、MCT-Thermo和MCT-FAST（图S2A、C）。TfCa在胞内表达，不与CsgA融合。
【数据】宿主：E. coli MG1655(DE3) ΔcsgA；基因缺失方法：CRISPR/Cas9；载体：pRSFDuet-1；融合变体：MC-Turbo、MC-Thermo、MC-FAST、MC-TfCut；双功能变体：MCT-Turbo、MCT-Thermo、MCT-FAST；连接肽：柔性连接肽（序列原文未详述）；温度：原文未详述；时间：原文未详述
#### 2.2.2 CsgA-PETase融合蛋白的表达
以大肠杆菌MG1655 ΔcsgA作为表面展示的宿主菌株。为缓解CsgA-PETase融合蛋白异源生产可能带来的折叠压力与聚集，共表达GroEL/GroES伴侣系统以促进正确折叠、具备组装能力的融合蛋白形成[30]。groES/groEL表达受L-阿拉伯糖诱导的araBAD启动子控制，以1 g L⁻¹ L-阿拉伯糖诱导。表达条件在含IPTG的LB和TB培养基以及ZYP自诱导培养基中筛选，并比较有无GroEL/GroES，最终选定含GroEL/GroES的ZYP自诱导。单菌落于20 mL LB中37 °C过夜培养，以2%（v/v）接种至含1 g L⁻¹ L-阿拉伯糖的ZYP培养基。培养物于37 °C、220 rpm培养至OD₆₀₀ = 1.5，转至20 °C，220 rpm继续培养24 h，采用改编自Studier[31]的乳糖自诱导策略。OD₆₀₀用SPECORD 250分光光度计（Analytik Jena，德国）测定，高密度样品稀释至测定OD₆₀₀ < 0.8并按稀释倍数校正，本研究报道的所有OD₆₀₀均按此流程测定。细胞收获（4000 ×g，15 min，4 °C），用50 mM磷酸缓冲液洗涤并重悬于同一缓冲液。
【数据】诱导剂：1 g L⁻¹ L-阿拉伯糖；接种量：2%（v/v）；过夜培养：20 mL LB、37 °C；诱导前培养：37 °C、220 rpm至OD₆₀₀ = 1.5；诱导后培养：20 °C、220 rpm、24 h；收获条件：4000 ×g、15 min、4 °C；缓冲液：50 mM磷酸缓冲液；OD测定仪器：SPECORD 250；OD₆₀₀测定上限：< 0.8
#### 2.2.3 卷曲组装与表面展示表征
卷曲形成用刚果红染色评估[32]。细胞重悬于50 mM磷酸缓冲液（pH 7.5）至OD₆₀₀ ≈ 6.0。取1 mL等分样含50 μM CR，于25 °C、250 rpm孵育25 min，12,000 ×g离心10 min，测上清490 nm吸光度。含CR缓冲液与MG1655 ΔcsgA分别作为空白与阴性对照。CsgA-PETase提取时，洗涤后的细胞用膜蛋白提取试剂盒（生工生物，上海，中国）处理。沉淀重悬于提取缓冲液，超声30 s每循环（3–4个循环，间隔1 min），冰上孵育10 min，4 °C、12,000 ×g离心10 min。上清再冰上孵育10 min。收集下层膜蛋白相，用500 μL冰冷无菌水洗涤两次，SDS-PAGE分析。
【数据】CR浓度：50 μM；细胞浓度：OD₆₀₀ ≈ 6.0；染色条件：25 °C、250 rpm、25 min；离心：12,000 ×g、10 min；检测波长：490 nm；超声：30 s/循环、3–4循环、间隔1 min；膜蛋白离心：12,000 ×g、10 min、4 °C；洗涤：500 μL冰冷无菌水×2
#### 2.2.4 游离PETase的表达与纯化
将TurboPETase、ThermoPETase和FAST-PETase分别克隆入pET-30(a)，在大肠杆菌Shuffle T7中表达，并与pGro7共表达。过夜培养物（2%，v/v）接种至含1 g L⁻¹ L-阿拉伯糖的ZYP培养基，37 °C培养至OD₆₀₀ = 1.5，转20 °C、220 rpm培养20 h。细胞收获（4000 ×g，15 min，4 °C），洗涤后重悬于缓冲液A（50 mM磷酸缓冲液，pH 7.5）。超声（200 W，开1 s/关1.5 s）后，裂解液澄清（12,000 ×g，1 h，4 °C），经0.22 μm膜过滤，在预平衡的HisTrap柱上纯化，平衡缓冲液为含10 mM咪唑的缓冲液A。用30 mM咪唑洗柱，300 mM咪唑洗脱蛋白。蛋白浓度用Bradford法测定[33]。
【数据】载体：pET-30(a)；宿主：E. coli Shuffle T7；伴侣：pGro7；接种量：2%（v/v）；L-阿拉伯糖：1 g L⁻¹；诱导前：37 °C至OD₆₀₀ = 1.5；诱导后：20 °C、220 rpm、20 h；超声功率：200 W、开1 s/关1.5 s；澄清：12,000 ×g、1 h、4 °C；滤膜：0.22 μm；平衡咪唑：10 mM；洗杂咪唑：30 mM；洗脱咪唑：300 mM；蛋白定量：Bradford法
#### 2.2.5 PET解聚与条件优化
PET底物包括无定形PET膜（结晶度5.67%）、商业PET粉末（48.1%）、瓶源PET粉末（12.5%）和消费后PET瓶膜（35.9%）。膜片冲压为0.8 cm圆片。反应体系为1 mL缓冲液中含一个PET圆片或10 mg PET粉末及CsgA-PETase全细胞催化剂，150 rpm孵育。以商业PET粉末或无定形PET膜为底物，从40 °C、pH 9.0、OD₆₀₀ = 1.0起始，依次优化温度（30–50 °C）、pH和细胞装载量。40 °C下的pH优化使用100 mM磷酸缓冲液（pH 7.0–7.5）、Tris-HCl（pH 8.0–9.0）或Gly-NaOH（pH 9.0–11.0），随后测试OD₆₀₀为0.6、1、2、4、6、8的条件。反应以等体积含0.2%甲酸的乙腈终止，12,000 ×g离心10 min，经0.22 μm膜过滤。样品按2.5节所述用HPLC定量。
【数据】PET圆片直径：0.8 cm；PET粉末用量：10 mg；反应体积：1 mL；转速：150 rpm；温度范围：30–50 °C；起始条件：40 °C、pH 9.0、OD₆₀₀ = 1.0；缓冲液：100 mM磷酸缓冲液（pH 7.0–7.5）、Tris-HCl（pH 8.0–9.0）、Gly-NaOH（pH 9.0–11.0）；OD₆₀₀测试值：0.6、1、2、4、6、8；终止液：等体积含0.2%甲酸乙腈；离心：12,000 ×g、10 min；滤膜：0.22 μm
#### 2.2.6 重复使用性、储存稳定性与pH-stat放大
MC-Thermo的重复使用性在优化条件下以BHET为底物、连续10个10 min循环评估。每循环后离心回收细胞、洗涤并重悬于新鲜BHET反应液，残余活性以第1循环归一化为100%。储存稳定性方面，MC-Thermo细胞（OD₆₀₀ = 1）与纯化ThermoPETase分别于4、25或37 °C保存，每周以瓶源PET粉末在优化条件下测定残余活性。pH-stat放大反应为50 mL体系，含100 mM Gly-NaOH缓冲液，40 °C、150 rpm运行最长10 d。MCT-Thermo与MCT-Turbo分别用于瓶源PET粉末和消费后PET瓶膜，pH维持于8.5–9.0。样品按2.2.5节终止制备，按2.5节HPLC定量。
【数据】重复使用：10个循环、每循环10 min；储存温度：4、25、37 °C；储存时长：56天（每周测定）；放大体积：50 mL；缓冲液：100 mM Gly-NaOH；温度：40 °C；转速：150 rpm；时长：最长10 d；pH：8.5–9.0
#### 2.2.7 PET结晶度测定
PET结晶度用差示扫描量热仪（DSC250，TA Instruments）测定。约5 mg样品置于铝盘，30 °C等温平衡2 min，随后以10 °C min⁻¹升温速率从30 °C升至300 °C。结晶度按下式计算：Xc % = (ΔHm − ΔHc)/ΔHf × 100%，其中ΔHm为实测熔融焓，ΔHc为冷结晶焓，ΔHf取100%结晶PET的140.1 J g⁻¹。
【数据】样品量：约5 mg；平衡：30 °C、2 min；升温：30→300 °C、10 °C min⁻¹；ΔHf：140.1 J g⁻¹；仪器：DSC250
2.3 模块2：TPA修饰与胞内再生
#### 2.3.1 FtpM与SAH核苷酶的表达与纯化
FtpM与SAH核苷酶基因分别克隆入pET-30(a)（图S3A、B），在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。转化子在含卡那霉素的LB琼脂上筛选，37 °C于LB培养12 h，以2%（v/v）接种至新鲜LB。OD₆₀₀ = 0.6时以0.4 mM IPTG诱导，20 °C、220 rpm表达20 h。蛋白按2.2.4节所述流程纯化。
【数据】载体：pET-30(a)；宿主：BL21(DE3)；抗生素：卡那霉素；接种量：2%（v/v）；诱导前培养：37 °C、12 h；诱导条件：OD₆₀₀ = 0.6、0.4 mM IPTG；诱导后：20 °C、220 rpm、20 h
#### 2.3.2 TPA至MMT的体外单酯化
纯化FtpM与SAH核苷酶用于胞外TPA单酯化。pH优化反应含2 mM TPA（来自稀释的PET解聚液）、4 mM SAM、10 μM FtpM（原文此处节选截断，后续参数未详述）。
【数据】TPA浓度：2 mM；SAM浓度：4 mM；FtpM浓度：10 μM；pH范围：原文节选截断未详述；温度：原文未详述；时间：原文未详述
研究结果
3.1 CsgA-PETase表面展示生物催化剂的构建与功能评价
废弃塑料作为储量丰富的替代资源，有望成为可持续生产高附加值精细化学品的原料。要充分释放这一潜力，关键前提是将固体PET高效解聚为可溶性单体以供给下游升级途径。为此，研究采用大肠杆菌卷曲菌毛的主要结构亚基CsgA——它能高效自组装为胞外纤维，实现目标酶的高密度展示。于是，通过敲除天然csgA基因对大肠杆菌MG1655(DE3)进行遗传改造，构建MG1655 ΔcsgA（图S5A、B），确保所有卷曲纤维仅由与目标重组蛋白融合的CsgA产生。随后，质粒编码的CsgA-PETase融合蛋白经天然CsgDEFG分泌途径表达并分泌至细胞表面（图1A）。为高效降解PET，将三种IsPETase变体（Turbo-PETase[8]、Thermo-PETase[36]和FAST-PETase[37]）与CsgA融合，生成三种融合酶，所得工程菌分别命名为MC-Turbo、MC-Thermo和MC-FAST。在所评价的诱导策略中，乳糖基ZYP自诱导联合GroEL/ES共表达提供了最有效的表达条件，支持细胞稳健生长至OD₆₀₀ = 12，而其他测试条件细胞密度显著更低（图S1C）。在此诱导条件下，膜组分SDS-PAGE分析确认了CsgA-PETase融合蛋白的成功表达（图S1D）。电镜显示CsgA-PETase以卷曲介导方式组装于细胞表面（图1B及图S1E、F）。与对照菌株MG1655 ΔcsgA相比刚果红结合量增加，进一步证实CsgA-PETase的成功组装（图S1G）。
以商业PET粉末为模型底物，考察温度、pH和细胞装载量对三种CsgA-PETase工程菌催化PET解聚的影响（图S6）。结果显示，三种CsgA-PETase融合构建体大多在40–45 °C和pH 9.0–9.5达到最大催化性能（图S6A、B）。考虑持续全细胞生物催化的需求，最终选择40 °C和pH 9.0作为标准反应条件，以最大化长期操作稳定性与工艺稳健性。此外，以商业PET粉末和无定形PET膜为代表底物时，三种CsgA-PETase工程菌均在OD₆₀₀ = 1.0时表现最高降解效率，更高细胞密度反而损害催化性能（图S6C、D）。这一趋势与细胞聚集造成的传质限制一致[38]。在40 °C、72 h条件下，以两种不同形貌底物——商业PET粉末（结晶度48.1%）和无定形PET膜（结晶度5.67%）——系统表征了三种CsgA-PETase工程菌的长期PET解聚性能（图1C、D）。表面展示全细胞催化剂在上述优化条件下评价。作为对照，相应纯化游离酶在相同条件下反应，酶载量针对每种底物独立优化以最大化总可溶性产物生成（图S7）。总水解性能以TPA与MHET浓度之和评价。在各自最优催化剂载量条件下，MC-Thermo和MC-FAST经72 h从商业PET粉末分别产生约8 mM和7 mM可溶性产物，总可溶性产物滴度分别为相应纯化游离酶系统的2.2倍和2.3倍（图1C）。相比之下，MC-Turbo活性与游离酶相当。然而以无定形PET膜为底物时，仅MC-Turbo获得提高的产物产量，72 h达4.0 mM，较游离TurboPETase提高1.7倍；另外两种融合酶产物产量则低于其游离 counterparts（图1D）。这些性能差异凸显了表面展示系统的复杂动力学。表面展示变体的差异性能与酶—底物形貌相互作用及传质动力学密切相关。表面展示变体在碎片化商业粉末上的增强性能，可能归因于卷曲支架上聚集的高局部酶密度，促进了在高可及、高比表面积粉末颗粒上的协同降解。反之，在平整完整的无定形膜上，全细胞催化剂的庞大体积引入空间位阻与传质限制，可能限制锚定酶的表面可及性，从而在某些情况下导致产物产量低于自由扩散的纯化酶。尽管如此，产物谱显示这些反应条件下MHET仍占总可溶性产物的约30–40%。MHET积累会竞争性抑制PETase催化的PET水解，并降低下游升级可用的TPA[9,39]。为评价表面展示系统的操作稳健性，以MC-Thermo为代表模型考察长期耐久性。4 °C和25 °C储存56天后，MC-Thermo保持初始活性的78–90%，而游离ThermoPETase对照仅保持35–60%（图1E）。此外，MC-Thermo在连续10个10 min BHET降解循环后仍保持初始活性的80%以上（图S8）。这些结果表明，CsgA介导的全细胞系统在储存及反复回收再利用过程中有效保持酶活性，支持其作为可重复使用生物催化平台的潜力。
【数据】细胞生长OD₆₀₀：12（ZYP自诱导+GroEL/ES）；最适温度：40–45 °C；最适pH：9.0–9.5；选定条件：40 °C、pH 9.0；最优细胞装载：OD₆₀₀ = 1.0；商业PET粉末产物：MC-Thermo约8 mM、MC-FAST约7 mM（72 h）；游离酶对比倍数：2.2倍、2.3倍；无定形膜：MC-Turbo 4.0 mM（72 h）、较游离酶1.7倍；MHET占比：总可溶性产物30–40%；储存56天残余活性：MC-Thermo 78–90%、游离酶35–60%；重复使用：10循环后>80%
3.2 PET解聚的TPA主导产物
为缓解上述MHET问题，系统评价了IsMHETase[5]、Kls-MHETase[9]和TfCa[10]三种MHET水解酶。这些候选中，TfCa在构建的全细胞催化系统中对MHET表现出最高催化效率（图S2D）。据此，选择TfCa与PETase共表达于三种优化的CsgA-PETase工程菌，生成三种同步双功能级联生物催化剂，命名为MCT-Turbo、MCT-Thermo和MCT-FAST。相应游离PETase及不含TfCa的MC菌株作为对照。在该集成平台中，TfCa的第一个明确作用是在大肠杆菌MG1655(DE3)胞内高效水解进入细胞的中间体MHET，从而解除对表面展示PETase的产物抑制。为评估胞内TfCa共表达对解聚效率与产物分布的影响，首先在商业PET粉末和无定形PET膜上评价级联菌株，相应游离PETase及其无TfCa counterparts作为对照。在商业PET粉末上，MCT菌株72 h后总可溶性产物始终高于两个对照组（图2B）。在无定形PET膜上，TfCa共表达最显著改善MCT-Turbo性能，而对MCT-Thermo和MCT-FAST影响相对温和（图2E）。不同酶变体在不同PET材料上的活性差异，可能源于局部酶（原文此处节选截断，后续内容未详述）。
【数据】候选MHET水解酶：IsMHETase、Kls-MHETase、TfCa；最优：TfCa；级联菌株：MCT-Turbo、MCT-Thermo、MCT-FAST；评价时长：72 h；商业PET粉末：MCT组总可溶性产物高于对照组（具体数值原文节选截断未详述）；无定形膜：MCT-Turbo改善最显著（具体数值原文节选截断未详述）
讨论与解读
该研究建立了一条三模块的PET-to-product工作流，把解聚、胞内TPA递送与空间组织化升级三个层面协同起来。卷曲纤维展示PETase并胞内共表达TfCa的解聚模块，有效抑制了抑制性MHET积累，从多种消费后PET材料获得高纯度TPA料流（纯度>98%，pH 8.5–9.0条件下瓶源粉末约35 mM、瓶膜19.5 mM）。针对革兰氏阴性宿主TPA通透性低的问题，采用可逆的TPA修饰—再摄取策略：胞外瞬态单酯化为MMT后被动进入细胞，再由胞内TfCa水解再生TPA，无需破坏性膜透化即可显著提升底物可用性（10 mM TPA在1 h内近乎完全转化为MMT）。将这一递送方式与CipB介导的级联空间组织耦合，系统最大化级联效率与产物产量，最终以96%转化率产出4.8 mM没食子酸。作者也指出，当前瞬态酯化步骤尚属体外概念验证，为探索完全整合的体内流程奠定概念基础，实现该体系仍需进一步研究。
编译者解读：该工作的巧思在于把"膜通透性"当作可工程化的独立模块来处理——用可逆酯化替代传统透化或转运蛋白改造，避免了对细胞生理的破坏，思路干净。三模块分步集成的代价是流程复杂度上升，FtpM酯化仍需外源SAM与纯化酶，离"一锅法"还有距离。对合成生物学而言，其价值在于示范了"底物化学修饰—胞内再生"这一通用策略可迁移至其他难透过膜的芳香族底物。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.183225
DOI: 10.1016/j.cej.2026.183225