来源：Sequential deglycosylation of balloon flower root platycosides by a commercial Aspergillus niger-derived polygalacturonase preparation（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
桔梗皂苷是桔梗根部的主要皂苷类成分，其脱糖基化可显著改变结构与功能。然而，跨三大桔梗皂苷类别的广泛酶法脱糖基化尚缺乏系统表征。本研究筛选了多种商用食品加工酶制剂，发现Rapidase PL Classic（一种商用黑曲霉来源多聚半乳糖醛酸酶制剂）能水解桔梗皂苷元型、多聚半乳糖酸型和桔梗酸型皂苷C-3与C-28位的糖基残基，生成相应苷元。通过时间进程HPLC和LC-MS/MS分析，构建了逐步脱糖基化路径，制备了13种此前无法获得的参考化合物。单糖基化中间体和苷元的产品摩尔产率分别约为90%和100%。脱糖基化程度增加伴随脂氧合酶抑制活性从37%升至63%、DPPH自由基清除活性从9%升至72%。
研究背景
桔梗（Platycodon grandiflorum）的食用根——桔梗根（Platycodi radix）长期作为东亚地区的食品和草药成分使用，其生物活性包括抗过敏、抗炎、抗肥胖、抗氧化、抗肿瘤、心脏保护、肝脏保护和免疫刺激等，这些活性主要归因于桔梗皂苷——一类齐墩果烷型三萜皂苷。目前已有70余种桔梗皂苷被鉴定，根据苷元结构分为桔梗皂苷元（PDN）型、多聚半乳糖酸（PGA）型和桔梗酸（PCA）型三类。理解桔梗皂苷生物活性的结构决定因素，对开发高附加值功能性食品配料和营养品具有重要意义。酶法修饰天然成分可在相对温和的条件下生成结构多样的桔梗皂苷。本研究以条目系列a−n、b′−n′和c″−n″分别表示这三个类别，每个条目后的数字表示剩余糖基残基总数。
研究方法
2.1 材料
六种商用食品加工酶制剂（Rapidase PL Classic、Rapidase PL Smart、Rapidase Fiber、Pectinex Ultra Color、Pectinex XXL和Pectinex Ultra SP-L）购自Novozymes（丹麦Bagsvaerd）。Rapidase PL Classic（批号101924；制造商声明活性为100,000内切果胶酶单位/g）储存于4–8 °C，避免阳光直射和冷冻。使用前，将商用多聚半乳糖醛酸酶制剂用50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）稀释至所需浓度（≤2 mg/mL）。商用桔梗皂苷标准品（HPLC纯度≥98%）包括桔梗皂苷E（PE，a，糖基残基数=7）、桔梗皂苷D3（PD3，b，6）、桔梗皂苷D（PD，c，5）、脱芹菜糖基PE（deapi-PE，e，6）、脱芹菜糖基PD3（deapi-PD3，f，5）、脱芹菜糖基PD（g，4）、PDN（n，0）、多聚半乳糖苷D（PGD，c′，5）、PGA（n′，0）和桔梗酸A（PCAA，c″，5）（Chemfaces，中国武汉），以及PGD3（b′，6）（Ambo Laboratory，韩国大田）。其他非商购桔梗皂苷参考化合物通过酶法制备并纯化，方法如先前所述或本研究所述，详见表S1（Ju et al., 2020; Kang et al., 2019; Oh et al., 2022; Shin et al., 2020, 2021a）。
【数据】酶制剂来源：Novozymes（丹麦Bagsvaerd）；Rapidase PL Classic批号：101924；声明活性：100,000内切果胶酶单位/g；储存温度：4–8 °C；稀释缓冲液：50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）；稀释浓度：≤2 mg/mL；标准品纯度：≥98% HPLC
2.2 桔梗皂苷参考化合物的制备
非商购桔梗皂苷参考化合物通过酶法生物转化获得并纯化，汇总于表S1。本研究中制备的化合物以PE（a，7）、PGD3（b′，6）和PCAA（c″，5）为底物，使用Rapidase PL Classic生成。各产物通过制备型HPLC分离，使用Agilent 1260系统（Agilent Technologies，美国加州Santa Clara），配备Hydrosphere C18柱（10 × 250 mm，5 μm；YMC，日本京都）、203 nm紫外检测和馏分收集器。色谱柱在30 °C、4.7 mL/min条件下洗脱，乙腈/水梯度如下：10:90–40:60洗脱30 min，40:60–90:10洗脱15 min，90:10–10:90洗脱5 min，随后以10:90洗脱10 min。收集含各桔梗皂苷的馏分并纯化。通过峰面积归一化法测定分离参考化合物的HPLC纯度≥91%。
【数据】制备型HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Hydrosphere C18（10 × 250 mm，5 μm）；检测波长：203 nm；柱温：30 °C；流速：4.7 mL/min；乙腈/水梯度：10:90–40:60（30 min），40:60–90:10（15 min），90:10–10:90（5 min），10:90（10 min）；纯度：≥91%
2.3 商用食品加工酶制剂的筛选
酶筛选旨在鉴定在筛选条件下能水解PE（a，7）糖基残基并生成相应苷元PDN（n，0）的商用酶制剂。在筛选商用果胶酶制剂之前，使用PE和deapi-PE（e，6）作为模型底物，评估了27种商用糖苷酶制剂的桔梗皂苷脱糖基化能力。大多数显示很少或无可检测活性，而几种活性糖苷酶主要将PE转化为PD（c，5），无进一步脱糖基化。随后选择六种具有不同酶组成的商用食品加工果胶酶制剂进行进一步筛选。反应在50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）中进行，含0.4 mg/mL PE和2.0 mg/mL酶制剂，50 °C孵育0.5、6或12 h。反应产物通过HPLC分析，选择能产生PDN的酶制剂进行进一步表征。选择PE作为模型底物是因为其含有分布在C-3和C-28位之间的七个糖基残基。
【数据】初筛酶制剂数量：27种商用糖苷酶；模型底物：PE（0.4 mg/mL）和deapi-PE；缓冲液：50 mM柠檬酸/磷酸（pH 5.5）；酶浓度：2.0 mg/mL；温度：50 °C；时间：0.5、6、12 h；主要产物：PD（c，5）
2.4 酶活力测定、pH和热稳定性及动力学分析
桔梗皂苷水解活性在50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液中测定，含0.4 mg/mL PE（a，7）和0.5 mg/mL Rapidase PL Classic，50 °C反应10 min。最适pH在pH 4.0–7.0范围内、55 °C条件下测定；最适温度在40–65 °C范围内、pH 5.5条件下测定。Rapidase PL Classic的pH和热稳定性通过延长孵育12或16 h后评估。热稳定性方面，酶制剂在50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）中于40、45、50、55、60或65 °C孵育。pH稳定性方面，酶制剂在50 °C下于50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0）中孵育。孵育12或16 h后，以PE为底物在标准测定条件（pH 5.5和50 °C）下测定残余桔梗皂苷水解活性。残余活性以孵育前酶制剂活性为100%表示。对各桔梗皂苷的比活性通过底物浓度降低测定，反应体系为50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5），含0.4 mg/mL桔梗皂苷和0.5–2.0 mg/mL Rapidase PL Classic，50 °C反应10–60 min。酶浓度根据对各底物的活性选择：高活性底物使用较短反应时间和/或较低酶浓度，低活性底物使用较长反应时间和/或较高酶浓度。在计算比活性前，验证了所选条件下底物消失与反应时间的线性关系。残余底物浓度通过HPLC定量，使用相应化合物的校准方程。水解底物量计算为初始与残余底物浓度之差。一单位桔梗皂苷水解活性定义为每分钟催化1 nmol底物的商用酶制剂量，比活性表示为nmol/min/mg商用酶制剂。表观动力学分析中，初始反应速率在1至150 mM底物浓度范围内测定（取决于底物）。反应在50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）中、50 °C进行5 min，底物消失通过HPLC定量。表观米氏常数（Km）、转换数（kcat）和催化效率（kcat/Km）通过将初始反应速率非线性回归拟合至Michaelis–Menten方程估算，使用GraphPad Prism 10（GraphPad Software，美国加州San Diego）。
【数据】标准测定条件：0.4 mg/mL PE，0.5 mg/mL酶，50 °C，10 min，pH 5.5；最适pH范围：4.0–7.0（55 °C）；最适温度范围：40–65 °C（pH 5.5）；稳定性孵育时间：12或16 h；热稳定性温度：40、45、50、55、60、65 °C；pH稳定性范围：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；比活性测定：0.4 mg/mL底物，0.5–2.0 mg/mL酶，50 °C，10–60 min；动力学底物浓度：1–150 mM；动力学反应：50 °C，5 min；活性单位定义：1 nmol/min；软件：GraphPad Prism 10
2.5 桔梗皂苷的时间进程生物转化
生物转化反应在50 °C、50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）中进行，该条件基于实验测定的Rapidase PL Classic催化特性选择。由于对单糖基化桔梗皂苷的比活性显著低于对更高糖基化底物的比活性，对单糖基化底物使用更高酶浓度以促进反应期内广泛转化。脱芹菜糖基-脱木糖基-PD（i，3）、脱芹菜糖基-脱木糖基-PGD（i′，3）和脱芹菜糖基-脱木糖基-PCAA（i″，3）各1.0 mg/mL与1.0 mg/mL Rapidase PL Classic分别孵育12、14或16 h。Glc-PDN（m，1）、glc-PGA（m′，1）和glc-PCA（m″，1）各1.0 mg/mL与5.0 mg/mL Rapidase PL Classic分别孵育12、14或14 h。定时取样并通过HPLC分析，测定底物消耗及中间体和苷元的时间依赖性形成。无酶对照反应含相应桔梗皂苷底物但不含Rapidase PL Classic，在与对应酶反应相同的pH、温度和孵育时间条件下进行。时间进程数据采用描述性分析；未进行跨化合物和时间点的多重两两比较。
【数据】反应条件：50 °C，50 mM柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 5.5）；i系列底物：1.0 mg/mL，酶1.0 mg/mL，12/14/16 h；m系列底物：1.0 mg/mL，酶5.0 mg/mL，12/14/14 h；对照：无酶，相同pH/温度/时间
2.6 HPLC分析和定量测定
酶反应通过加入等体积正丁醇终止。有机相蒸发后溶于甲醇，使用Agilent 1260 HPLC系统配备Hydrosphere C18柱（4.6 × 150 mm，5 μm；YMC，日本京都）分析。桔梗皂苷使用乙腈/水梯度分离……
【数据】终止方法：等体积正丁醇；HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Hydrosphere C18（4.6 × 150 mm，5 μm）；检测：UV；流动相：乙腈/水梯度
研究结果
3.1 商用食品加工酶制剂用于桔梗皂苷逐步脱糖基化的选择
先前报道的酶将PDN型、PGA型和PCA型糖基化桔梗皂苷转化为部分脱糖基化产物。为鉴定能实现更广泛脱糖基化的商用酶制剂，首先使用PE（a，7）和deapi-PE（e，6）作为模型底物筛选了27种含糖苷酶活性的商用酶制剂（表S3）。大多数制剂无可检测活性，或仅将PE和deapi-PE转化为部分脱糖基化产物，主要为PD（c，5）和deapi-PD（g，4）。尽管Fructozyme表现出较广泛活性并生成包括PDN（n，0）在内的多种脱糖基化产物，但其产物为复杂混合物，因此未选用于后续使用。进一步评估了六种商用食品加工果胶酶制剂。Rapidase PL Smart（一种果胶裂解酶）未产生可检测产物，Rapidase Fiber（一种果胶酶混合物）产生脱芹菜糖基-脱木糖基-PD（i，3），而Pectinex Ultra Color、Pectinex XXL和Pectinex Ultra SP-L（均为多聚半乳糖醛酸酶制剂）主要产生glc-PDN（m，1）作为最终产物（图S1和表S4）。在本研究筛选条件下测试的商用酶制剂中，Rapidase PL Classic是唯一通过可检测中间体形成产生苷元PDN的制剂，中间体通过与参考化合物比较进行暂定归属（图2、图S2和S3）。在这些筛选条件下，Rapidase PL Classic表现出最广泛的桔梗皂苷脱糖基化活性，因此被选用于进一步表征逐步脱糖基化。
筛选使用统一反应条件而未对各酶制剂进行单独优化，因此这些结果代表所测条件下的相对活性，不排除其他制剂在其各自最适条件下的不同产物谱。此外，初始比较筛选使用PE作为代表性底物。因此，这些结果证明了Rapidase PL Classic对PE的相对有效性，但未确立其对PGA型或PCA型桔梗皂苷优于其他制剂。本研究中，逐步脱糖基化指糖基残基的逐步去除，由时间依赖性前体-产物关系和可检测中间体的形成及随后的消耗所证实。低于分析检测能力的痕量残余中间体或次要产物不能排除。Rapidase PL Classic是商用多聚半乳糖醛酸酶制剂而非分离纯化的酶，本研究未表征其各蛋白组分。因此，不同C-3和C-28糖基残基的水解不能具体归因于单一多聚半乳糖醛酸酶，制剂中可能存在的其他糖苷水解或果胶分解活性的贡献不能排除。因此，下文报道的催化特性应解释为Rapidase PL Classic制剂整体的特性。需要对该负责酶组分进行鉴定和生化表征，以确定其广泛水解活性是来自单一多功能酶还是多个酶组分。
【数据】初筛酶制剂：27种；模型底物：PE（a，7）和deapi-PE（e，6）；主要产物：PD（c，5）和deapi-PD（g，4）；六种果胶酶制剂：Rapidase PL Smart（无产物）、Rapidase Fiber（i，3）、Pectinex Ultra Color/XXL/Ultra SP-L（m，1）；Rapidase PL Classic：产生PDN（n，0）；反应条件：50 mM柠檬酸/磷酸（pH 5.5），0.4 mg/mL PE，2.0 mg/mL酶，50 °C，0.5/6/12 h
3.2 PDN型、PGA型和PCA型桔梗皂苷的逐步脱糖基化路径
选择PE（a，7）、PGD3（b′，6）和PCAA（c″，5）分别作为PDN型、PGA型和PCA型桔梗皂苷类的代表性底物。时间进程HPLC分析显示这些底物通过一系列可检测中间体逐步转化为其苷元PDN（n，0）、PGA（n′，0）和PCA（n″，0）（图S4–S6）。基于这些时间依赖性前体-产物关系和支持性LC-MS/MS数据，提出了三类桔梗皂苷的逐步脱糖基化路径（图3）。为清晰起见，A1–A3和B–E用作各糖苷水解步骤的操作性命名，而非预定反应顺序或内在区域选择性的指标。A1、A2和A3分别表示C-3位外层、中间和内层葡萄糖基残基的去除，B–E分别表示C-28位芹菜糖基、木糖基、鼠李糖基和阿拉伯糖基残基的去除。路径中间体的归属由其已知前体结构、时间依赖性前体-产物关系、与可用参考化合物的色谱比较以及LC-MS/MS碎裂模式支持。前体到产物的质量差异与162、146和132 Da的连续中性丢失一致，分别对应己糖基、脱氧己糖基和戊糖基残基。这些数据支持所提出的糖苷水解步骤，但不能独立确定所有糖苷身份、糖苷键位置、异头构型或立体化学。详细LC-MS/MS谱图和碎裂数据见补充说明及补充信息表S5和S6。
三类桔梗皂苷的A1和A2生物转化以及PDN型和PGA型桔梗皂苷的B和C生物转化已有先前报道（Ahn et al., 2018; Kil et al., 2019; Shin et al., 2020, 2021a）。相比之下，涉及最内层C-3葡萄糖基残基去除（A3反应）和末端C-28鼠李糖基和阿拉伯糖基残基去除（分别为D和E）的路径归属在这些先前酶促路径中未描述。这些生物转化由前体桔梗皂苷的已知糖基化模式及其观察到的前体-产物关系归属，LC-MS/MS为相应中性丢失提供支持证据。因此，A3、D和E应视为所提出的水解步骤，而非确定的键特异性机制归属。Rapidase PL Classic在所测条件下表现出对应所提路径中所有A1–A3和B–E生物转化的水解活性。
先前基于肠道微生物代谢提出了PDN型逐步路径（Xu et al., 2024）。本研究中，时间进程HPLC分析、与可用参考化合物的色谱比较、LC-MS/MS数据以及选定纯化中间体的反应，为跨越PDN型、PGA型和PCA型桔梗皂苷的前体-产物关系提供了实验证据。这些发现扩展了桔梗皂苷脱糖基化的实验表征范围，同时避免了将观察到的生物转化视为单一强制反应序列的假设。将Rapidase PL Classic的水解范围与先前报道的桔梗皂苷脱糖基化酶进行了比较（表S5）。Dictyoglomus turgidum β-葡萄糖苷酶水解C-3葡萄糖基残基但不去除C-28寡糖（Kang et al., 2019），而Aspergillus aculeatus多聚半乳糖醛酸酶去除C-28糖基残基和外层两个C-3葡萄糖基残基，但水解最内层C-3葡萄糖基残基效率低（Ju et al., 2020）。相比之下，Rapidase PL Classic在所测条件下对C-3和C-28位糖基残基均表现出水解活性，并将代表性PDN型、PGA型和PCA型桔梗皂苷转化为相应苷元。然而，其比活性在最终脱糖基化步骤中显著下降，特别是对单糖基化中间体，需要更高酶载量才能形成苷元。因此，Rapidase PL Classic提供了更广泛的……
【数据】代表性底物：PE（a，7）、PGD3（b′，6）、PCAA（c″，5）；苷元产物：PDN（n，0）、PGA（n′，0）、PCA（n″，0）；中性丢失质量：162 Da（己糖基）、146 Da（脱氧己糖基）、132 Da（戊糖基）；路径步骤：A1–A3（C-3葡萄糖基）、B–E（C-28芹菜糖基、木糖基、鼠李糖基、阿拉伯糖基）；反应条件：50 °C，pH 5.5
3.3 时间进程生物转化及产物产率
对三糖基化桔梗皂苷（i系列）向其相应苷元（n系列）的时间进程生物转化进行了监测。脱芹菜糖基-脱木糖基-PD（i，3）通过单糖基化中间体转化为PDN（n，0）（图6A）。脱芹菜糖基-脱木糖基-PGD（i′，3）转化为PGA（图6B）。脱芹菜糖基-脱木糖基-PCAA（i″，3）转化为PCA。选定的单糖基化中间体以约90%的组合产品摩尔产率获得，随后以高达100%的产品摩尔产率转化为相应苷元。
【数据】i系列底物浓度：1.0 mg/mL；酶浓度：1.0 mg/mL；反应时间：12/14/16 h；m系列底物浓度：1.0 mg/mL；酶浓度：5.0 mg/mL；反应时间：12/14/14 h；单糖基化中间体产率：约90%；苷元产率：高达100%
3.4 生物转化桔梗皂苷的体外生物活性
PDN型桔梗皂苷的逐步脱糖基化与体外脂氧合酶（LOX）抑制活性从37%增至63%以及DPPH自由基清除活性从9%增至72%相关（图7）。LOX抑制活性测定中使用黄芩素和NDGA（各4.0 μM）作为阳性对照。
【数据】LOX抑制活性：37%→63%；DPPH自由基清除活性：9%→72%；阳性对照：黄芩素和NDGA各4.0 μM
讨论与解读
本研究展示了使用Rapidase PL Classic——一种商用黑曲霉来源食品加工酶制剂——将代表性PDN型、PGA型和PCA型桔梗皂苷脱糖基化为其相应苷元。时间进程HPLC和LC-MS/MS分析使得基于观察到的前体-产物关系构建逐步脱糖基化路径成为可能，并支持制备了代表所研究路径中中间体和产物的13种参考化合物。选定的单糖基化中间体以约90%的组合产品摩尔产率获得，随后以高达100%的产品摩尔产率转化为相应苷元。PDN型桔梗皂苷的逐步脱糖基化与体外LOX抑制活性（37–63%）和DPPH自由基清除活性（9–72%）的增加相关。然而，这些关系并未建立因果结构-活性关系或生物抗炎和抗氧化功效，需要在生理相关模型中进一步研究。进一步开发食品相关应用需要评估桔梗根或其提取物的直接生物转化；优化酶载量、底物浓度和反应时间；放大规模；以及开发合适的酶去除和下游回收工艺。产物稳定性、生物利用度、安全性……
编译者解读
该研究以商用复合酶制剂实现了跨三类桔梗皂苷的广谱脱糖基化，省去了酶纯化步骤，直接对接食品加工场景。13种参考化合物的制备填补了分析标准品的空白，90%–100%的产率显示出工艺可行性。但复合酶制剂的"黑箱"特性既是优势也是局限——无法确定关键酶组分，批次间一致性难以保证，且对单糖基化底物的低比活性意味着高酶载量成本。从合成生物学视角看，若能鉴定并异源表达负责A3/D/E步骤的关键酶，有望构建定制化脱糖基化模块，实现特定糖基化程度的可控生产。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110109
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110109