来源：Localized co-inoculation of compatible Bacillus subtilis and Trichoderma afroharzianum is associated with shifts in the root microbiome and improves plant performance in sorghum（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
细菌—真菌联合体在植物促生中已有不少研究，但它们对高粱表现及根系微生物类群的影响尚不清楚。本研究以枯草芽孢杆菌（BS）与非洲哈茨木霉（TA）为对象，通过体外共培养、温室盆栽、分根系统和扩增子测序，系统评估单接种与共接种对高粱生长、光合、养分状况和根系微生物组的影响。共接种处理获得最高综合植株表现指数（CPPI = 0.628）和地上部鲜重，并富集了促生放线菌、产铁载体肠杆菌和有益真菌Podospora；而灭菌土中接种效果消失，暗示其功能依赖本土微生物群落的协同。
研究背景
高粱（Sorghum bicolor L. Moench）是全球第五大谷类作物，因生物量高、水分利用效率好、环境适应性强而被用于粮食、饲料和生物能源生产。在农业寻求替代化肥与化学改良剂的背景下，用可持续的生物投入提高高粱产量愈发重要。植物根际细菌和真菌可通过改善养分获取、调节植物激素、促进根系发育、增强光合活性和胁迫耐受性来提升作物表现。
在有益接种剂中，枯草芽孢杆菌是研究最广的促生根际细菌之一，具备强根际定殖力、产孢能力和多种促生机制，包括养分溶解、产植物激素与挥发性物质、抑制病原、形成生物膜以及调节植物胁迫响应。木霉属真菌同样被广泛用作生物防治和促生制剂。尽管细菌—真菌联合体已被研究用于植物促生，但其对高粱表现和根系微生物类群的影响仍缺乏系统表征。本研究即针对这一空白，考察单接种与共接种如何影响高粱表现和根系微生物组组装。
研究方法
2.1 双培养相容性试验
采用半强度马铃薯葡萄糖琼脂（½ PDA；Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）上的双培养试验评价非洲哈茨木霉与枯草芽孢杆菌的相容性。从生长5天的非洲哈茨木霉（1 × 10⁶ 分生孢子 mL⁻¹）培养物活跃生长边缘切取直径5 mm的琼脂块，置于90 mm培养皿距一侧边缘约1 cm处。枯草芽孢杆菌调整至约1 × 10⁸ CFU mL⁻¹（OD600 ≈ 0.1），在平板对侧距真菌块约5 cm处作单条线状划线接种。仅含非洲哈茨木霉或枯草芽孢杆菌的对照平板以相同方式制备。所有平板于28 ± 1 °C黑暗培养。接种后48、72和96 h，沿朝向细菌划线的轴测量真菌菌落直径，垂直划线方向测量细菌菌落宽度。每个处理设5个独立生物学重复（n = 5）。整个培养期间目视评估菌落形态、产孢情况及是否存在抑制带。
【数据】培养基：½ PDA；真菌接种量：5 mm菌饼（1 × 10⁶ 分生孢子 mL⁻¹）；细菌接种量：1 × 10⁸ CFU mL⁻¹（OD600 ≈ 0.1）；培养温度：28 ± 1 °C；测量时间点：48、72、96 h；重复数：n = 5
2.2 植物栽培与生长条件
高粱种子（Sorghum bicolor L.；USDA-GRIN 登录号 PI 591038 和 PI 707107）用2%次氯酸钠表面消毒5 min，无菌蒸馏水冲洗3次，于25 °C在育苗盘中萌发48 h。将长势一致的幼苗移栽至装有500 g土壤基质的塑料盆中，基质由农田土壤与商品育苗基质按1:2（v/v）混合而成。设4个处理：(i) 未接种对照；(ii) 枯草芽孢杆菌（BS；1 mL 1 × 10⁸ CFU mL⁻¹；ARS Culture Collection–USDA，NRRL B-14596）；(iii) 非洲哈茨木霉T22（TA；1 mL 1 × 10⁶ 分生孢子 mL⁻¹）；(iv) BS + TA联合接种。在附加栽培试验中，种植前将土壤于121 °C高压灭菌20 min，以尽量减少原生土壤微生物。试验用土壤的理化性质在种植前测定，见补充表S1。每个处理设3个生物学重复，每盆1株。微生物接种剂在移栽时以灌根方式施用。整个试验期间土壤pH维持约6.5。植株在温室中生长6周，采用完全随机设计，光周期10 h光照/14 h黑暗，光合光子通量密度约250 μmol m⁻² s⁻¹，温度25 ± 2 °C。
【数据】种子消毒：2%次氯酸钠5 min；萌发：25 °C、48 h；土壤基质：农田土:育苗基质 = 1:2（v/v），每盆500 g；BS接种：1 mL、1 × 10⁸ CFU mL⁻¹（NRRL B-14596）；TA接种：1 mL、1 × 10⁶ 分生孢子 mL⁻¹；灭菌条件：121 °C、20 min；土壤pH：约6.5；光周期：10 h光/14 h暗；光强：约250 μmol m⁻² s⁻¹；温度：25 ± 2 °C；生长时间：6周；重复数：每处理3个生物学重复
2.3 分根试验
开展分根试验以评价BS + TA联合体施用于一个或两个根区室时高粱的生长响应。简言之，高粱幼苗先在灭菌土壤中生长2周。移栽后，植株在上述温室条件下于分根系统中继续维持4周。随后将每株幼苗的根系小心分成大致相等的两份，移栽至两个相邻的土壤区室（图4A）。植株分配至3个处理：SR1，对照/对照，两个根区室均不接种微生物；SR2，对照/BS + TA，仅一个根区室接种BS + TA联合体；SR3，BS + TA/BS + TA，两个根区室均接种。每个处理设3个独立生物学重复。
【数据】预培养：灭菌土2周；分根系统维持：4周；处理：SR1（对照/对照）、SR2（对照/BS+TA）、SR3（BS+TA/BS+TA）；重复数：每处理3个独立生物学重复
2.4 根系样品中接种剂的分子检测
采用终点PCR评估高粱根系样品中TA和BS的存在。根系样品用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔冲洗2次，短暂涡旋以去除松散附着的土壤颗粒，再用无菌蒸馏水洗涤2次。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从约0.2 g根组织中提取基因组DNA（Clarke, 2009）。用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA）测定DNA浓度和纯度，PCR前将DNA样品归一化至相等浓度。PCR扩增使用TA特异性引物（正向：5′-GTCGGTAGCTGAAAGGGG-3′；反向：5′-ATTAGGCCGGAAACACC-3′）和BS特异性引物（正向：5′-TCTGCTCGTGAACGGTGCT-3′；反向：5′-TTTCGCCTTATTTACTTGG-3′）。每个PCR反应（25 μL）含1 × PCR缓冲液、0.2 mM dNTPs、0.4 μM各引物、1 U Taq DNA聚合酶和约50 ng基因组DNA。扩增条件为：95 °C初始变性3 min，随后35个循环的95 °C 30 s、引物特异性退火56 °C 30 s、72 °C 30 s，最后72 °C延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶（GelRed染色）电泳分离，用GelDoc™ EZ Imager（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）可视化。
【数据】根组织用量：约0.2 g；PCR体系：25 μL，含1 × PCR缓冲液、0.2 mM dNTPs、0.4 μM引物、1 U Taq酶、约50 ng DNA；变性：95 °C 3 min；循环数：35；退火：56 °C 30 s；延伸：72 °C 30 s；终延伸：72 °C 5 min；凝胶：1.5%琼脂糖；TA扩增子：300 bp；BS扩增子：136 bp
2.5 生长与生理指标测定
用SPAD叶绿素仪（SPAD-502 Plus, Konica Minolta, Japan）无损测定叶绿素含量。用便携式FluorPen FP 110（Photon Systems Instruments, Czech Republic）在3个不同位置的最上部完全展开叶上测定叶绿素荧光动力学（OJIP），包括PSII最大量子效率（Fv/Fm）和光合性能指数（Pi_ABS）。OJIP测定前叶片暗适应1 h。此外，用直尺从茎基部量至最长叶尖端作为株高；根系轻柔洗净后从冠部量至最长根尖端作为根长。形态测量后分离地上部与根系，立即用分析天平称重以确定地上部鲜重和根鲜重。
【数据】叶绿素测定：SPAD-502 Plus；荧光测定：FluorPen FP 110，暗适应1 h；测定指标：Fv/Fm、Pi_ABS；株高：茎基部至最长叶尖；根长：冠部至最长根尖；称重：分析天平
2.6 综合植株表现指数
计算综合植株表现指数（CPPI），将测得的生长和生理性状整合为单一表现指标。对每个性状，处理均值用Z分数标准化，计算式为 Z = (x − μ)/σ，其中x为均值，μ为各处理总体均值，σ为相应标准差。每个处理的CPPI通过平均所有纳入性状的Z分数获得，数值越高表示整体植株表现越好。
【数据】标准化方法：Z = (x − μ)/σ；CPPI：纳入性状Z分数的平均值
2.7 高粱根和叶的元素分析
小心收获根系样品，自来水下彻底冲洗去除附着土壤颗粒，随后浸入0.1 mM CaSO₄溶液10 min以消除表面结合离子。根系再用去离子水冲洗，而叶片样品仅用去离子水洗涤。所有样品转入标记纸信封，于75 °C强制通风烘箱中干燥72 h至恒重。干燥的根和叶组织随后研磨成细粉用于元素分析。铁（Fe）浓度用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES；Shimadzu ICPE-9820, Japan）测定，氮（N）和碳（C）含量用元素分析仪（Thermo Fisher FLASH SMART, USA）定量。所有分析在Lamar University水与空气质量高级研究中心进行。
【数据】CaSO₄浸泡：0.1 mM、10 min；干燥：75 °C、72 h；Fe测定：ICP-OES（Shimadzu ICPE-9820）；N、C测定：元素分析仪（Thermo Fisher FLASH SMART）
2.8 根际铁载体测定
通过轻刷附着于根系的土壤收集根际土。用铬天青S（CAS）法测定铁载体产生（Alexander and Zuberer, 1991）。简言之，用无菌蒸馏水制备根际土壤悬液，上清液与CAS试剂混合。室温孵育后，用分光光度计在630 nm处测定吸光度。铁载体产生……
【数据】方法：CAS法；测定波长：630 nm；孵育：室温；原文未详述其余参数
研究结果
3.1 非洲哈茨木霉与枯草芽孢杆菌的体外相容性
用半强度PDA培养基上的双培养试验评价非洲哈茨木霉与枯草芽孢杆菌的相容性。在整个96 h培养期间，真菌菌落与细菌划线之间未出现可见抑制带（图1A）。同样，两种微生物在彼此存在下均未表现出可检测的菌落形态、色素或产孢变化，表明二者在测试条件下相互兼容（图1A）。定量测量进一步支持这一观察（图1B）。共培养中枯草芽孢杆菌的生长在48、72和96 h与单培养相当，各时间点均未检测到显著差异。同样，非洲哈茨木霉的菌落扩展在72和96 h不受共培养影响。共培养中真菌菌落直径在48 h较单培养有适度但显著的增加，而后续生长在两种处理中达到相似的菌落大小。至72 h，真菌菌落几乎到达培养皿边缘，96 h时无论培养条件如何均观察到完全覆盖平板（图1B）。
【数据】培养时间：96 h；测量时间点：48、72、96 h；48 h共培养真菌菌落直径：较单培养显著增加；72 h：菌落近培养皿边缘；96 h：完全覆盖平板；抑制带：无；BS生长差异：各时间点均不显著
3.2 微生物接种对高粱生长和生理性状的影响
微生物接种明显促进高粱生长和根系发育（图2A）。接种枯草芽孢杆菌、非洲哈茨木霉或其共接种（BS+TA）的高粱植株较对照植株更高、冠层更密。接种植株的根系也较对照更大、更发达。在接种处理中，枯草芽孢杆菌与非洲哈茨木霉共接种表现出最旺盛的整体植株表型，地上部和根系发育均更好（图2A）。PCR分析确认了相应接种剂在根系样品中的存在。BS特异性扩增在BS和BS + TA处理中产生预期的136 bp片段，而对照或TA处理中未检测到扩增。同样，TA特异性扩增在TA和BS + TA处理中产生预期的300 bp片段，而对照或BS处理中未产生（图2B）。
【数据】BS扩增子：136 bp（BS、BS+TA处理检出）；TA扩增子：300 bp（TA、BS+TA处理检出）；对照：均未检出
评估了BS、TA及其联合接种（BS+TA）对高粱生长和生理表现的影响。所有微生物处理均较对照显著提高SPAD叶绿素含量，BS、TA和BS + TA之间无显著差异（图2C）。PSII最大量子效率（Fv/Fm）在TA接种下显著更高，而BS和BS + TA呈中间响应，与对照或TA接种处理均无显著差异（图2D）。同样，光合性能指数（Pi_ABS）在所有接种处理中均显著高于对照，BS、TA和BS + TA之间无显著差异（图2E）。本研究中，株高在所有接种处理中较对照显著增加，而BS、TA和BS + TA之间未检测到显著差异（图3A）。地上部鲜重在枯草芽孢杆菌—非洲哈茨木霉共接种下显著高于TA或BS单接种处理，而对照植株地上部鲜重最低（图3B）。根长在BS和BS + TA中显著大于对照，TA呈中间值，与两组均无显著差异（图3C）。根鲜重在BS下较对照和TA显著增加，而BS + TA呈中间值，与BS或TA均无显著差异。此外，对照在所有处理中根鲜重最低（图3D）。根际铁载体产生在接种后也显著增加，BS、TA和BS + TA均高于对照植株（图3E）。元素分析中，BS、TA和BS + TA接种的根系Fe浓度均显著高于未接种对照（图3F）。叶片中，对照植株Fe浓度最低，而BS、TA和BS + TA接种显著提高Fe浓度。尽管BS + TA联合体叶片Fe平均浓度最高，但与单接种无显著差异（图3F）。根和叶N、C浓度在微生物接种后均增加，枯草芽孢杆菌与非洲哈茨木霉联合体叶片N和C含量最高。对照根系N和C水平最低，而BS、TA和BS + TA联合体根系N和C显著更高（图3G-H）。相反，叶片N和C在处理间存在差异，枯草芽孢杆菌—非洲哈茨木霉联合体叶片N和C水平相对对照和其他接种剂最高（图3G-H）。
【数据】SPAD叶绿素：所有接种处理显著高于对照；Fv/Fm：TA显著最高；Pi_ABS：所有接种处理显著高于对照；株高：所有接种处理显著高于对照；地上部鲜重：BS+TA > BS/TA > 对照；根长：BS、BS+TA显著大于对照；根鲜重：BS显著高于对照和TA，对照最低；根际铁载体：BS、TA、BS+TA均显著高于对照；根Fe：所有接种处理显著高于对照；叶Fe：接种处理显著提高，BS+TA均值最高但无显著差异；根N、C：BS、TA、BS+TA显著高于对照；叶N、C：BS+TA最高
3.3 综合植株表现指数
为整合微生物接种对所有测得生长和生理性状的影响，基于Z分数标准化计算了综合植株表现指数（CPPI）（表1）。枯草芽孢杆菌与非洲哈茨木霉共接种表现出最高CPPI（0.628），在所有处理中排名第一，其次是BS（0.409）和TA（0.270）。对照处理综合得分为负（−1.308），排名第四。接种处理中大多数测得性状的标准化值为正，而对照在所有评价参数中一致表现为负标准化值（表1）。
【数据】CPPI：BS+TA = 0.628（第1）；BS = 0.409（第2）；TA = 0.270（第3）；对照 = −1.308（第4）
3.4 分根系统中植株的响应
分根试验显示，枯草芽孢杆菌与非洲哈茨木霉（BS+TA）共接种显著促进高粱生长，两个根区室均接种时（SR3）响应最强（图4B, D–H）。此外，终点PCR仅在接种的根区室中检测到微生物接种剂（图4C）。SR1（对照/对照）两个根区室均未检测到TA或BS特异性扩增。SR2（对照/BS+TA）中，预期的300 bp TA特异性和136 bp BS特异性扩增子仅在接种区室中检测到，未接种区室无可检测扩增。SR3（BS+TA/BS+TA）中，两个根区室均检测到两种预期扩增子。此外，叶绿素值和株高在SR2和SR3中均较SR1显著增加，但SR2与SR3之间无显著差异（图4D和4F）。茎直径和地上部鲜重在各处理间递增，SR3最高，其次为SR2和SR1（图4E和4G）。根长在BS + TA接种下较对照增加（图4H）。在SR1和SR2内，两个根区室间根长无显著差异。相反，SR3中两个根区室间观察到显著差异（P < 0.01）（图4H）。
【数据】SR1：两区室均无扩增；SR2：TA（300 bp）和BS（136 bp）仅在接种区室检出；SR3：两区室均检出两种扩增子；叶绿素和株高：SR2、SR3显著高于SR1；茎直径和地上部鲜重：SR3 > SR2 > SR1；根长：BS+TA较对照增加；SR3两区室根长差异：P < 0.01
3.5 微生物接种对细菌群落的影响
基于Bray–Curtis相异度的非度量多维标度（NMDS）展示了4个处理间细菌群落组成的分布（图5A）。NMDS排序的stress值为0.075，表明二维空间良好地代表了群落差异。4个处理的样品呈现适度分离，尽管处理组间存在一些重叠。PERMANOVA检测到处理间细菌群落组成无显著差异（R² = 0.318，P = 0.106）。此外，α多样性分析显示对照、BS、TA和BS + TA处理间在任何细菌……
【数据】NMDS stress值：0.075；PERMANOVA：R² = 0.318，P = 0.106；α多样性：处理间无显著差异
讨论与解读
本研究证明，枯草芽孢杆菌—非洲哈茨木霉共接种可增强高粱生长，并伴随根系微生物类群的选择性变化，而不改变整体微生物多样性。将植物表型分析与微生物组图谱、共现网络、核心微生物组、指示物种和植物—微生物相关性分析相结合，识别出与改善养分获取和植株表现可能相关的处理关联微生物类群及植物—微生物关联。
微生物联合体的成功应用要求各微生物间具有相容性，使它们能够共存而不发生可能损害其持久性和有益功能的拮抗互作。本研究中，相容性试验表明非洲哈茨木霉与枯草芽孢杆菌在体外条件下相容，共培养期间无生长抑制或形态改变的证据。这些结果支持它们作为微生物联合体的同时应用，并为后续温室试验奠定了实验基础。近期一项大豆研究表明，哈茨木霉与枯草芽孢杆菌共接种有益地改变了根……
编译者解读：该研究的方法学亮点在于用分根系统将"局部信号"与"全株响应"解耦，配合灭菌土对照，清晰指向共接种效应依赖本土微生物群落而非接种菌本身。CPPI整合多性状的做法值得借鉴，但α/β多样性无显著变化、仅类群水平出现选择性富集，说明群落层面的功能冗余较强，单靠扩增子数据难以锁定因果机制。后续若结合宏基因组或代谢组，并验证Actinoplanes、Enterobacter等指示类群的功能，才可能把相关性推向因果性。
参考来源
期刊：Microbiological Research, 2027
DOI: 10.1016/j.micres.2026.128751
DOI: 10.1016/j.micres.2026.128751