来源：The LtrA protein positively regulates borrelidin biosynthesis in Streptomyces rochei by modulating borB expression and interacting with key cellular proteins（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
Borrelidin是一种具有强效抗卵菌活性的聚酮类代谢物，其生物合成调控机制长期不明。本研究以具有良好生防潜力的Streptomyces rochei JK1为对象，通过紫外诱变筛选获得borrelidin合成缺失突变体60 s1，经全基因组重测序锁定LtrA为正调控因子。研究进一步通过部分截短与过表达验证其功能，并揭示LtrA通过上调borB表达、与FtsK/SpoIIIE及Crp/Fnr互作整合基因组稳定性与cAMP信号通路。ltrA过表达使borrelidin产量提升78.84%，为微生物源农药的遗传改良提供了可操作靶点。
研究背景
链霉菌是天然抗生素和生物活性次级代谢产物的主要生产者，其次级代谢调控机制一直是微生物学与合成生物学关注的核心问题。Borrelidin作为聚酮类代谢物，对疫霉等多种病原卵菌具有显著拮抗作用，在土传病害生物防治中应用价值突出。然而，borrelidin生物合成的调控网络——尤其是关键调控基因与分子机制——长期不清楚，严重制约了通过基因工程提升生产菌株合成效率与生防性能的尝试。
Streptomyces rochei JK1是一株具有良好生防潜力的放线菌，通过产生borrelidin等活性代谢物抑制多种土传卵菌，并能稳定定殖于作物根际与根组织，其发酵滤液具有稳定的抑制活性，对减少化学农药依赖、推动生物农药开发具有价值。该菌株对生姜根腐病病原菌Pythium myriotylum表现出显著拮抗活性。生姜作为全球重要经济作物，其生产长期受到根腐病的严重威胁。在此背景下，解析JK1中borrelidin合成的调控枢纽，既是基础科学问题，也是工程化改造的前提。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
Streptomyces rochei JK1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No. 17115）。所有链霉菌菌株在28 °C下于高氏一号琼脂培养基上培养，并在28 °C、180 rpm条件下于玉米粉液体培养基中发酵；Pythium myriotylum SWQ7在V8琼脂培养基上培养。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，大肠杆菌ET12567/pUZ8002作为大肠杆菌—链霉菌属间接合转移的供体菌，大肠杆菌Rosetta(DE3)用于蛋白表达。实验所需培养基包括：高氏一号培养基（20 g/L可溶性淀粉、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L K₂HPO₄、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、1 g/L KNO₃、15 g/L琼脂）、玉米粉培养基及其三种改良版本（均含2 g/L NaCl、3 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L CaCO₃、10 g/L玉米粉，原始版本及改良玉米粉培养基1、2、3的碳源分别为10 g/L蔗糖、果糖、木糖和葡萄糖）、基本培养基（MM：0.5 g/L L-天冬酰胺、0.5 g/L K₂HPO₄、0.3 g/L KOH、0.2 g/L MgSO₄·7H₂O、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、15 g/L琼脂、10 g/L 50%葡萄糖）、V8培养基（100 mL/L V8汁、1 g/L CaCO₃、15 g/L琼脂）、LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/L琼脂）和2×YT培养基（16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）。
【数据】菌株：Streptomyces rochei JK1（CGMCC No. 17115）、Pythium myriotylum SWQ7、E. coli DH5α、ET12567/pUZ8002、Rosetta(DE3)；培养温度：28 °C；转速：180 rpm；高氏一号琼脂：可溶性淀粉20 g/L、NaCl 0.5 g/L、K₂HPO₄ 0.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L、KNO₃ 1 g/L、琼脂15 g/L；改良玉米粉培养基碳源：蔗糖/果糖/木糖/葡萄糖各10 g/L；MM：L-天冬酰胺0.5 g/L、K₂HPO₄ 0.5 g/L、KOH 0.3 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L、琼脂15 g/L、50%葡萄糖10 g/L；V8：V8汁100 mL/L、CaCO₃ 1 g/L、琼脂15 g/L；LB：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂15 g/L；2×YT：胰蛋白胨16 g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L
2.2 核酸提取与cDNA合成
基因组DNA采用Quick Plant Genomic DNA Extraction Kit（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）提取，总RNA采用Ultra-Pure RNA Extraction Kit（康为世纪生物科技有限公司）提取。DNA与RNA的纯度/浓度通过分光光度法测定260 nm/280 nm及260 nm/230 nm吸光度比值评估。cDNA合成采用Evo M-MLV Reverse Transcription Premix Kit（湖南艾科瑞生物科技有限公司）完成。
【数据】检测波长：260 nm/280 nm、260 nm/230 nm；试剂盒：Quick Plant Genomic DNA Extraction Kit、Ultra-Pure RNA Extraction Kit、Evo M-MLV Reverse Transcription Premix Kit；其他参数：原文未详述
2.3 紫外（UV）诱变与抑制活性改变突变体的筛选
制备Streptomyces JK1孢子悬液并调整至约10⁸ cfu/mL。悬液以30 W紫外灯（距离20 cm）照射60 s（诱变剂量）。诱变后悬液避光放置2 h，梯度稀释后涂布于平板培养基，28 °C培养2–3天。随机挑取约2000个单菌落，采用平板对峙法筛选对Pythium myriotylum拮抗活性改变的突变体。复筛时，将抑菌圈显著增大或减小的突变体用相同方法重新评估以确认表型。
【数据】孢子悬液浓度：约10⁸ cfu/mL；紫外灯功率：30 W；照射距离：20 cm；照射时间：60 s；避光时间：2 h；培养温度：28 °C；培养时间：2–3天；筛选单菌落数：约2000个
2.4 全基因组测序与突变检测
对紫外诱变获得的一株拮抗活性差异突变体（60 s1）进行全基因组重测序。经摇瓶发酵复筛后，将其高纯度基因组DNA送至南京奥维森基因科技有限公司，在Illumina NovaSeq 6000平台测序（150 bp双端[PE150] reads，测序深度≥100×）。原始测序数据用Fastp进行质控，比对至野生型JK1基因组，并使用breseq计算流程预测突变。该流程可检测点突变、缺失及可能指示IS元件插入或其他重排的新序列连接，具体如其在线文档所述。大片段重复与扩增通过检查各基因组读段覆盖深度人工预测。随后，突变位点经PCR扩增；PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，DNA/推导氨基酸序列通过SnapGene比对，以确认错义、移码或无义突变。原始全基因组重测序数据已存入NCBI Sequence Read Archive（SRA），BioProject登录号PRJNA1463974。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000；读长：150 bp PE150；测序深度：≥100×；质控工具：Fastp；突变预测流程：breseq；SRA登录号：PRJNA1463974；其他参数：原文未详述
2.5 Borrelidin的高效液相色谱（HPLC）分析
取1 mL发酵液转入1.5 mL离心管，离心沉淀菌丝体。弃上清，收集的菌丝沉淀与200 μL 50%甲醇混合。超声溶解提取胞内代谢物后，12000 rpm离心15 min。取100 μL所得上清作为供试品溶液，进样HPLC系统测定峰面积。对照品方面，取5 μL Borrelidin溶液（50.00 μg/mL）进样HPLC系统测定峰面积。另外，取70 μL供试品进样HPLC系统，测定其峰面积。
【数据】发酵液取样量：1 mL；提取溶剂：200 μL 50%甲醇；离心转速：12000 rpm；离心时间：15 min；供试品进样量：100 μL（峰面积测定）/70 μL；对照品：Borrelidin 50.00 μg/mL、进样5 μL；其他参数：原文未详述
2.6 RT-qPCR基因表达分析
实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）使用LightCycler® 96 System（罗氏集团，瑞士）和SYBR Green Pro Taq HS Premix qPCR Kit（湖南艾科瑞生物科技有限公司）进行。所有RT-qPCR数据通过Microsoft Excel中的2−ΔΔCt法分析，目标基因循环阈值（Ct）以参考基因16S rRNA归一化。基因表达分析引物序列列于表S1。每个反应设三个生物学重复和三个技术重复。
【数据】仪器：LightCycler® 96 System；试剂盒：SYBR Green Pro Taq HS Premix qPCR Kit；分析方法：2−ΔΔCt法；参考基因：16S rRNA；重复数：3个生物学重复+3个技术重复；其他参数：原文未详述
2.7 60 s1的转录组分析
将Streptomyces接种于G1液体培养基，28 °C、180 rpm振荡培养48–72 h。随后取5–10 mL菌液于4 °C、8000 ×g离心5 min收集菌丝体，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，液氮速冻，−80 °C保存并于干冰运输。总RNA采用改良CTAB法提取：液氮研磨破碎细胞壁，随后与65 °C预热的CTAB裂解缓冲液（含2% β-巯基乙醇）孵育20 min。经氯仿/异戊醇抽提、异丙醇沉淀和75%乙醇洗涤后，RNA溶于无RNase水。Agilent 2100检测RIN >7.5、23S/16S ≈ 2:1；Qubit定量显示≥50 ng/μL、总RNA ≥1 μg。使用MGIEasy试剂盒（探针法）去除rRNA并富集mRNA（比例>30%）。mRNA经Mg²⁺片段化至200–300 bp；以随机六聚体合成链特异性cDNA。经末端修复、加A尾、接头连接及12–15个循环PCR构建文库（主峰300–400 bp，浓度≥2 nM），随后在DNBSEQ G400/T7平台进行PE100/150测序（10–30 M clean reads，Q30 ≥ 94%）。通过SOAPnuke（v1.6.5）过滤获得clean data。Bowtie2（v2.4.5）用于参考基因组比对（比对率>80%）；TPM由RESM（v1.3.1）计算。StringTie（v2.2.1）预测新转录本；DESeq2筛选DEG（FC ≥2，adj P ≤ 0.001）。结合KEGG/COG/GO注释与antiSMASH次级代谢产物簇预测，采用phyper富集分析（Q ≤ 0.05）和Mfuzz（v2.60.0）分析时序表达模式。原始转录组测序数据已存入NCBI SRA，BioProject登录号PRJNA1463149。
【数据】培养温度：28 °C；转速：180 rpm；培养时间：48–72 h；离心：4 °C、8000 ×g、5 min；菌液量：5–10 mL；CTAB裂解孵育：65 °C、20 min、2% β-巯基乙醇；RIN：>7.5；23S/16S：≈2:1；RNA浓度：≥50 ng/μL；总RNA量：≥1 μg；mRNA比例：>30%；片段化大小：200–300 bp；文库主峰：300–400 bp；文库浓度：≥2 nM；PCR循环：12–15；测序平台：DNBSEQ G400/T7；clean reads：10–30 M；Q30：≥94%；比对率：>80%；DEG标准：FC ≥2、adj P ≤ 0.001；富集标准：Q ≤ 0.05；软件版本：SOAPnuke v1.6.5、Bowtie2 v2.4.5、RESM v1.3.1、StringTie v2.2.1、Mfuzz v2.60.0；SRA登录号：PRJNA1463149
2.8 遗传操作与载体构建
所有遗传构建体均采用标准分子克隆技术创建。ltrA敲除载体以pKC1139为骨架构建。
【数据】骨架质粒：pKC1139；其他参数：原文未详述
研究结果
3.1 LtrA被鉴定为borrelidin合成的关键正调控因子
为鉴定控制野生型JK1拮抗活性的调控元件，我们对JK1单孢子悬液施加不同时长紫外诱变构建突变体库。所得突变体逐一通过针对Pythium myriotylum的平板对峙实验和borrelidin产量的HPLC分析进行筛选，由此获得突变体60 s1。该突变体完全丧失了对P. myriotylum的抑制作用（图1A）。HPLC分析证实该突变体中borrelidin产量低于检测限（图1B）。对60 s1的全基因组重测序仅发现三个基因存在点突变：arr、rpoB和ltrA。ltrA编码序列第122 bp处的点突变（C变为T）产生提前终止密码子，导致翻译提前终止，形成截短的无功能LtrA蛋白。arr与rpoB的详细点突变信息见文件S2。据先前报道，arr与rpoB是与利福平抗性相关的已知基因，且突变体60 s1同样表现出Rif抗性（图1C）。在利福平选择压力下，我们此前筛选到一株突变株JK1–4，全基因组测序证实其携带与突变体60 s1相同的arr和rpoB点突变，但ltrA无突变。重要的是，JK1–4仍正常产生borrelidin（图1D）。因此，我们推断ltrA是borrelidin生物合成的关键调控因子。
为进一步验证LtrA的功能，我们分析了borB的表达——borB是borrelidin生物合成基因簇中的关键基因，编码II型硫酯酶，负责水解错误酰基中间体以保证途径保真性。RT-qPCR显示，与野生型JK1相比，LtrA缺陷的60 s1中borB转录水平显著下调（图1E）。这表明LtrA缺失通过抑制borB表达阻碍borrelidin骨架的正确组装与释放，最终中止其生物合成。
【数据】突变体：60 s1；突变位点：ltrA编码序列第122 bp处C→T；突变基因：arr、rpoB、ltrA；borrelidin产量：低于检测限；borB转录水平：显著下调（具体倍数原文未详述）；其他参数：原文未详述
3.2 突变体60 s1的转录组分析揭示广泛的代谢重编程
为系统解析LtrA缺陷的分子后果，我们对野生型JK1与突变体60 s1进行了比较转录组分析。共鉴定出960个差异表达基因（DEG），其中126个上调、834个下调（图2A、B）。基因表达模式的层次聚类清晰区分了JK1与60 s1样本，证实LtrA缺失引发全局转录重编程（图2C）。Gene Ontology（GO）与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析显示，这些DEG广泛参与核心生物学过程，包括细胞代谢、应激响应、信号转导和转录调控（图2D、E）。高差异表达基因的完整列表，包括Gene ID、FPKM值、log₂倍数变化、P值和Q值，见表S3。
【数据】DEG总数：960个；上调：126个；下调：834个；分析工具：GO、KEGG富集；其他参数：原文未详述
3.3 ltrA基因的部分缺失与过表达验证其对borrelidin生物合成的调控作用
为阐明LtrA在borrelidin合成中的作用，我们最初尝试在野生型菌株JK1中构建ltrA全长缺失突变体，但完全敲除未获成功，推测源于基因必需性。因此，我们通过同源重组在野生型JK1背景中构建了靶向部分截短突变体（FA4）（图3A），移除N端194 bp区域——该区域包含与60 s1中122 bp突变位点对应的功能关键片段。使用引物YZ-LTRA-F/R的菌落PCR扩增出预期条带。Sanger测序证实，突变体FA4的上部片段为194 bp，而野生型菌株相应片段为190 bp。表型分析显示，FA4在原始发酵培养基中生长但产生很少次级代谢产物（图3B），在以蔗糖为碳源的玉米粉培养基中结果类似；然而，在单糖优化培养基中其恢复了次级代谢产物生产，尽管在果糖改良培养基中对Pythium myriotylum的拮抗活性显著低于野生型JK1（图3C、D），证实拮抗功能部分保留。同时构建了ltrA过表达突变体：PCR验证证实pSET152-ltrA成功整合至ltrA过表达菌株ltrA-152基因组中，而野生型JK1中未观察到目标条带。表型分析显示，FA4在标准培养基中次级代谢受损，但在单糖优化培养基中可部分恢复。其拮抗活性仍显著低于野生型，证实功能部分保留但减弱（图3B–D）。与之形成鲜明对比的是，ltrA过表达菌株ltrA-152对P. myriotylum的抑制率提高7.64%（图3E），borrelidin产量显著提升78.84%（增加8.46 μg/mL，图3F）。关键生物合成基因borB的动态表达分析显示，与野生型相比，ltrA-152在培养第2天时borB转录水平上调58.73倍（图3G）。采用对数Y轴以更好显示不同时间点表达变化的较大动态范围。这表明ltrA过表达在早期阶段强效激活borrelidin生物合成级联。综上，这些遗传操作提供了确凿证据：LtrA是borrelidin合成的正调控因子，其N端194 bp区域对其功能至关重要。
【数据】截短区域：N端194 bp；FA4上部片段：194 bp（野生型190 bp）；ltrA-152抑制率提升：7.64%；borrelidin产量提升：78.84%（增加8.46 μg/mL）；borB转录上调：第2天58.73倍；其他参数：原文未详述
3.4 LtrA通过调控并直接互作FtsK/SpoIIIE来调节遗传稳定性与应激响应
基于上述转录组分析，ftsK/spoIIIE基因表现出显著变化。FtsK/SpoIIIE家族蛋白是染色体分离和基因组完整性维持所必需的DNA转位酶。RT-qPCR（图4A）显示，敲除突变体FA4中ftsK/spoIIIE表达较野生型JK1显著下调3.74倍。表型上，FA4在孢子萌发过程中异常菌落比例显著升高（图4B）。
【数据】基因：ftsK/spoIIIE；FA4中下调：3.74倍；表型：异常菌落比例显著升高；其他参数：原文未详述
3.5 LtrA与Crp/Fnr的调控关联与互作
RT-qPCR分析显示，与野生型JK1相比，FA4中Crp/Fnr表达大幅下调（降低3.36倍）（图5A）。cAMP补充对FA4形态和抗真菌活性的影响实验表明，添加cAMP可恢复ltrA突变体形态，但未能恢复JK1对Pythium myriotylum的抑制活性（图5B），表明LtrA介导的borrelidin调控独立于形态控制。
【数据】基因：Crp/Fnr；FA4中下调：3.36倍；cAMP处理：恢复形态但未恢复抑制活性；其他参数：原文未详述
3.6 ltrA过表达菌株对生姜根腐病的生防效果
盆栽实验以Pythium myriotylum菌株SWQ7侵染生姜植株，展示不同处理条件下的病害症状（图6A–E）。生防效果比较见图6F、G。
【数据】病原菌：Pythium myriotylum SWQ7；实验类型：盆栽实验；其他参数：原文未详述
3.7 LtrA对borrelidin的预测调控网络图
borE、borD、borC、borB、B7与B6之间的关系源自研究"Biosynthesis of the Angiogenesis Inhibitor Borrelidin by Streptomyces parvulus Tü4055: Cluster Analysis and Assignment of Functions"（图7）。
【数据】涉及基因：borE、borD、borC、borB、B7、B6；其他参数：原文未详述
讨论与解读
LtrA在borrelidin生物合成中的核心调控作用，置于次级代谢产物生物合成所涉及的复杂调控网络背景下尤为清晰——其中转录调控因子与必需功能蛋白扮演着特别关键的角色。紫外诱变突变体60 s1完全丧失对Pythium myriotylum的抑制，且检测不到borrelidin；全基因组测序显示ltrA、rpoB和arr发生突变。由于先前研究证实rpoB/arr突变（如菌株JK1–4）仅赋予利福平抗性而不影响borrelidin产量，LtrA的功能丧失是borrelidin合成中断的核心原因。截短突变体FA4（在单糖培养基中部分恢复次级代谢产物合成、拮抗活性降低）与过表达菌株ltrA-152（borrelidin产量提高78.84%、对P. myriotylum抑制率提高7.64%）的表型验证进一步支持这一点，首次提供证据表明LtrA是borrelidin合成的正调控因子，其194 bp N端片段为关键功能区域。类似地，在链霉菌中，亮氨酸响应调控蛋白SlcG_Lrp通过直接激活林可霉素生物合成簇中的结构基因（如lmba、lmbv）、抗性基因（如lmra、lmrb）和调控基因（如lmbu）精确调控林可霉素合成——它通过特异性结合靶基因启动子促进转录。
编译者解读：本研究以经典诱变—测序—遗传验证路径锁定LtrA，逻辑链条完整，且过表达即获78.84%产量提升，工程可行性好。但LtrA作为推测的调控蛋白，其直接靶标（是否结合borB启动子）尚未用EMSA或ChIP验证，与FtsK/SpoIIIE、Crp/Fnr的"互作"也停留在关联层面。对合成生物学而言，ltrA是现成的产量提升元件，但要用作可预测的调控部件，还需补足剂量效应与宿主普适性数据。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2026
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154974
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154974