来源：Microwave pretreatment of glycogen-containing cyanobacteria Synechococcus elongatus UTEX 2973 to enhance enzymatic saccharification and fermentation for bioethanol production（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蓝细菌直接产乙醇的瓶颈之一，是胞内糖原被坚韧细胞壁包裹、酶难以接触。本研究以富糖原的Synechococcus elongatus UTEX 2973为原料，比较了溶菌酶、超声与微波三种预处理方式，发现200 W微波处理100–150 s即可使糖化葡萄糖得率从18%升至近100%；在100 g/L高生物量负载下，150 s预处理后糖化48 h葡萄糖浓度达44 g/L（得率94%），后续发酵乙醇浓度21 g/L，达理论值的88%。这是首次证明微波预处理可显著强化该菌株的酶解糖化与乙醇发酵。
研究背景
以蓝细菌为原料生产生物乙醇，通常需先在限氮条件下培养以积累糖原。但限氮会拖慢生长、降低细胞浓度，原料产出效率受限。S. elongatus UTEX 2973生长快，且在富氮条件下仍能积累40–50%的糖原，因而被选作本研究原料。糖原位于胞内，酶解前需破坏细胞屏障；溶菌酶处理温和但耗时，超声需要专门设备且时间长，微波则兼具热效应与非热效应、操作快速。本研究系统比较三种预处理对后续酶解糖化的影响，确定微波的适宜处理时间，并在高生物量负载下贯通糖化与乙醇发酵全流程。
研究方法
菌株、淀粉酶与酵母。 Synechococcus elongatus UTEX 2973购自UTEX藻类培养物保藏中心（美国奥斯汀），用作生物乙醇生产原料。该菌株以光自养方式保藏于含100 mL BG-11培养基（初始pH调至7.4）的200 mL锥形瓶中，42 °C、120 rpm振荡，LED灯连续光照，光强170 μmol·m⁻²·s⁻¹，通入含3% CO₂的空气混合气，流速1 vvm。
【数据】菌株：S. elongatus UTEX 2973；培养基：BG-11，100 mL；初始pH：7.4；温度：42°C；转速：120 rpm；光强：170 μmol·m⁻²·s⁻¹；CO₂：3%；流速：1 vvm
由α-淀粉酶与糖化酶组成的淀粉酶混合物（Magnax JW101，粉末）由Rakuto Kasei Industrial Co., Ltd.（日本大津）惠赠，用于将蓝细菌糖原水解为葡萄糖。以2-氯-4-硝基苯基-65-叠氮-65-脱氧-β-麦芽五糖苷和4-硝基苯基-β-D-麦芽糖苷为底物，分别用α-淀粉酶测定试剂盒与糖化能力测定试剂盒（Kikkoman Biochemifa Company，日本东京）测得该淀粉酶混合物的α-淀粉酶与糖化酶活力分别为560 U/g和370 U/g。
【数据】酶混合物：Magnax JW101；α-淀粉酶活力：560 U/g；糖化酶活力：370 U/g；底物：2-氯-4-硝基苯基-65-叠氮-65-脱氧-β-麦芽五糖苷、4-硝基苯基-β-D-麦芽糖苷
糖化酶（30 U/mg）购自Toyobo Co., Ltd.（日本大阪），用于糖原含量测定与酶可及性实验。酵母Kluyveromyces marxianus NBRC 1777购自NITE生物资源中心（NBRC，日本木更津），用于将葡萄糖发酵为乙醇。该酵母保藏于酵母浸出粉-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母浸出粉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中，30 °C培养。
【数据】糖化酶：30 U/mg；酵母：K. marxianus NBRC 1777；培养基：YPD（酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）；温度：30°C
原料蓝细菌生物量的培养。 S. elongatus UTEX 2973的实验培养在含500 mL BG-11培养基（初始pH调至7.4）的扁瓶中以光自养方式进行7天，42 °C，LED灯连续光照，光强350 μmol·m⁻²·s⁻¹，通入含3% CO₂的空气混合气，流速1 vvm。培养条件（温度、光强、CO₂浓度）依据此前关于S. elongatus UTEX 2973的研究设定。通入含3% CO₂的空气混合气后，BG-11培养基pH为6.7；培养结束时，pH变为6.4。初始730 nm波长光密度（OD730）为0.05。培养7天后，离心（16,000 ×g、4 °C、5 min）收获蓝细菌细胞，于50 mL离心管中获得湿沉淀，每管相当于0.5 g干细胞重（DCW）。收获的蓝细菌沉淀于−25 °C保存至使用。
【数据】培养基：BG-11，500 mL；初始pH：7.4；通气后pH：6.7；培养结束pH：6.4；温度：42°C；光强：350 μmol·m⁻²·s⁻¹；CO₂：3%；流速：1 vvm；培养时间：7天；初始OD730：0.05；离心：16,000 ×g、4°C、5 min；每管DCW：0.5 g；保存温度：−25°C
蓝细菌生物量的预处理。 微波预处理：将相当于0.5 g-DCW的蓝细菌湿沉淀用纯水悬浮，配制5 mL 100 g-DCW/L悬浮液。将悬浮液转入微波炉专用25 mL密封反应容器（P-25，San-ai Kagaku Co. Ltd.，日本名古屋），用固定输入功率200 W的家用微波炉反应0–200 s。若后续进行酶解糖化与乙醇发酵，微波预处理后将5 mL预处理混合物转入50 mL离心管。超声预处理参照文献并稍作修改：将5 mL蓝细菌悬浮液（水中100 g-DCW/L）转入螺口玻璃瓶（直径30 mm，体积30 mL），用38 kHz超声浴（QUAVA mini，Kaijo Corporation，日本东京）以固定输入功率24 W超声30 min；玻璃瓶置于距超声浴底部50 mm高度处。溶菌酶预处理参照文献并稍作修改：将5 mL蓝细菌悬浮液（水中100 g-DCW/L，pH约7）转入50 mL离心管，加入终浓度1 g/L的溶菌酶（鸡蛋白，Nacalai Tesque, Inc.，日本京都），于37 °C、120 rpm摇床孵育24 h。
【数据】微波：200 W、0–200 s、悬浮液100 g-DCW/L、体积5 mL、容器25 mL；超声：38 kHz、24 W、30 min、瓶径30 mm、瓶体积30 mL、距底部50 mm；溶菌酶：终浓度1 g/L、37°C、120 rpm、24 h、pH约7
评价预处理蓝细菌生物量中糖原酶可及性的糖化实验。 采用低生物量负载（10 g-DCW/L）糖化实验，评价不同预处理方法下淀粉酶对预处理蓝细菌生物量中糖原的可及性。从预处理蓝细菌悬浮液（负载100 g-DCW/L）取样，用100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.8）稀释9倍。取270 μL稀释样品与30 μL糖化酶溶液（133 U/mL，溶于100 mM乙酸钠缓冲液，pH 4.8）在1.5 mL管中混合，得到300 μL反应体系，底物浓度10 g/L，酶浓度13.3 U/mL（每管酶量4 U）。1.5 mL管于55 °C孵育30 min，随后90 °C加热5 min灭活酶。加热样品21,500 ×g离心1 min，上清用于葡萄糖测定。葡萄糖浓度（g-葡萄糖/L）用变旋酶-GOD法（LabAssay Glucose）测定。葡萄糖得率（%）为实测葡萄糖浓度相对理论葡萄糖浓度的百分比。理论葡萄糖浓度按下式计算：糖原含量（%）/100 × 蓝细菌生物量负载（g-DCW/L）×（180/162）。
【数据】生物量负载：10 g-DCW/L；稀释倍数：9倍；缓冲液：100 mM乙酸钠，pH 4.8；样品：270 μL；酶液：30 μL、133 U/mL；反应体积：300 μL；底物：10 g/L；酶浓度：13.3 U/mL；酶量：4 U/管；糖化：55°C、30 min；灭活：90°C、5 min；离心：21,500 ×g、1 min；换算系数：180/162
发酵用酵母接种液的制备。 将K. marxianus NBRC 1777在含50 mL YPD培养基的坂口瓶中于30 °C好氧培养48 h，150 rpm振荡。离心（16,000 ×g、4 °C、5 min）收集酵母细胞，用蒸馏水洗涤三次。所得酵母沉淀用作下述乙醇发酵的接种液。
【数据】培养基：YPD，50 mL；温度：30°C；时间：48 h；转速：150 rpm；离心：16,000 ×g、4°C、5 min；洗涤：蒸馏水3次
预处理蓝细菌生物量的糖化与乙醇发酵。 糖化在含5 mL预处理蓝细菌悬浮液（负载100 g-DCW/L）的50 mL离心管中进行，加入终浓度0.1 g/L的淀粉酶混合物（α-淀粉酶与糖化酶浓度分别为56 U/L和37 U/L）。离心管于50 °C、120 rpm摇床孵育48 h。糖化开始48 h后，在同一50 mL离心管中接种K. marxianus NBRC 1777至终OD600为20（约相当于100 g湿细胞/L），继续乙醇发酵24 h。淀粉酶与酵母添加量依据此前生物量糖化与乙醇发酵的文献设定。不添加蛋白胨、酵母浸出粉等其他营养物质。离心管用带气体单向阀的硅胶塞密封以释放CO₂，于40 °C、120 rpm摇床孵育。48 h酶反应期间在0、12、24、48 h取样，随后24 h乙醇发酵期间在0、6、12、18、24 h取样。样品21,500 ×g离心1 min，上清冷冻保存，按下述高效液相色谱（HPLC）法测定葡萄糖与乙醇。
【数据】糖化体积：5 mL；负载：100 g-DCW/L；淀粉酶混合物：0.1 g/L（α-淀粉酶56 U/L、糖化酶37 U/L）；糖化：50°C、120 rpm、48 h；接种OD600：20（约100 g湿细胞/L）；发酵：40°C、120 rpm、24 h；取样点：糖化0/12/24/48 h，发酵0/6/12/18/24 h；离心：21,500 ×g、1 min
分析。 培养过程中通过测定OD730评估S. elongatus UTEX 2973细胞浓度。干细胞浓度按每OD730相当于0.35 g-DCW/L的换算系数估算，该系数由实验确定的相
【数据】换算系数：0.35 g-DCW/L per OD730；测定波长：730 nm
研究结果
富糖原S. elongatus UTEX 2973生物量的制备。 为制备用于后续酶解糖化与发酵的富糖原S. elongatus UTEX 2973生物量，进行了7天光自养培养。图2显示光自养培养过程中干细胞浓度与糖原含量的时间曲线。细胞浓度随培养时间增加，在所考察培养条件下培养3–4天后达到2.5 g-干细胞/L。糖原含量也从第2天的23%逐渐升高至第5–7天的约40%。培养7天后收获蓝细菌细胞，这些富糖原S. elongatus UTEX 2973作为后续实验的生物量来源。
【数据】培养时间：7天；细胞浓度：2.5 g-干细胞/L（3–4天）；糖原含量：23%（2天）→约40%（5–7天）
用于后续酶解糖化的S. elongatus UTEX 2973预处理方法筛选。 为选择适合S. elongatus UTEX 2973糖原酶解糖化的预处理方法，将蓝细菌悬浮液（100 g/L）分别用不同方法（溶菌酶、超声、微波）预处理，然后对预处理蓝细菌生物量进行低生物量负载（10 g/L）糖化实验，评价酶对蓝细菌糖原的可及性。表1显示各种预处理后S. elongatus UTEX 2973糖原的葡萄糖得率。未预处理时葡萄糖得率仅18%；超声预处理30 min为33%；溶菌酶预处理24 h为40%；而微波预处理100 s时葡萄糖得率接近100%。在本研究所考察的特定操作条件下，微波预处理以最短操作时间表现出最高效率。因此选择微波作为酶解胞内糖原前预处理S. elongatus UTEX 2973的候选方法。尽管与替代方法进行严格比较尚需进一步优化，当前结果表明所试微波条件非常适合快速提高糖原可及性。
【数据】生物量负载：100 g/L（预处理）、10 g/L（糖化）；葡萄糖得率：未预处理18%、超声30 min 33%、溶菌酶24 h 40%、微波100 s近100%
富糖原S. elongatus UTEX 2973的微波预处理与后续酶解糖化。 作为预实验，将蓝细菌悬浮液（100 g/L）微波预处理0、50、100、150或200 s，随后对S. elongatus UTEX 2973进行形态学观察。图3显示微波预处理后S. elongatus UTEX 2973悬浮液的照片与显微图像。无论微波预处理时长如何，悬浮液颜色均由绿色变为棕色（图3A–E）。显微图像显示，微波预处理时长至200 s时，蓝细菌细胞发生聚集并膨胀（图3F–J）。
【数据】悬浮液浓度：100 g/L；微波时间：0、50、100、150、200 s；现象：颜色绿→棕、细胞聚集膨胀
为考察S. elongatus UTEX 2973糖原酶解糖化的适宜微波预处理时间，将蓝细菌悬浮液（100 g/L）微波预处理0、50、100、150或200 s，然后对预处理蓝细菌生物量进行低生物量负载（10 g/L）糖化实验，评价酶对蓝细菌糖原的可及性。图4显示S. elongatus UTEX 2973糖原葡萄糖得率与预处理时间的关系。预处理0 s时葡萄糖得率仅18%；葡萄糖得率随预处理时间显著增加，微波预处理100 s及以上时接近100%（图4，实心符号）。尽管确切的主导因素尚待充分阐明，这些物理改变——如可能的细胞壁破坏、膜通透性增加或糖原暴露增强——很可能提高了酶对胞内糖原的可及性。由此发现，微波处理作为S. elongatus UTEX 2973胞内糖原酶解糖化前的预处理是有效的，在本研究条件下微波预处理100–150 s已足够。
【数据】生物量负载：100 g/L（预处理）、10 g/L（糖化）；微波时间：0、50、100、150、200 s；葡萄糖得率：0 s为18%，100 s及以上近100%
微波预处理富糖原S. elongatus UTEX 2973的糖化与乙醇发酵。 为对微波预处理富糖原S. elongatus UTEX 2973进行糖化与乙醇发酵，将蓝细菌悬浮液（糖原含量42%、100 g/L）微波预处理0、50、100或150 s，进行高负载（100 g/L）酶解糖化，随后乙醇发酵。上一节已发现微波预处理100–150 s足够；但为理解不同微波预处理时长下蓝细菌生物量糖化及后续发酵的时间进程，仍设置0、50、100、150 s预处理。图5显示不同预处理时间（0、50、100、150 s）下富糖原S. elongatus UTEX 2973酶解糖化与酵母发酵过程中葡萄糖和乙醇浓度的时间曲线。葡萄糖浓度随反应时间增加至48 h，加入酵母细胞开始乙醇发酵6 h后已检测不到葡萄糖。发酵6 h后乙醇浓度几乎恒定。预处理时间由0 s延长至100 s时，葡萄糖浓度与乙醇浓度更高；100 s与150 s的曲线几乎重合。预处理150 s时，48 h（糖化结束）葡萄糖浓度达44 g/L，对应葡萄糖得率94%。乙醇发酵开始6 h后乙醇浓度达21 g/L，对应基于所产葡萄糖的理论值的94%、基于所用蓝细菌糖原的理论值的88%。这些结果表明，微波预处理富糖原S. elongatus UTEX 2973可成为后续酶解糖化与发酵的关键。
【数据】糖原含量：42%；悬浮液浓度：100 g/L；微波时间：0、50、100、150 s；糖化负载：100 g/L；糖化时间：48 h；葡萄糖浓度：44 g/L（150 s）；葡萄糖得率：94%；乙醇浓度：21 g/L（发酵6 h）；乙醇得率：基于葡萄糖理论值94%、基于糖原理论值88%
讨论与解读
本研究首次证明，微波预处理富糖原S. elongatus UTEX 2973可显著强化后续酶解糖化与乙醇发酵。作为生物乙醇原料的富糖原蓝细菌通常靠限氮培养获得，但限氮普遍导致生长变慢、细胞浓度降低；因此需要一种在富氮下仍快速生长且高积累糖原的菌株。S. elongatus UTEX 2973正具备生长快、富氮下糖原含量仍达40–50%的特性，故被选为原料。研究中培养的菌体沉淀于−25 °C保存至使用，冷冻是为保存无法一次用完的细胞；原文对冻融本身影响的考察在节选处中断，具体结果原文未详述。微波预处理使悬浮液由绿变棕、细胞聚集膨胀，作者认为细胞壁破坏、膜通透性增加或糖原暴露等物理改变提高了酶可及性，但主导因素尚未完全阐明。与溶菌酶（24 h、40%）和超声（30 min、33%）相比，微波100 s即接近完全糖化，时间优势明显。
编译者解读。 该研究的工程价值在于"预处理即强化"：不改造菌株、不加营养，仅用200 W家用级微波100–150 s就把糖化得率从18%推到近100%，并在100 g/L高固含量下拿到44 g/L葡萄糖和21 g/L乙醇，流程简洁、易于放大。局限也明显——微波在放大反应器中的穿透深度与能耗尚未评估，且作者自认主导机制未明。对合成生物学而言，若把糖原合成通路与耐受性改造叠加，配合此类物理预处理，或可进一步压缩成本。
参考来源
期刊：Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.06.004
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.06.004