来源：Static fermentation promotes biofilm-associated menaquinone-7 production through coordinated transcriptional remodeling in Bacillus subtilis（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲萘醌-7（MK-7）是长链维生素K2同系物，作为功能性食品配料备受重视。然而，发酵条件、多细胞发育与MK-7积累之间的关系尚不完全清楚。本研究以枯草芽孢杆菌4-11为对象，发现静置发酵72小时MK-7产量提高约3.4倍，168小时达到159.83 mg/L，且菌膜生物膜中MK-7含量（286.34 μg/g湿样）远高于下层发酵液（43.92 μg/g）。转录组分析揭示了群体感应、基质形成、呼吸链和前体供应基因的协同重塑，comA和comQ扰动实验进一步验证了其调控作用。
研究背景
维生素K2，尤其是甲萘醌-7（MK-7），是一种脂溶性微量营养素，因其高生物利用度而被广泛用于功能性食品和膳食补充剂。利用枯草芽孢杆菌及其纳豆 lineage 发酵生产MK-7，提供了一条与天然发酵配料需求相兼容的生物合成路线。枯草芽孢杆菌因其食品使用历史、可操作的遗传背景以及将廉价底物转化为高价值代谢物的能力，被广泛用作微生物生产宿主。更广泛地看，来自微生物和其他生物资源的天然活性代谢物正日益受到关注，凸显了开发高效生物生产平台的重要性。
此前提高MK-7产量的策略主要针对途径酶、前体供应、电子传递或培养基组成。基于生物膜的系统提供了一种互补策略——利用空间组织和持久细胞状态。然而，发酵条件如何影响多细胞发育与MK-7积累之间的关联，仍未得到充分解析。本研究以枯草芽孢杆菌4-11为研究对象，系统考察了静置发酵、菌膜发育与MK-7生产之间的关系。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究中全程使用枯草芽孢杆菌4-11（CGMCC No. 29329）。该菌株常规维持在LB琼脂平板上，并在含1.0%（w/v）胰蛋白胨、0.5%（w/v）酵母提取物和1.0%（w/v）NaCl的LB培养基中培养。发酵培养基含5.5%（w/v）葡萄糖、5.5%（v/v）甘油、5.5%（w/v）酵母提取物、3.0%（w/v）豆粉和0.06%（w/v）K₂HPO₄。种子培养制备时，从新鲜划线的LB琼脂平板上挑取单菌落接种至5 mL LB培养基中，于37 °C、200 rpm培养16 h。种子培养物以5%（v/v）接种量接入含60 mL发酵培养基的250-mL锥形瓶中。培养温度为40 °C。振荡培养以200 rpm进行，静置培养不搅拌，振荡转静置培养为先以200 rpm培养72 h后静置96 h。三种培养策略在168 h时进行比较。静置和振荡的时间进程从独立锥形瓶中在0、24、48、72、96、120、144和168 h取样。每种培养条件和采样时间均包含三个独立生物学培养。容器特异性形态观察见2.7节。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌4-11（CGMCC No. 29329）；LB培养基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0% NaCl；发酵培养基：5.5%葡萄糖、5.5%甘油、5.5%酵母提取物、3.0%豆粉、0.06% K₂HPO₄；种子培养：37 °C、200 rpm、16 h；接种量：5%（v/v）；装液量：60 mL/250-mL锥形瓶；培养温度：40 °C；振荡转速：200 rpm；振荡转静置：200 rpm 72 h + 静置96 h；采样时间点：0、24、48、72、96、120、144、168 h；生物学重复：3个
2.2 MK-7提取与定量
全培养MK-7测定时，将整个培养物充分匀质化以包含菌膜相关物质和下层发酵液。对于120 h比较实验，匹配的菌膜、下层液体和全培养样品在提取前称重，MK-7以每克提取前湿样表示。MK-7提取采用此前报道的方法并稍作修改。简言之，样品用正己烷和异丙醇混合物（2:1，v/v）提取三次。合并有机相蒸发至干，残渣溶于异丙醇，经0.22-μm尼龙膜过滤，用高效液相色谱（HPLC）分析。组分样品的MK-7含量以每克湿样的μg数表示。MK-7定量使用Agilent 1260 HPLC系统，配备ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm）。流动相为甲醇/二氯甲烷（4:1，v/v），流速1.0 mL/min。柱温维持40 °C，进样量20 μL，检测波长248 nm。定量基于外标MK-7标准曲线（A = 22.79C − 17.24，R² = 0.9995；图S5g），分析选择性通过溶剂和基质空白、MK-7标准品、样品提取物和提取后加标混合物检查（图S5a–f）。
【数据】提取溶剂：正己烷/异丙醇（2:1，v/v）；提取次数：3次；过滤膜：0.22-μm尼龙膜；HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇/二氯甲烷（4:1，v/v）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 °C；进样量：20 μL；检测波长：248 nm；标准曲线：A = 22.79C − 17.24，R² = 0.9995
2.3 活细胞计数与MK-7归一化
活细胞丰度通过菌落形成单位（CFU）计数测定，因为不溶性豆粉干扰光密度和干重测量。全培养物在取样前充分匀质化，在无菌生理盐水中系列稀释，涂布于LB琼脂。37 °C培养16–24 h后计数菌落。活细胞丰度以CFU/mL表示（用于全培养时间进程和菌株比较），以CFU/g湿样表示（用于匹配的120 h培养组分）。每个条件和时间点分析三个独立生物学培养。对于匹配的全培养测量，计算MK-7积累与CFU指数为I = C × 10⁹ / N（μg MK-7 per 10⁹ CFU），其中C为MK-7浓度（mg/L），N为相应CFU/mL。平均体积MK-7积累速率计算为C(t)/t（mg L⁻¹ h⁻¹）。这些描述性指标见图S7。
【数据】CFU培养条件：37 °C、16–24 h；稀释液：无菌生理盐水；生物学重复：3个；MK-7积累与CFU指数：I = C × 10⁹ / N；平均体积积累速率：C(t)/t（mg L⁻¹ h⁻¹）
2.4 RNA提取与测序
为研究静置培养相关的分子响应，使用振荡和静置条件下培养120 h的培养物进行比较转录组分析。对于时间分辨转录组分析，在静置培养1、3和5天后收集发酵液。全培养物在细胞收获和RNA提取前充分匀质化，以包含菌膜相关细胞和悬浮细胞。每个条件和采样时间点制备三个独立生物学重复。细胞通过离心收获，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，立即在液氮中冷冻，−80 °C保存待RNA提取。总RNA用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取，RNA质量用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美国）评估。构建链特异性cDNA文库，在Illumina NovaSeq X Plus平台（诺禾致源，北京，中国）测序。
【数据】比较转录组时间点：120 h；时间分辨转录组时间点：静置培养1、3、5天；生物学重复：3个；洗涤缓冲液：无菌PBS；洗涤次数：3次；保存温度：−80 °C；RNA提取试剂：TRIzol；测序平台：Illumina NovaSeq X Plus
2.5 RNA-seq数据处理、差异表达与功能富集分析
原始reads经过质量过滤，使用Bowtie2 v2.3.4.3比对到枯草芽孢杆菌168参考基因组（NC_000964.3）。基因水平计数用featureCounts v1.5.0-p3生成，排除比对质量< 10的reads、不恰当配对的reads和比对到多个位置的reads（表S2）。差异表达分析使用DESeq2从原始整数计数进行，P值用Benjamini–Hochberg程序校正。DEG定义为padj < 0.05且|log2FC| > 0的基因，无额外倍数变化截断。FPKM值仅用于描述性表达汇总和可视化，样品变异通过相关性和主成分分析评估（图2a和图S4）。对所有、上调和下调DEG进行GO和KEGG富集分析，使用clusterProfiler配合超几何检验和相应注释基因作为背景。padj < 0.05的条目视为显著富集，KEGG Level-2分类与富集分析分开呈现（图2c–e和图S2）。
【数据】比对工具：Bowtie2 v2.3.4.3；参考基因组：枯草芽孢杆菌168（NC_000964.3）；计数工具：featureCounts v1.5.0-p3；比对质量阈值：< 10排除；差异分析工具：DESeq2；校正方法：Benjamini–Hochberg；DEG标准：padj < 0.05且|log2FC| > 0；富集工具：clusterProfiler；显著性阈值：padj < 0.05
2.6 定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析
从等量RNA输入使用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（翌圣生物，中国）合成cDNA。qRT-PCR使用Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix在LightCycler® 96系统（Roche，瑞士）上进行，条件为95 °C 2 min，随后40个循环的95 °C 10 s和60 °C 30 s，附熔解曲线分析。引物序列见表1。16S rRNA转录本用于归一化，相对表达用2⁻ΔΔCt方法计算。每个条件分析三个独立生物学重复，每个样品进行三个技术重复。
【数据】cDNA合成试剂盒：Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix；qPCR试剂：Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix；仪器：LightCycler® 96；预变性：95 °C、2 min；循环数：40；变性：95 °C、10 s；退火/延伸：60 °C、30 s；归一化基因：16S rRNA；计算方法：2⁻ΔΔCt；生物学重复：3个；技术重复：3个
2.7 comA和comQ扰动菌株的构建与表型评估
为确定ComQXPA相关调控对菌膜发育和MK-7积累的贡献，在枯草芽孢杆菌4-11中构建了comA和comQ缺失突变体和过表达菌株（图7a, e）。对于每个缺失，通过重叠延伸PCR将约1-kb上游和下游同源区域与氯霉素抗性盒融合，通过自然感受态介导转化引入枯草芽孢杆菌4-11。对于过表达，将comA或comQ编码序列置于组成型PclpP或木糖诱导型PxylA启动子下，通过同源重组整合到hsdR位点。重组菌株通过菌落PCR和测序验证。菌膜形态在12孔板中48 h定性记录，另外在10-cm培养皿中进行comA比较、在100-mL锥形瓶中进行comQ比较（图7b, f；图S6g–k）。野生型菌膜发育和菌落形态也进行了记录（图S6a–f）。检查三个独立生物学重复。
【数据】同源臂长度：约1-kb；抗性标记：氯霉素；启动子：PclpP（组成型）、PxylA（木糖诱导型）；整合位点：hsdR；菌膜形态记录时间：48 h；培养容器：12孔板、10-cm培养皿、100-mL锥形瓶；生物学重复：3个
2.8 基于基因组的分类学特征
（原文此节内容不完整，节选截止于此。）
研究结果
3.1 静置发酵提高MK-7产量并与菌膜生物膜中MK-7富集相关
从苗圃土壤中分离到一株MK-7生产菌株，基于16S rRNA基因序列分析、形态特征、全基因组测序和ANI比较鉴定为枯草芽孢杆菌（图S1；表S4）。该分离株被命名为枯草芽孢杆菌4-11，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No. 29329）。基于基因组的CARD和VFDB筛选未检测到符合应用标准的可报告抗菌素耐药或毒力相关决定簇。为确定发酵模式如何影响MK-7生产，比较了振荡、振荡-静置和静置发酵策略。168 h后，静置发酵的MK-7产量显著高于振荡或振荡-静置培养（图1f）。静置和振荡-静置条件下的终点CFU也高于振荡培养（图1g）。时间进程分析进一步揭示了不同的生产和活细胞动态（图1h, i）。尽管振荡条件下MK-7出现更早，但静置发酵在72 h后超过振荡，达到59.37 mg/L，约为振荡条件下的3.4倍，并在168 h增至159.83 mg/L。观察到显著的培养模式与时间交互作用（P < 0.0001；表S3）。可培养细胞丰度在振荡条件下增加更早，但48 h后下降，而静置培养维持较高的后期CFU。一致地，静置培养在中后期显示更高的平均体积MK-7积累，而振荡条件下MK-7与CFU指数的后期增加与CFU下降同时发生，因此不被解释为细胞特异性生产力增加（图S7）。静置发酵同时在气液界面产生厚而皱的菌膜（图1c–e），其发育在24–72 h记录（图S6a–c）。将成熟菌膜与下层培养基匀质化产生粘性基质，与结构化多细胞状态一致。120 h时，菌膜相关物质的每克湿样MK-7含量高于下层发酵液，而每克CFU显示相反模式（图1j, k）。MK-7积累与菌膜发育的同步增加，加上菌膜相关物质中MK-7的湿重归一化富集，支持静置发酵下菌膜形成状态与MK-7积累之间的关联，并为研究该表型背后的调控特征提供了基础。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌4-11（CGMCC No. 29329）；静置发酵72 h MK-7：59.37 mg/L；振荡条件下72 h的约3.4倍；168 h MK-7：159.83 mg/L；培养模式×时间交互：P < 0.0001；120 h菌膜MK-7：286.34 μg/g湿样；120 h下层发酵液MK-7：43.92 μg/g湿样；菌膜发育记录时间：24–72 h；比较时间点：168 h
3.2 静置发酵与ComQXPA–ComA群体感应及生物膜基质转录重塑相关
为鉴定与菌膜相关MK-7生产表型相关的调控特征，比较了枯草芽孢杆菌4-11在振荡和静置条件下培养120 h的全培养转录组。静置培养与2,188个DEG相关，包括1,116个上调和1,072个下调基因（图2b），样品相关性和PCA显示培养模式间明显分离（图2a和图S4a）。KEGG Level-2分类和GO/KEGG富集分析揭示了广泛的功能性转录变化，富集分别对所有DEG和方向性子集进行评估（图2c–e和图S2）。代表主要RNA-seq相关功能类别的选定qRT-PCR靶标显示与RNA-seq结果大致一致的趋势（图2f），包括涉及中心碳代谢、前体供应、MK-7相关代谢、调控、ATP合成、蛋白质转运和氧化应激响应的基因。ComQXPA群体感应系统基因在静置发酵下显示转录本丰度增加（图3）。comX、comQ和comA的转录本显著增加，而comP无显著变化（表2）。表面活性素相关基因sfp也上调。这种表达模式与ComQXPA–ComA相关的对静置培养的转录响应一致，但未直接证明信号活性增加。这些变化与下游生物膜调控网络的重塑同时发生：ComA响应的srfAA-AD操纵子和生物膜相关调控因子sinI和slrR上调，而基质抑制因子sinR下调。总之，这些变化与有利于基质基因表达和菌膜发育的转录状态一致。相应地，胞外多糖操纵子epsA-O、淀粉样纤维操纵子tapA-sipW-tasA和疏水蛋白基因bslA内的多个基因在静置培养下显示转录本丰度增加。这些协调变化为显著的菌膜表型提供了转录支持。加上菌膜相关物质中较高的湿重归一化MK-7含量，这些发现支持静置发酵下QS相关转录重塑、菌膜发育和MK-7富集之间的关联（表2）。
【数据】比较时间点：120 h；DEG总数：2,188；上调：1,116；下调：1,072；DEG标准：padj < 0.05且|log2FC| > 0；上调基因：comX、comQ、comA、sfp、srfAA-AD、sinI、slrR、epsA-O、tapA-sipW-tasA、bslA；下调基因：sinR；无显著变化：comP；生物学重复：3个
3.3 生物膜相关呼吸和前体供应转录重塑伴随MK-7产量提高
静置发酵还与呼吸代谢、氧化磷酸化（图4）以及中心碳代谢和MK-7前体供应途径（图5）的广泛转录变化相关。这些变化并非直接证明代谢通量增加，而是表明与菌膜表型和增强的MK-7积累相关的生产相关转录状态。多个呼吸链组分，包括NADH脱氢酶ndhF、细胞色素氧化酶亚基ctaCDEFG和ATP合酶亚基atpA-I，在120 h静置发酵下显示转录本丰度增加。高氧亲和力的bd型末端氧化酶基因ythAB也显示转录本丰度增加，这可能反映静置培养下对氧可用性差异的呼吸调整。总之，这些转录响应表明维持呼吸电子传递和能量保存是静置发酵状态的重要特征，尽管呼吸速率和ATP水平未直接测量。转录重塑还扩展到中心碳代谢（图5）。甘油利用和糖酵解基因glpK和pfkA显示转录本丰度增加，而丙酮酸脱氢酶复合体基因pdhABCD显示丰度降低。在丙酮酸–草酰乙酸–磷酸烯醇式丙酮酸节点也观察到pycA和pckA的变化。总体而言，这些变化表明静置发酵下碳利用和前体相关途径的转录重组，但未确定代谢通量的方向或幅度。供应MK-7两个结构部分的基因同样受到影响（图5）。在莽草酸途径中，aroG和下游aroBCF基因显示转录本丰度增加，与分支酸衍生前体供应的转录变化一致。在甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径中，dxr和idi也上调，表明类异戊二烯前体相关功能的转录重塑。总之，这些变化将静置发酵与MK-7两个前体分支相关的转录重塑联系起来。
【数据】比较时间点：120 h；上调呼吸链基因：ndhF、ctaCDEFG、atpA-I、ythAB；上调中心碳代谢基因：glpK、pfkA；下调中心碳代谢基因：pdhABCD；节点变化基因：pycA、pckA；上调莽草酸途径基因：aroG、aroBCF；上调MEP途径基因：dxr、idi；呼吸速率和ATP水平：未直接测量
3.4 静置培养过程中的时序转录重塑
时间分辨转录组分析在静置培养第1、3和5天总结了与群体感应、生物膜调控和基质形成、电子传递和ATP合成以及MK-7生物合成相关的选定基因（图6）。结果表明，这些功能类别中的基因呈现基因特异性的时序重塑，而非统一的顺序激活程序。
【数据】时间点：静置培养第1、3、5天；分析类别：群体感应、生物膜调控和基质形成、电子传递和ATP合成、MK-7生物合成
3.5 comA和comQ扰动对菌膜发育和MK-7积累的影响
为确定ComQXPA相关调控对菌膜发育和MK-7积累的贡献，构建了comA和comQ缺失突变体和过表达菌株（图7a, e）。菌膜形态在12孔板中48 h定性记录，另外在10-cm培养皿中进行comA比较、在100-mL锥形瓶中进行comQ比较（图7b, f；图S6g–k）。comA或comQ的缺失改变了菌膜发育和MK-7积累，任一基因的缺失也降低了可培养细胞丰度。
【数据】扰动基因：comA、comQ；菌膜形态记录时间：48 h；培养容器：12孔板、10-cm培养皿、100-mL锥形瓶；缺失突变体效应：菌膜发育改变、MK-7积累改变、可培养细胞丰度降低；生物学重复：3个
讨论与解读
本研究将静置发酵确定为一种与群体行为和转录状态协同变化相关的工艺条件。在枯草芽孢杆菌4-11中，增强的MK-7积累伴随持续的后期可培养细胞丰度、菌膜发育、菌膜相关物质中湿重归一化的MK-7富集，以及ComQXPA、基质、呼吸和前体相关基因表达的重塑。此前研究已将SinR修饰和工程化群体感应回路与MK-7生产联系起来。通过整合培养模式比较、时序转录组学和comA/comQ扰动，本研究支持静置发酵、菌膜发育、调控重塑和增强MK-7积累之间的过程级关联，而胞外基质形成的具体贡献仍未解决。
静置发酵改变了混合、氧传递、表面可及性和局部细胞密度，这可能促成观察到的ComQXPA和基质相关转录变化。comQ、comX、comA、表面活性素相关基因和基质相关基因的表达增加与菌膜形成状态一致，尽管启动该响应的物理特征尚未确定。此前研究已将SinR修饰和工程化QS回路与生物膜表型和MK-7生产联系起来。
编译者解读
该研究从工艺条件（静置发酵）切入，通过转录组+基因扰动的组合策略，将多细胞发育与次级代谢产物积累联系起来，为MK-7发酵过程优化提供了新维度。其价值在于提示生物反应器设计不应只关注混合与传质，菌膜状态本身可能是生产力的一部分。局限在于研究停留在转录关联层面，未直接测定代谢通量、ATP水平或信号分子浓度，comA/comQ扰动后MK-7变化的定量数据在节选中也未完整呈现。后续若能将转录特征转化为可操作的工艺参数或遗传靶点，将更具应用价值。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110266
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110266