来源：Inoculation of Aspergillus strain OA3 enhances aflatoxin B1 and ochratoxin a degradation and improves quality of Fu tea（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
茯茶固态发酵依赖微生物群落，但环境波动易导致产毒真菌增殖，黄曲霉毒素B1（AFB1）与赭曲霉毒素A（OTA）污染成为产业痛点。本研究以从茯砖茶中分离的曲霉OA3菌株进行人工接种发酵，与自然发酵平行对比，系统评估毒素降解率、细胞安全性、呈色、"金花"数量、理化组分、挥发性与非挥发性代谢物及抗氧化活性。结果显示OA3接种使AFB1与OTA降解率分别达95.56%与90.38%，显著高于自然发酵的68.93%与56.11%，并伴随更丰富的风味氨基酸保留与更强的抗氧化能力。
研究背景
茯茶是特色后发酵茶，其品质核心在于以冠突曲霉（Aspergillus cristatum）为中心、多种真菌协同的固态发酵过程。然而发酵微生物组成极易受环境条件影响。在不利生长环境下，曲霉、青霉、镰刀菌等产毒真菌可能增殖并合成危险霉菌毒素，其中黄曲霉毒素与OTA是黑茶产品中最常检出的污染物。霉菌毒素污染已成为突出的食品安全风险，严重制约茯茶产业高质量发展。AFB1与OTA是污染茯茶毒性最强、检出最广的两种霉菌毒素。多项实地调查已证实其在商品黑茶中的实际存在：一项针对228份中国黑茶样品（含茯茶）的调查中，21份检出OTA，浓度跨度2.510–12.620 μg/kg，同时分离出产OTA的黑曲霉菌株；另有报道在商品茯茶样品中检出AFB1（1.24 μg/kg），直接说明该产品的潜在健康危害。在此背景下，通过人工接种优势菌株定向调控发酵过程，成为兼顾安全性与品质的可行策略。本研究即以曲霉OA3为接种剂，从安全性、呈色、化学成分、挥发性风味、非挥发性代谢物与抗氧化活性多个维度，与自然发酵进行系统比较。
研究方法
2.1 材料与试剂
原料黑茶来自咸阳泾渭茯茶有限公司。曲霉OA3菌株由本实验室从茯砖茶中分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC，保藏号42157），并登录GenBank（登录号：PV616835）（Han, Liu, et al., 2025）。AFB1（≥ 99.5%）与OTA（≥ 99.1%）标准品购自Pribolab生物工程有限公司（中国青岛），分别溶于色谱级甲醇配制100 μg/mL储备液。该溶液存于−20 °C棕色玻璃瓶中以防光降解，一个月内使用。癸酸乙酯（≥ 99%）、没食子酸（GA，≥ 99%）、(−)-表没食子儿茶素（EGC，≥ 98%）、(+)-儿茶素（C，≥ 97%）、(−)-表儿茶素（EC，≥ 97%）、(−)-表儿茶素没食子酸酯（ECG，≥ 98%）与(−)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，≥ 98%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）购自北京奥博星生物技术有限公司（中国北京）。芦丁（≥ 95%）购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。18种氨基酸标准品（≥ 98%）购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）。CCK-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒及无水硫酸镁（MgSO4）购自北京索莱宝科技有限公司（中国北京）。用于抗氧化活性评价的ABTS与DPPH试剂购自西安卡西奈生物科技有限公司（中国西安）。其余试剂均购自本地公司。
【数据】菌株：曲霉OA3（CGMCC 42157；GenBank PV616835）；AFB1标准品纯度：≥ 99.5%；OTA标准品纯度：≥ 99.1%；储备液浓度：100 μg/mL；储存温度：−20 °C；储存条件：棕色玻璃瓶避光；使用期限：1个月
2.2 接种发酵与自然发酵不同发酵阶段茯茶的制备
发酵前，茶叶经匀质化以保证初始组成一致。匀质化批次随后分别用于原料对照、自然发酵与曲霉OA3接种发酵处理。制备参照GH/T 1246–2019《茯茶加工技术规程》并作小幅修改。为独立评价曲霉OA3的霉菌毒素降解能力及其对茶叶品质的影响，设置两组平行发酵：自然发酵（不接种）与OA3接种发酵。安全性评价组在发酵前向茶样中加标AFB1与OTA（各20 μg/kg）；另一组加入等体积无菌水用于品质评价。孢子悬液制备、接种、发酵条件与取样的详细步骤见支持信息1。从自然发酵与曲霉OA3接种发酵过程中分别采集代表不同发酵阶段（0、6、12天）的样品及终产品。此后，收获样品命名如下：原料黑茶（R）；曲霉OA3接种发酵0、6、12天样品（F0、F6、F12）及终产品（FFP）；自然发酵0、6、12天样品（N0、N6、N12）及终产品（NFP）。每种发酵方式在每个时间点制备6个重复样品：3个加标霉菌毒素用于安全性评价（降解率分析），另3个不加毒素用于品质评价。所有样品立即存于−40 °C备用。
【数据】加标浓度：AFB1 20 μg/kg、OTA 20 μg/kg；发酵阶段取样时间：0、6、12天；每处理每时间点重复数：6个（3个加标+3个不加标）；样品储存温度：−40 °C；标准依据：GH/T 1246–2019
2.3 发酵过程中茯茶AFB1与OTA残留的比较分析
依照本课题组已建立的提取与检测方法（Han, Wang, et al., 2025），本研究通过比较分析各茶样中AFB1与OTA残留水平，综合评价自然发酵与曲霉OA3接种发酵的安全性。具体方法内容见支持信息2。霉菌毒素降解率按式(1)计算：
降解率 % = (C0 − Ct) / C0 × 100 (1)
式中Ct与C0分别为测试样与对照样中AFB1/OTA的浓度。
【数据】计算公式：降解率% = (C0 − Ct)/C0 × 100；C0：对照浓度；Ct：测试浓度；原文未详述色谱参数（见支持信息2）
2.4 细胞安全性评估
细胞毒性评估参照已建立方法，采用人结直肠腺癌Caco-2细胞（Tan et al., 2025）。受试样品分为四组：1）加标霉菌毒素的原料黑茶；2）加标霉菌毒素的自然发酵终产品；3）加标霉菌毒素的曲霉OA3接种发酵终产品；4）未加标霉菌毒素的原料黑茶（对照）。准确称取茶粉0.1 g，用1.2 mL 70%（vol/vol）甲醇水溶液提取制备储备液。涡旋后，混合物于室温避光孵育2 h。提取后，样品于4 °C、10,000 rpm离心15 min。随后取1 mL上清，在温和氮气流下蒸干。残渣用1 mL细胞培养基复溶，得到100 mg/mL储备液。随后经二倍系列稀释，配制成50.00、25.00、12.50与6.25 mg/mL浓度系列用于生物测定。Caco-2细胞复苏后维持于高糖DMEM培养基（含10%（v/v）胎牛血清（Gibco，美国）与1%（v/v）青霉素-链霉素），37 °C、5% CO₂培养。以2 × 10⁵ cells/mL密度（100 μL/孔）在96孔板中培养24 h后，单层用PBS洗三次，随后用100 μL茶提取物处理6 h，使终浓度达62.5–1000 μg/mL。后续步骤为吸去上清，并用PBS重复冲洗细胞三次。每孔加入10 μL CCK-8试剂与90 μL完全DMEM培养基的混合物孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm吸光度（OD450）。细胞活力按式(2)以OD450值计算，以DMEM培养基为空白，并以未处理对照归一化。
细胞活力 % = (A − A0) / (AC − A0) × 100 (2)
式中A、AC与A0分别为测试孔、对照孔（未处理细胞）与空白孔（仅培养基）的吸光度。
【数据】细胞系：人结直肠腺癌Caco-2；茶粉用量：0.1 g；提取液：1.2 mL 70%甲醇水溶液；提取时间：2 h；提取温度：室温避光；离心：10,000 rpm、15 min、4 °C；储备液浓度：100 mg/mL；稀释系列：50.00、25.00、12.50、6.25 mg/mL；接种密度：2 × 10⁵ cells/mL；每孔体积：100 μL；培养时间：24 h；提取物处理时间：6 h；终浓度范围：62.5–1000 μg/mL；CCK-8孵育：2 h（10 μL试剂+90 μL培养基）；检测波长：450 nm；CO₂浓度：5%；培养温度：37 °C
2.5 茶汤色度测定
茶汤制备：1 g茶样于100 mL去离子水中煮沸10 min。以去离子水为空白，用CS-820色差仪（杭州彩谱科技有限公司，中国）测定茶汤颜色。总色差（ΔE*ab）计算与绘图工具详见支持信息3。
【数据】茶样量：1 g；水量：100 mL去离子水；煮沸时间：10 min；仪器：CS-820色差仪；空白：去离子水
2.6 茯茶发酵过程中冠突曲霉的动态计数
比较自然发酵与曲霉OA3接种发酵中冠突曲霉生长动态时，依照GB 4789.15–2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》，称取25 g茶叶加入含225 mL 0.85%生理盐水的无菌袋中。简要流程：25 g茶样于225 mL 0.85%盐水中匀质，系列稀释后涂布PDA培养基，28 °C培养5天。对可计数范围（10–150 CFU）内的菌落进行计数。完整操作细节见支持信息4。
【数据】茶样量：25 g；稀释液：225 mL 0.85%生理盐水；培养基：PDA；培养温度：28 °C；培养时间：5天；计数范围：10–150 CFU；标准依据：GB 4789.15–2016
2.7 主要活性与营养成分分析
总黄酮与总酚含量分别采用氯化铝比色法与Folin-Ciocalteu法测定，以芦丁（原文此处截断）……
【数据】总黄酮方法：氯化铝比色法；总酚方法：Folin-Ciocalteu法；表达基准：芦丁（原文后续内容未详述）
研究结果
3.1 曲霉OA3对茯茶安全性的影响
本研究比较自然发酵与曲霉OA3接种发酵在霉菌毒素降解率与细胞毒性上的差异，以全面评价OA3接种发酵对茯茶安全性的提升效果。两种发酵策略的降解效率存在显著差异。AFB1与OTA降解率在发酵时程上表现出显著差异。具体而言，第16天AFB1与OTA的降解率均显著高于第0、6、12天（单因素方差分析后Duncan多重比较，p < 0.05）。在同一发酵终点，曲霉OA3接种发酵终产品组降解率显著更高，AFB1达95.56 ± 1.32%、OTA达90.38 ± 3.48%，大幅超过自然发酵终产品组（分别为68.93 ± 0.78%与56.11 ± 3.48%）（Origin成对比较插件两两比较，p < 0.001）。相应地，生物毒性分析证实了曲霉OA3接种发酵更强的脱毒效果。加标霉菌毒素的原料黑茶提取物处理显著损害Caco-2细胞活力，降至75.16 ± 0.95%。与之对应，曲霉OA3接种发酵终产品处理的Caco-2细胞活力高于自然发酵终产品组，并与无毒素对照组相当（分别为90.67 ± 3.95%、83.6 ± 3.33%与93.72 ± 3.37%；单因素方差分析后Duncan多重比较，p < 0.05；图1C）。曲霉OA3发酵的高效霉菌毒素降解归因于生物降解而非物理吸附。本课题组前期工作表明，热灭活的OA3丧失降解活性（Han, Wang, et al., 2025），证实为代谢依赖型脱毒。在当前体系中，OA3降解率显著高于自然发酵，排除了基质效应。体外细胞毒性试验进一步支持该结论：发酵产物使细胞活力恢复至与无毒素对照相当的水平——这一发现证实毒素发生了结构修饰而非单纯被吸附固定。生物毒性的显著降低既凸显了OA3生产安全食品的潜力，也说明有必要阐明其脱毒机制。未来研究分离鉴定主要降解产物，并用肝细胞模型评价其安全性，将有助于更全面理解其系统毒性特征。
【数据】AFB1降解率（OA3接种终产品）：95.56 ± 1.32%；OTA降解率（OA3接种终产品）：90.38 ± 3.48%；AFB1降解率（自然发酵终产品）：68.93 ± 0.78%；OTA降解率（自然发酵终产品）：56.11 ± 3.48%；降解率统计：第16天显著高于第0、6、12天（p < 0.05）；组间比较：p < 0.001；Caco-2细胞活力：原料黑茶加标组75.16 ± 0.95%、OA3组90.67 ± 3.95%、自然发酵组83.6 ± 3.33%、无毒素对照93.72 ± 3.37%（p < 0.05）
3.2 曲霉OA3对茯茶呈色与"金花"形成的影响
茯茶品质可由两项主要感官指标判定，即干茶外观与茶汤色泽，其变化直接反映茶叶内在成分的生化转化程度（Xiao et al., 2024）。颜色转变表现为从橙黄到橙红、再到红褐的渐进过程（图2A）。为量化这些变化，本研究采用色差仪比较分析原料黑茶、自然发酵与曲霉OA3接种发酵组茶汤的色度（图2B与表S6）。两种发酵方式下，茶汤色度参数均一致表现为亮度（L值）下降、红绿色度（a值）上升。例如，与自然发酵终产品（L：59.63，a：9.27，b：54.05）相比，曲霉OA3接种发酵终产品L值显著更低（50.02），a（12.90）与b值（61.78）更高（单因素方差分析后Duncan多重比较；原始数据见补充表S6）。曲霉OA3接种发酵终产品更大的总色差（ΔE ab* = 18.27）表明接种发酵对色素形成的促进作用更强（Xiao et al., 2020）。观察到的色泽变化可能与茶多酚的氧化聚合有关（Xiao et al., 2020），而茶黄素、茶红素等单一茶色素的具体贡献尚需进一步研究。需要说明的是，第0天样品颜色较深并非源于发酵，而是发酵前高温灭菌处理及随后化学变化所致。同时，两种模式下冠突曲霉计数随发酵推进逐渐增加（图2C）。干茶感官变化同样明显：由于菌丝缠绕与微生物代谢，叶片由松散深褐转为紧结黄褐（图2A）。FFP中"金花"丰度显著高于NFP（1.4 × 10⁶ CFU/g vs. 1.1 × 10⁶ CFU/g；两两比较，原始数据见补充表S6），提示外源接种提供了更丰富的孢子来源，从而促进优势真菌生长。总体而言，曲霉OA3接种发酵除促进"金花"旺盛生长外，还能强化茶汤色泽转变，显示其品质提升潜力。
【数据】自然发酵终产品色度：L 59.63、a 9.27、b 54.05；OA3接种终产品色度：L 50.02、a 12.90、b 61.78；总色差：ΔE ab* = 18.27；"金花"数量：FFP 1.4 × 10⁶ CFU/g、NFP 1.1 × 10⁶ CFU/g；统计方法：单因素方差分析+Duncan多重比较
3.3 曲霉OA3对茯茶化学成分的影响
与原料黑茶相比，自然发酵与曲霉OA3接种发酵处理均导致总黄酮与总酚含量显著下降（单因素方差分析后Duncan多重比较，p < 0.05；图3A与B）。该下降可归因于发酵过程中微生物酶（如多酚氧化酶）作用下这些化合物的氧化降解与聚合，这被认为是茯茶特有色泽与醇和滋味形成的关键途径（Ling et al., 2024; Ma et al., 2021; Xiao et al., 2021）。同时，碳水化合物含量先降后升（单因素方差分析后Duncan多重比较，p < 0.05；图3C）。初期下降可能源于微生物将可溶性糖作为碳源消耗用于生长代谢（Li et al., 2017）；随后显著上升则可能与微生物胞外酶（如纤维素酶）降解茶叶中复杂多糖（如纤维素与半纤维素）释放新的还原糖有关（Ling et al., 2024）。此外，第6天黄酮与碳水化合物出现显著变化，凸显了曲霉OA3接种发酵与自然发酵的根本差异，其本质在于二者代谢途径及相应底物转化效率的不同。儿茶素占茯茶茶多酚的60%–80%，是决定终产品品质的关键组分（Li et al., 2021）。如图3D-I所示（单因素方差分析后Duncan多重比较，p < 0.05），本研究继续测定了原料黑茶、自然发酵与曲霉OA3接种发酵组中儿茶素（EGC、C、EC、EGCG、ECG）与GA的含量。我们观察到发酵过程中GA含量上升，且（原文此处截断）……
【数据】总黄酮与总酚：两种发酵方式下均显著下降（p < 0.05）；碳水化合物：先降后升（p < 0.05）；第6天：黄酮与碳水化合物变化显著；儿茶素占茶多酚比例：60%–80%；儿茶素测定种类：EGC、C、EC、EGCG、ECG；GA：发酵过程中上升；统计方法：单因素方差分析+Duncan多重比较（p < 0.05）
3.4 电子鼻响应与挥发性化合物分析
（本节内容对应图4，原文节选未提供该节文字，故不作转述。）
【数据】原文节选未详述
3.5 关键香气活性化合物与风味相关性分析
（本节内容对应图5，原文节选未提供该节文字，故不作转述。）
【数据】原文节选未详述
3.6 非挥发性代谢物统计分析
（本节内容对应图6，原文节选未提供该节文字，故不作转述。）
【数据】原文节选未详述
3.7 差异非挥发性代谢物分析
（本节内容对应图7，原文节选未提供该节文字，故不作转述。）
【数据】原文节选未详述
3.8 抗氧化活性变化及其与主要化学成分的相关性
（本节内容对应图8，原文节选未提供该节文字，故不作转述。）
【数据】原文节选未详述
讨论与解读
本研究最初旨在解决传统自然发酵茯茶的三项突出缺陷：霉菌毒素污染风险高、批次风味品质不稳定、健康有益功能成分积累不足。结合分段发酵检测与多指标定量测定，通过人工接种曲霉OA3菌株，全部预设研究目标均已实现。霉菌毒素降解方面：采用超高效液相色谱-串联质谱对各发酵阶段AFB1与OTA残留进行定量，16天后OA3接种使AFB1降解率达95.56 ± 1.32%、OTA降解率达90.38 ± 3.48%，大幅优于自然发酵（68.93 ± 0.78%与56.11 ± 3.48%）；细胞毒性试验进一步证实OA3发酵有效降低了霉菌毒素相关安全风险。风味轮廓重构方面：挥发性化合物经顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱分析，共鉴定93种挥发性化合物，其中40种气味活性值>0.1的关键香气物质在发酵阶段呈现三种动态积累模式：前期渐增、发酵中期峰值富集等（原文后续截断）。代谢组分析在全程鉴定出158种代谢物，发酵后期代谢网络更复杂；黄酮降解途径与黄酮及黄酮醇生物合成途径在OA3发酵样品中显著富集，相关分析证实黄酮水平变化与抗氧化能力提升密切关联。
编译者解读：该研究以单菌株定向接种同时解决安全与品质两类问题，思路清晰：用降解率与Caco-2细胞活力双指标锁定"真脱毒"而非吸附，方法学上较扎实。局限在于降解产物结构未鉴定、机制未阐明，且代谢组与电子鼻结论多基于相关分析，因果链偏弱。对合成生物学而言，OA3的脱毒酶系是下一步异源表达与底盘改造的合适靶点。
参考来源
期刊：Food Chemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.151185
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.151185