来源：Tea-derived Bacillus licheniformis and Aspergillus neoniger modulate microbial community and flavor quality of cigar tobacco leaves during fermentation（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
雪茄烟叶的品质形成依赖发酵过程中微生物介导的大分子降解与风味物质合成。本研究从雅安黑茶中分离获得地衣芽孢杆菌T1-S1与黑曲霉T3-S3两株菌，将其作为发酵接种剂回接至雪茄烟叶，系统比较了二者对常规化学成分、香气物质、微生物群落及感官品质的影响。黑曲霉T3-S3使总香气含量提升17%、新植二烯提升21.4%，并改善烟气细腻度与甜感；地衣芽孢杆菌T1-S1则维持可溶性糖稳定、提升部分醇类物质。研究为茶源微生物定向调控雪茄烟叶发酵提供了实用策略。
研究背景
雪茄烟叶（CTLs）发酵是直接影响产品感官品质、安全性与商业价值的核心生物过程。发酵期间，烟叶内部发生复杂生化反应，包括蛋白质、淀粉、纤维素等不良大分子的降解，这些过程转化化学成分并促进特征香气物质形成，从而降低烟气刺激性、提升醇和度与洁净度、减少杂气。化学反应用与微生物代谢共同驱动上述变化，其中微生物群落是调控发酵进程的关键——其组成、结构与功能活性决定发酵进度与烟叶品质。
然而，新鲜烟叶中的土著微生物普遍存在活性低、群落结构失衡、代谢速率慢、功能多样性有限等缺陷，导致发酵周期长、产品质量不稳定、香气形成不足、刺激性偏高，难以满足现代雪茄生产的高品质要求。因此，通过外源接种调控微生物群落、定向强化发酵功能，成为提升雪茄烟叶品质的重要途径。本研究即以茶源微生物为切入点，评估其在雪茄烟叶发酵中的调控效果与机制。
研究方法
2.1 烟叶原料与微生物菌株
本研究所用雪茄烟叶（CTLs）原料品种为德雪4号，由中国烟草四川工业有限责任公司（中国四川）提供。两株微生物——地衣芽孢杆菌T1-S1（Bacillus licheniformis T1-S1）与黑曲霉T3-S3（Aspergillus neoniger T3-S3）——分离自雅安黑茶。地衣芽孢杆菌T1-S1的原始测序数据已提交至NCBI，登录号为PZ301867。分离获得的黑曲霉T3-S3保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC，中国北京），保藏号为CGMCC 42429。
【数据】烟叶品种：德雪4号；菌株：地衣芽孢杆菌T1-S1、黑曲霉T3-S3；分离来源：雅安黑茶；NCBI登录号：PZ301867；CGMCC保藏号：CGMCC 42429
2.2 发酵实验
每个发酵重复使用约300 g雪茄烟叶。将烟叶平铺，把由富集培养获得的微生物菌悬液均匀喷洒于烟叶表面。处理T1接种细菌菌悬液地衣芽孢杆菌T1-S1，处理T2接种真菌菌悬液黑曲霉T3-S3。按实际烟叶质量的15%补水率额外施加去离子水。未接种对照（T0）以等体积去离子水替代菌悬液，并执行相同的补水程序，以确保微生物处理是组间唯一变量。发酵在35°C、75%相对湿度条件下进行35天。分别于第0、7、14、21、28和35天取样。所有样品随后在45°C下干燥至恒重，粉碎，过0.25 mm（60目）筛网，再进行后续分析。所有发酵实验每个处理组均设三个独立生物学重复。
【数据】每重复烟叶量：约300 g；补水率：15%（按实际烟叶质量）；温度：35°C；相对湿度：75%；发酵时长：35天；取样时间：第0、7、14、21、28、35天；干燥温度：45°C；筛网孔径：0.25 mm（60目）；生物学重复：3个
2.3 化学成分分析
常规化学成分参照中国标准测定。总糖、还原糖、总氮、钾、氯均采用连续流动法，分别依据标准YC/T 159–2019、YC/T 160–2002、YC/T 161–2002、YC/T 217–2007和YC/T 162–2011测定。总游离氨基酸采用氨基酸分析仪依据YC/T 282–2009测定。
香气成分采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。具体操作：称取2 g烟叶粉末置于50 mL离心管中，依次加入10 mL去离子水、10 mL乙腈和50 μL乙酸苯乙酯内标溶液。振荡120 min后，加入QuEChERS萃取试剂，再振荡2 min。随后取1 mL上清液转移至2 mL离心管中，加入150 mg无水MgSO4。振荡2 min后，离心并过滤，收集滤液用于GC-MS分析。
GC-MS操作条件参照前期工作（Hu et al., 2025）。即：所得上清液在DB-5MS毛细管柱（60 m×0.25 mm×1.0 μm）上进行GC-MS分析。质谱仪以电子轰击（EI）模式运行，电离能量70 eV，离子源温度设为230°C。氦气作为载气，恒定流速1.2 mL/min。升温程序为：60°C初始保持，以2 °C/min升至250°C，再以5 °C/min升至290°C，最终保持20 min。所有化学成分含量均按标准规程以干重基础计算。
【数据】烟叶粉末：2 g；去离子水：10 mL；乙腈：10 mL；内标：50 μL乙酸苯乙酯溶液；振荡时间：120 min（萃取）+ 2 min（QuEChERS）+ 2 min（MgSO4）；上清液：1 mL；无水MgSO4：150 mg；色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×1.0 μm）；电离模式：EI，70 eV；离子源温度：230°C；载气：氦气，1.2 mL/min；升温程序：60°C→250°C（2 °C/min）→290°C（5 °C/min），终保持20 min
2.4 微生物群落多样性与结构
总微生物基因组DNA采用ALFA-SEQ DNA文库制备试剂盒（广州艾基生物技术有限公司，中国）按制造商说明提取。以提取的基因组DNA为模板，使用带条形码的特异性引物和Premix Taq，按所选测序区域进行PCR扩增。真菌扩增ITS2区域，正向引物ITS3-F（GCATCGATGAAGAACGCAGC），反向引物ITS4-R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。细菌扩增V3-V4区域，正向引物338 F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA），反向引物806 R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。所得扩增子文库在Illumina平台上以PE250（双端250 bp）测序。
原始双端reads使用fastp（版本0.14.1）进行滑动窗口质量修剪（-W 4 -M 20），并用cutadapt去除引物，获得质控后的双端clean reads。对于双端测序数据，使用usearch -fastq_mergepairs（V10）合并reads并过滤不合格tags，得到原始合并序列（Raw Tags）。Raw Tags再使用fastp（版本0.14.1）以滑动窗口质量修剪（-W 4 -M 20）进一步修剪，获得有效合并片段（Clean Tags）。操作分类单元（OTUs）采用UPARSE方法聚类。各OTU的代表序列与SILVA（V138）和Unite（V10.0）等数据库比对进行物种注释，默认置信度阈值为0.8，以确定所有序列的分类学来源。采用线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）方法鉴定处理组间差异丰度微生物类群。LEfSe在Magigene云平台（https://cloud.magigene.com/）上以默认参数运行。LDA评分大于3且P < 0.05的特征被视为统计学显著的生物标志物。
【数据】DNA提取试剂盒：ALFA-SEQ DNA Library Prep Kit；真菌引物：ITS3-F/ITS4-R（ITS2区）；细菌引物：338 F/806 R（V3-V4区）；测序平台：Illumina PE250；质控软件：fastp v0.14.1（-W 4 -M 20）、cutadapt；合并软件：usearch V10；聚类方法：UPARSE；注释数据库：SILVA V138、Unite V10.0；置信度阈值：0.8；LEfSe阈值：LDA > 3，P < 0.05
2.5 感官评价
感官品质参照前期描述的标准方法（Hu et al., 2025）并稍作修改进行评价。感官评定中，每个处理组卷制成雪茄烟支，长度90 mm，周长47 mm。评价前，制备好的雪茄在养护柜（Bulldog VC528，中国）中于20°C、60%相对湿度条件下平衡10天。招募五名经验丰富的雪茄品质评价员组成评价小组。为确保评分一致性，所有评价员在正式评定前使用参考雪茄样品参加校准会议。评价遵循当地循环抽吸规程，评分聚焦于每支雪茄燃烧长度三分之一至三分之二之间的区段。所有评定均在安静、通风良好、无异味且无外界干扰的环境中进行。为保持盲法，样品按随机顺序呈递。提供水和绿茶用于口腔清洁，评价员在连续样品之间至少休息5 min。采用9分制评分量表（以0.5分为增量）评价九项感官属性：香气强度、丰富度、成熟度、刺激性、柔和度、细腻度、甜感、洁净度和余味。详细评分标准见附表S1。
【数据】烟支规格：长度90 mm、周长47 mm；平衡条件：20°C、60%相对湿度、10天；养护柜：Bulldog VC528；评价员：5名；评分量表：9分制（0.5分增量）；感官属性：9项；样品间休息：≥5 min
2.6 统计分析
所有实验均设三个重复。表中数据以平均值±标准差（SD）表示，图中误差棒代表SD。统计分析使用IBM SPSS Statistics进行。参数分析前，采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性，采用Levene检验验证方差齐性。随后进行单因素方差分析（ANOVA）评估处理组间总体差异。当检测到显著总体效应（P < 0.05）时，采用Tukey诚实显著差异（HSD）事后检验进行组均值间的两两多重比较。Tukey HSD检验在进行所有可能的两两比较时控制族系误差率。所有统计检验采用α = 0.05的显著性水平。采用Pearson相关系数检验雪茄烟叶中优势微生物与常规化学成分及香气化合物之间的关联。相关性显著性水平表示为*（0.01 ≤ P < 0.05）。
【数据】重复数：3；数据表示：平均值±SD；正态性检验：Shapiro-Wilk；方差齐性检验：Levene；总体差异检验：单因素ANOVA；事后检验：Tukey HSD；显著性水平：α = 0.05；相关性方法：Pearson；显著性标记：*（0.01 ≤ P < 0.05）
研究结果
3.1 常规化学成分
可溶性糖贡献甜感与醇和度，并作为香气形成的前体。地衣芽孢杆菌可分泌胞外酶，包括淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶（Medison et al., 2023）。这些酶能有效降解烟叶中的淀粉、纤维素和蛋白质，释放可发酵糖。本研究中，T1组的总糖和还原糖含量在第7天达到峰值后下降，但在发酵期间仍保持相对较高水平（图1a、b）。相比之下，T2组的可溶性糖含量虽然总体高于T0组，但在多数时间点低于T1组（P < 0.05）。可溶性糖可通过美拉德反应、焦糖化以及后续热加工和抽吸过程中的热解等反应参与香气形成。这种快速转化可带来香气充沛、风味复杂度丰富的抽吸体验。然而，需要仔细控制发酵终点，以防止后期糖分过度消耗及随之而来的甜感损失。
总氮含量反映烟叶中含氮大分子（如蛋白质和多肽）的降解效率。降解不充分的烟叶燃烧时会产生氨和甲胺等碱性杂质，加剧烟气刺激性。通常期望发酵通过微生物降解减少杂质并必然降低总氮。本结果显示，发酵组间总氮存在显著差异（P < 0.05）。然而，外源添加黑曲霉T3-S3导致总氮显著升高（图1c）。
部分游离氨基酸直接贡献甜醇口感（如谷氨酸、丙氨酸）（Sun et al., 2024）。它们也是美拉德反应和Strecker降解的底物，生成苯乙醇（花香）和3-甲基吡嗪（坚果香）等特征香气物质。发酵时间显著影响T1组的总游离氨基酸含量（P < 0.05），但对T0或T2组无显著影响（P > 0.05）。T1组中，该含量先升高、后降低、最终趋于稳定。第7天最大值為2.94%，较初始值提高27.1%。组间比较，添加地衣芽孢杆菌T1-S1组的总游离氨基酸含量显著高于其他两组，主要在第7天（P < 0.05）。其余时间点组间无显著差异。
【数据】总糖/还原糖峰值时间：第7天；T1总游离氨基酸最大值：2.94%（第7天）；较初始值增幅：27.1%；总氮组间差异：P < 0.05；T1游离氨基酸时间效应：P < 0.05；T0/T2游离氨基酸时间效应：P > 0.05
生物碱（主要为烟碱）贡献雪茄的劲头感受。含量过高会导致苦味、涩感和喉部刺激增加，含量过低则满足感不足。发酵的关键目标之一是通过微生物降解使烟碱含量进入适宜范围。如图2所示，生物碱含量随时间显著变化（P < 0.05）。T0组中，生物碱在第一周升高，第二周急剧下降，随后趋于稳定。T1组中，生物碱含量快速下降，至第35天与T0组相当。T2组中，生物碱在发酵前期下降，第14天后达到平台。发酵结束时，各处理间生物碱含量无显著差异（P > 0.05），较初始值降低34%–36%。这些结果表明，发酵可有效降低烟气刺激性并增强雪茄烟叶的整体柔和度。
钾氯比（K/Cl）是烟叶燃烧性能的指标，因为钾促进燃烧而氯抑制燃烧。如图3所示，发酵期间钾含量波动，而氯含量显著下降（P < 0.05）。发酵结束后，三组的K/Cl比均显著高于初始值2.32（表S2），且组间差异显著（P < 0.05）。空白组达到4.47，较初始值提高约93%。接种黑曲霉T3-S3相对于空白并未进一步提高K/Cl比。相比之下，地衣芽孢杆菌T1-S1处理的最终K/Cl比为5.37。
【数据】生物碱降幅：34%–36%（发酵结束 vs 初始）；初始K/Cl比：2.32；空白组最终K/Cl比：4.47（较初始提高约93%）；T1最终K/Cl比：5.37；氯含量变化：显著下降（P < 0.05）；K/Cl组间差异：P < 0.05
3.2 烟叶中的香气化合物
香气化合物含量是雪茄烟叶品质的重要化学指标。除烟碱及其衍生物外，共鉴定出57种化合物（图4），其中45种在处理间存在显著差异（P < 0.05）。黑曲霉T3-S3使总香气化合物含量较T0显著提高17%（P < 0.05），而地衣芽孢杆菌T1-S1未产生可比增幅。新植二烯作为叶绿素降解产物，通常与烟草香气发育相关（Si et al., 2023）。在烟叶调制和发酵过程中，新植二烯参与多种生化反应。它直接贡献雪茄感官品质，也可通过代谢途径转化为其他风味物质。这种转化进一步塑造整体香气轮廓、柔和烟气并降低刺激性（Ning et al., 2023）。T1组中新植二烯最终含量约为T0组的一半。相比之下，T2组新植二烯含量较T0提高21.4%。该模式与叶绿素来源代谢的改变一致，但本研究未直接测定叶绿素降解。
除新植二烯外，其余香气化合物分为七类，包括酮类、酚类、酯类、醛类、酸类、醇类和含氮杂环化合物（图5）。醇类是最丰富的类别，占除新植二烯外总量的36%以上。酮类和含氮杂环化合物各占至少20%。酮类、酯类、酸类和醇类含量在处理间存在显著差异（P < 0.05）。与T0相比，T2显著促进酮类、酸类和醇类的积累。特别是，黑曲霉T3-S3处理相对于对照显著提高了植醇和2,4,6-三甲基苯丙醇的水平。植醇与青草香、花香和油脂香韵相关（Guo et al., 2024）。T1相对于T0显著提高苯乙醇和雪松醇含量，但降低植醇含量。酮类是烟草中重要的香气成分，主要由非酶促褐变反应产生。黑曲霉T3-S3处理后，茄酮和3-乙基-3,4-二氢-2(1H)-喹喔啉酮含量显著提高。茄酮具有类似新鲜胡萝卜的香气（Huang et al., 2026），可增强烟草香气和香气丰富度。这些变化表明，两株菌对香气轮廓的影响不同，黑曲霉T3-S3在所测条件下显示出更大的提升多种香气相关化合物的潜力。
【数据】鉴定香气化合物：57种；处理间显著差异：45种（P < 0.05）；T2总香气增幅：17%（vs T0，P < 0.05）；T1新植二烯：约为T0的50%；T2新植二烯增幅：21.4%（vs T0）；醇类占比：>36%（除新植二烯外）；酮类/含氮杂环占比：各≥20%；酮/酯/酸/醇组间差异：P < 0.05
3.3 微生物群落分析
对三组真菌和细菌群落的全面分析对于理解外源微生物如何影响雪茄烟叶至关重要。每个样品的测序覆盖度至少为99.9%（表S3），表明所检测群落的采样充分。T2组真菌Shannon指数在第35天大幅下降，显著低于T0组，为三组中最低值。这些结果表明，接种黑曲霉T3-S3显著降低了发酵期间的真菌多样性。Simpson指数呈现相应变化，T2组第35天Simpson值升高，反映真菌均匀度下降。在细菌群落方面……
【数据】测序覆盖度：≥99.9%；T2真菌Shannon指数：第35天显著低于T0（三组最低）；T2第35天Simpson值：升高；原文节选至细菌群落处中断，其余原文未详述
3.4 感官品质与相关性分析
（注：原文结果节选在细菌群落部分中断，感官评价与相关性分析的具体结果数据未在节选范围内完整呈现，以下仅依据图表清单与摘要信息标注图位。）
【数据】感官评价方法参数见2.5节；相关性分析涉及指标：总可溶性糖、还原糖、总氮、氨基酸、生物碱、K⁺、Cl⁻、K/Cl、酮类、酚类、酯类、醛类、酸类、醇类、含氮杂环化合物等；具体相关系数原文节选未详述
讨论与解读
本研究系统考察了两株茶源微生物——地衣芽孢杆菌T1-S1与黑曲霉T3-S3——对雪茄烟叶发酵的调控效应与机制。两株接种剂施加了菌株特异性的选择压力并重塑群落组装，产生不同的α多样性轨迹：黑曲霉T3-S3显著降低真菌多样性，地衣芽孢杆菌T1-S1主要降低细菌丰富度而未明显扰动细菌多样性。二者对化学成分的影响亦不相同。地衣芽孢杆菌T1-S1维持可溶性糖稳定、提高部分醇类香气物质但降低新植二烯；黑曲霉T3-S3提高酮类、酸类和醇类含量，并使新植二烯和总香气化合物含量较T0分别提高21.4%和17%。相应地，黑曲霉T3-S3带来更优的感官表现，减轻烟气刺激性，同时提升细腻度、甜感和余味。相关性分析进一步表明，核心微生物属与香气相关化合物存在不同的关联关系；生物碱、酸类、酯类、植醇、3-乙基-3,4-二氢-2(1H)-喹喔啉酮和2,4,6-三甲基苯丙醇等多种代谢物与发酵烟叶的感官表现显著相关。
编译者解读：该研究把"茶源菌株"作为可定向接种的功能模块，思路接近合成生物学中的底盘菌改造—外源功能注入逻辑，但所用菌株为天然分离物，未做遗传改造，工程化程度有限。其价值在于用群落测序+风味组学+感官评价的三层数据把菌株功能与产品品质挂钩，为雪茄发酵的"菌株—代谢物—感官"链条提供了可复现的评估框架。局限也明显：叶绿素降解未直接测定，细菌群落结果在节选中不完整，且两株菌的代谢通路机制仍停留在相关性层面，距离理性设计菌群组合尚有距离。
参考来源
期刊：Industrial Crops and Products, 2026
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124559
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124559