来源：Development and activity evaluation of a highly efficient CRISPR-Cas genome editing system in larch（Horticultural Plant Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
落叶松是我国重要的造林与用材树种，但其生命周期长、遗传背景复杂、稳定转化困难，基因组编辑研究长期滞后。本研究在日本落叶松中建立了一套基于内源启动子的高效CRISPR/Cas基因组编辑系统。研究者优化了原生质体制备与转化参数，获得超过90%活性细胞和40%的瞬时转化效率；通过基因组与转录组联合分析筛选出41个候选启动子，鉴定出高活性内源启动子LarPE004，并证明LarPE004驱动的STU-Cas9系统在单基因和多基因编辑中均优于CaMV 35S和ZmUbi1驱动的系统，为落叶松功能基因组学与分子育种提供了高效工具。
研究背景
日本落叶松[Larix kaempferi (Lamb.) Carr.]是我国重要的造林和木材生产树种，以优异的材性、较强的抗病性和广泛的用途著称。然而，落叶松生命周期长、遗传背景复杂、无性繁殖困难，传统育种方法在培育优良品种方面面临巨大挑战。早期落叶松研究集中在遗传变异、种源选择、木材性状、种子园建立和光合特性等方面。随着日本落叶松基因组完成测序，系统分析落叶松基因功能、推进遗传转化技术、综合应用现代育种技术以实现优良品种的快速选育成为主要目标。
目前，CRISPR-Cas9系统已广泛应用于多种植物的基因组编辑，包括拟南芥、烟草、水稻、玉米等。但在许多非模式林草植物中，由于基础研究相对滞后、遗传操作困难（如基因转化），基因组编辑的应用仍然受限。植物的稳定遗传转化因再生耗时且困难而面临重大挑战，对落叶松等非模式物种尤为如此。原生质体瞬时表达系统因流程简单快速，已被广泛用于植物基因组编辑。本研究旨在建立落叶松高效的CRISPR/Cas基因组编辑系统，利用内源启动子驱动，为落叶松功能基因组学研究和分子育种奠定基础。
研究方法
2.1 植物材料与生长条件
日本落叶松种子（Larix kaempferi）采自中国东北辽宁省大孤家种子园（42°22′N，124°51′E）的树木。水稻（Oryza sativa L. japonica）品种日本晴和欧美杨（Populus deltoids × P. euramericana）品种南林895分别用作野生型（WT）对照和转化宿主。水稻植株在长日照条件下生长（16 h光照、30 °C，8 h黑暗、24 °C，光照强度3000 lx，相对湿度70%）。南林895在温室中生长，光暗周期为16 h光照和8 h黑暗，温度23 °C（光照强度3000 lx，相对湿度70%）。
【数据】树种：日本落叶松；种子来源：辽宁大孤家种子园（42°22′N，124°51′E）；水稻品种：日本晴；杨树品种：南林895；水稻光照：16h光/30°C，8h暗/24°C；光照强度：3000 lx；相对湿度：70%；杨树温度：23°C
2.2 落叶松和水稻原生质体分离与转化
水稻原生质体瞬时转化方案参照已发表方法（Hiei et al., 1994; Tang et al., 2017; Ren et al., 2021; Zhong et al., 2023）。消毒后的水稻种子在固体1/2浓度Murashige and Skoog（1/2 MS）培养基上、28 °C黑暗条件下萌发10天。健康叶片切成0.5–1.0 mm的细条，浸入酶解液中，真空渗透30 min。消毒后的落叶松种子纵向切开，在MS培养基上、26 °C黑暗条件下培养14天以诱导愈伤组织形成。收集60–100粒种子的愈伤组织（约1 g），转移至含1.5%纤维素酶R-10和0.4%离析酶R-10的酶解液中，水解6 h以分离原生质体。酶解液经筛网过滤后转移至空离心管中，用W5缓冲液（0.43 g·L⁻¹ MES，0.37 g·L⁻¹ KCl，8.99 g·L⁻¹ NaCl，18.38 g·L⁻¹ CaCl₂·H₂O，0.90 g·L⁻¹ D-葡萄糖，pH 5.8）洗涤，60×g离心5 min。吸去上清液，重复上述步骤。随后加入5 mL W5缓冲液进行细胞计数，在5 mL W5缓冲液中获得约1×10⁶个细胞。最终原生质体密度调整为1×10⁶个原生质体·mL⁻¹。原生质体转化过程中使用40% PEG4000，30 μg质粒DNA转化200 μL原生质体（每反应200 μL原生质体，细胞数为2×10⁵），体积为30 μL。一个反应完成后，均匀铺在12孔板上，密封，25 °C黑暗孵育48 h，用荧光显微镜检查。
【数据】水稻萌发：1/2 MS培养基、28°C、黑暗、10天；叶片切片：0.5–1.0 mm；真空渗透：30 min；落叶松愈伤诱导：MS培养基、26°C、黑暗、14天；愈伤组织量：约1 g（60–100粒种子）；酶解液：1.5%纤维素酶R-10 + 0.4%离析酶R-10；水解时间：6 h；W5缓冲液配方：0.43 g·L⁻¹ MES、0.37 g·L⁻¹ KCl、8.99 g·L⁻¹ NaCl、18.38 g·L⁻¹ CaCl₂·H₂O、0.90 g·L⁻¹ D-葡萄糖、pH 5.8；离心力：60×g；离心时间：5 min；原生质体密度：1×10⁶个·mL⁻¹；PEG4000浓度：40%；质粒DNA量：30 μg；原生质体体积：200 μL；细胞数：2×10⁵/反应；孵育条件：25°C、黑暗、48 h
2.3 落叶松内源启动子的预测与挖掘
研究者此前在日本落叶松中进行了基因组和转录组测序（未发表数据）。转录组和基因组测序分别使用14天诱导的落叶松种子愈伤组织6 g和42天龄落叶松幼苗针叶6 g（n = 3）。测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。使用Wtdbg2软件（v2.4）组装落叶松基因组深度测序结果，获得基因组序列信息（Ruan and Li, 2020）。基于RNA测序（RNA-seq）结果，使用Trinity（v2.6.6）进行转录组分析，获得转录本及其表达量（Grabherr et al., 2011）。将组装后的转录本与SwissProt数据库比对，获得相应的蛋白编码基因信息。基于转录本所在染色体、转录本完整性、针叶和愈伤组织中的基因表达水平、基因与蛋白质起始和终止位点的比对以及蛋白质功能信息，共获得819个转录本。筛选出在愈伤组织和针叶组织中基因表达量高的转录本（表S1）。提取这些转录本转录起始位点上游2000 bp序列作为候选内源启动子，并使用PlantCARE预测这些候选启动子的顺式作用元件（Rombauts et al., 1999）（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。
【数据】愈伤组织量：6 g（14天诱导种子）；针叶量：6 g（42天龄幼苗）；生物学重复：n = 3；组装软件：Wtdbg2 v2.4；转录组软件：Trinity v2.6.6；获得转录本数：819个；启动子序列长度：2000 bp；顺式元件预测工具：PlantCARE
2.4 载体构建
使用特异性引物（表S2）扩增约2000 bp的候选启动子片段，引物带有与pGEL100骨架连接的同源臂，pGEL100是一种由ZmUbi启动子驱动GFP::GUS::Hyg盒的报道载体。PCR产物通过Gibson Assembly克隆到经AvrII和PstI酶切的pGEL100骨架中。序列正确的载体根据启动子编号命名为pLarPE001、pLarPE002、pLarPE003等。为分析启动子调控元件并优化启动子活性，克隆了LarPE004启动子的两个5′截短片段，命名为LarPE004-1和LarPE004-2，分别缩短了510 bp和1160 bp。目标片段PCR扩增引物见表S2。CaMV35S启动子和ZmUbi1启动子作为阳性对照，以相同方式克隆到pGEL100骨架中。基于转录单元类型、启动子元件和Cas9蛋白，设计了五类CRISPR/Cas9系统载体用于落叶松基因组编辑（表S3–S6）。LarPE004::TTU-Cas9载体基于CRISPR-Cas9双转录单元（TTU-Cas9，pGEL026）构建（Tang et al., 2016）。CaMV 35S::STU-Cas9（pGEL1032）、ZmUbi1::STU-Cas9（pGEL031）（Tang et al., 2019）、LarPE004::STU-Cas9（pGEL1031）和LarPE004::STU-SpRY（pGEL126）载体（Ren et al., 2021）基于CRISPR-Cas9单转录单元（STU-Cas9，pGEL031）构建。对不同单基因编辑sgRNA进行引物退火，ccdB元件用BsaI进一步酶切，靶向特定基因位点的sgRNA序列用T4 DNA连接酶克隆到骨架中。采用Golden Gate组装策略构建多基因编辑载体。使用特异性引物扩增不同sgRNA片段。纯化产物后，采用Golden Gate策略将其与相应骨架组装，完成多基因编辑载体的构建。不同CRISPR/Cas9载体使用的所有特异性引物见表S7。
【数据】启动子片段长度：约2000 bp；载体骨架：pGEL100；酶切位点：AvrII和PstI；克隆方法：Gibson Assembly；截短片段：LarPE004-1（缩短510 bp）、LarPE004-2（缩短1160 bp）；TTU-Cas9载体：pGEL026；STU-Cas9载体：pGEL031；CaMV 35S::STU-Cas9：pGEL1032；LarPE004::STU-Cas9：pGEL1031；LarPE004::STU-SpRY：pGEL126；sgRNA克隆：BsaI酶切 + T4 DNA连接酶；多基因组装：Golden Gate策略
2.5 水稻稳定转化与转基因植株检测
pLarPE004、pLarPE004-1和pLarPE004-2构建体通过冻融法导入农杆菌EHA105。农杆菌介导的水稻转化参照已发表方案（Hiei et al., 1994）。pLarPE004构建体转化到农杆菌GV3101中。随后，农杆菌介导的杨树转化参照此前描述的方法（Jia et al., 2010）。使用CTAB法提取水稻或杨树叶片的总基因组DNA。设计特异性引物鉴定转基因阳性植株，引物列于表S8。
【数据】农杆菌菌株：EHA105（水稻）、GV3101（杨树）；转化方法：冻融法（农杆菌）、农杆菌介导转化；DNA提取方法：CTAB法
2.6 实时定量PCR（qRT-PCR）
使用EasyPure植物RNA试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）提取转基因水稻植株的总RNA。使用HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）反转录cDNA，进行两步法实时定量PCR。qPCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。所有样品以参考基因OsActin归一化，最终相对表达量使用公式F = 2−ΔΔCt计算。qPCR特异性引物列于表S8。
【数据】RNA提取试剂盒：EasyPure植物RNA试剂盒（诺唯赞）；反转录试剂盒：HiScript III RT SuperMix for qPCR（诺唯赞）；qPCR试剂：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞）；内参基因：OsActin；计算方法：F = 2−ΔΔCt
2.7 GUS染色
GUS染色使用北京索莱宝GUS染色液。将适量X-Gluc Solution（50×）与GUS Buffer按1:50比例混合配制X-Gluc染色液。随后，将足量GUS染色液施加于组织上，确保完全浸没。样品在37 °C孵育1–24 h。为去除叶绿素，样品经[原文此处截断]
【数据】染色液：北京索莱宝GUS染色液；X-Gluc Solution（50×）与GUS Buffer比例：1:50；孵育温度：37°C；孵育时间：1–24 h
研究结果
3.1 建立落叶松高效原生质体瞬时表达系统
本研究使用落叶松愈伤组织进行原生质体分离（图1，A）。为建立稳定高效的落叶松原生质体分离和瞬时表达系统，对酶浓度比例、酶解时间、甘露醇浓度、离心速度和PEG4000浓度等重要参数进行了优化和确定。当酶解液中纤维素酶R-10浓度从1.5%增加到3.0%、离析酶R-10从0.4%增加到0.8%时，原生质体密度显著增加，但原生质体活性保持不变（图1，B）。当纤维素酶和离析酶浓度比分别为1.5%和0.4%时，制备的原生质体数量满足实验需求。出于经济考虑，确定该浓度为适宜酶浓度。随着酶解时间从1 h增加到6 h，原生质体密度逐渐增加，而原生质体活性保持在80%–90%之间（图1，C）。基于这些结果，确定分离落叶松原生质体的最佳酶解时间为6 h。为确定原生质体释放情况，在酶解液中评估了四种甘露醇浓度，0.4 mol·L⁻¹甘露醇产生最高的原生质体密度和活性（图1，D）。当使用60×g离心力收集原生质体时，显微镜观察显示上清液中残留的原生质体数量与90×g离心后几乎相同，而更高的离心力导致静止收集。在原生质体质量方面，60×g优于90×g离心，且不弱于静止沉淀收集的原生质体（图S1）。因此，收集落叶松原生质体时使用60×g的离心转速。转化效率随PEG4000浓度（5%–25%）增加先升高后降低。当PEG4000浓度为20%时，转化效率最高，约为40%（图1，E）。总之，20%为最佳PEG4000浓度。通过优化落叶松原生质体的分离和瞬时表达条件，原生质体瞬时转化后近90%的原生质体具有良好的活性（图1，F），转化效率达到40%（图1，G）。这些实验结果表明，落叶松原生质体的瞬时表达系统得到了有效优化。优化后的落叶松原生质体制备使用愈伤组织，酶解6 h。含0.4 mol·L⁻¹甘露醇、1.5%纤维素酶和0.4%离析酶的酶混合物可获得足够的原生质体且具有成本效益，以60×g收集。转化时，20% PEG4000可实现40%的效率。近90%的原生质体保持活性，为落叶松瞬时转化和基因编辑奠定了基础（图1，H）。
【数据】纤维素酶R-10浓度范围：1.5%–3.0%；离析酶R-10浓度范围：0.4%–0.8%；最佳酶浓度：1.5%纤维素酶 + 0.4%离析酶；酶解时间范围：1–6 h；最佳酶解时间：6 h；原生质体活性：80%–90%；甘露醇最佳浓度：0.4 mol·L⁻¹；离心力：60×g（优于90×g）；PEG4000浓度范围：5%–25%；最佳PEG4000浓度：20%；转化效率：约40%；转化后原生质体活性：近90%
3.2 落叶松高活性内源启动子的挖掘与鉴定
基因组-转录组测序的初步比较分析（未发表数据）共鉴定出819个在愈伤组织和针叶中均高表达的转录本。进一步筛选出41个含有转录起始位点（TSS）上游完整序列信息的转录本（图S2，A；表S1）。每个转录本TSS上游2000 bp序列被分离为候选启动子元件（LarPE）。启动子调控元件分析显示，41个候选启动子含有大量参与转录调控的顺式作用元件（图S2，B）。这些结果为落叶松内源启动子特定功能的研究提供了重要参考。为验证候选启动子的转录活性，构建了不同候选启动子同时驱动绿色荧光蛋白（GFP）、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）和潮霉素（Hyg）表达的载体（图2，A）。经克隆、组装和测序后，获得41个载体（以ZmUbi1和CaMV 35S启动子作为阳性对照）。使用已建立的瞬时原生质体表达系统检测41个候选启动子的转录活性。6个候选启动子成功驱动落叶松原生质体中GFP表达：LarPE004、LarPE005、LarPE051、LarPE055、LarPE057和LarPE058（图2，B）。LarPE004转录活性最高，显著高于ZmUbi1和CaMV35S启动子。LarPE051转录活性中等，在落叶松细胞中略低于ZmUbi1启动子（图2，B）。进一步研究了全长LarPE004启动子及其两个截短片段LarPE004-1和LarPE004-2在落叶松原生质体、水稻原生质体和植株中的表达模式。阳性对照（ZmUbi1和CaMV35S启动子）和阴性对照（未转化原生质体或植株）用于研究原生质体和稳定转化。在原生质体细胞中，LarPE004、LarPE004-1和LarPE004-2成功驱动GFP蛋白在落叶松和水稻中的转录表达。LarPE004和LarPE004-1在落叶松细胞中表现出高于两个阳性对照的表达活性（图2，C）。在水稻细胞中，LarPE004启动子活性显著低于ZmUbi1启动子活性，与CaMV35S启动子活性相似（图2，D）。在水稻植株中，LarPE004、LarPE004-1和LarPE004-2启动子片段驱动GFP和GUS在水稻根和叶中表达，LarPE004和LarPE004-1的表达活性显著高于CaMV35S启动子（图2，E）。研究者还检测了LarPE004启动子在杨树中的表达活性。LarPE004启动子驱动GUS基因在杨树根、茎和叶中高水平表达（图S3）。这些结果进一步表明，LarPE004启动子是一个物种通用的高活性组成型启动子，在植物基因组工程中具有巨大的应用潜力。
【数据】高表达转录本数：819个；筛选候选启动子数：41个；启动子序列长度：2000 bp；成功驱动GFP表达的候选启动子：6个（LarPE004、LarPE005、LarPE051、LarPE055、LarPE057、LarPE058）；LarPE004活性：显著高于ZmUbi1和CaMV35S；截短片段：LarPE004-1（缩短510 bp）、LarPE004-2（缩短1160 bp）；水稻中LarPE004活性：低于ZmUbi1、与CaMV35S相似；水稻植株中LarPE004和LarPE004-1活性：显著高于CaMV35S；杨树中LarPE004：驱动GUS在根、茎、叶高水平表达
3.3 不同表达系统基因编辑效率比较
研究者利用LarPE004启动子驱动的STU-Cas9（pGEL1031）和TTU-Cas9（pGEL1033）在落叶松中开发了基因组编辑骨架LarPE004::STU-Cas9和LarPE004::TTU-Cas9（图3，A）。为验证CRISPR/Cas基因编辑系统的效果，选择蛋白编码基因和非编码miRNA基因（表S3）作为靶标，在落叶松原生质体中评价基因编辑效率。构建了基于LarPE004::STU-Cas9和LarPE004::TTU-Cas9的若干载体用于单基因敲除。此前报道的CaMV35S和ZmUbi1启动子驱动的STU-Cas9系统用作阳性对照（Tang et al., 2016, 2017），未转化原生质体用作阴性对照。落叶松原生质体中扩增子的高通量测序显示，对于LarPE004::STU-Cas9和LarPE004::TTU-Cas9系统，LarbHLH03-sgRNA01位点的基因编辑效率分别为8%和1.9%，LarCKX01-sgRNA01位点分别为1.5%和0.7%（图3，B；表S4）。两个阳性对照系统在不同位点的基因编辑效率显著低于LarPE004::STU-Cas9系统（图3，C）。LarPE004::STU-Cas9系统在这两个位点的基因组编辑效率优于LarPE004::TTU-Cas9、CaMV 35S::STU-Cas9和ZmUbi1::STU-Cas9在落叶松细胞中的表现。因此，LarPE004驱动的STU-Cas9系统应用于落叶松靶基因编辑。
【数据】编辑系统：LarPE004::STU-Cas9（pGEL1031）、LarPE004::TTU-Cas9（pGEL1033）；靶基因：LarbHLH03、LarCKX01；LarbHLH03-sgRNA01位点编辑效率：STU-Cas9为8%，TTU-Cas9为1.9%；LarCKX01-sgRNA01位点编辑效率：STU-Cas9为1.5%，TTU-Cas9为0.7%；阳性对照（CaMV35S::STU-Cas9、ZmUbi1::STU-Cas9）：显著低于LarPE004::STU-Cas9
3.4 基于不同启动子的STU-Cas9系统多基因编辑比较
为确定STU-Cas9系统在落叶松中是否具有多基因编辑活性，选取四个靶位点，即LarbHLH03[原文此处截断]
【数据】靶位点数：4个；靶基因：LarbHLH03（原文截断，其余靶位点原文未详述）
3.5 基于不同Cas9核酸酶的STU-Cas9系统基因编辑
[原文此处截断]
【数据】原文未详述
讨论与解读
过去十年，基于CRISPR/Cas的基因组编辑已广泛用于多种植物的基因功能研究和分子育种，在其切割特性、编辑效率、物种特异性、遗传稳定性和应用范围等方面开展了全面深入的研究（Tang and Zhang, 2023）。然而，由于基础研究相对滞后和遗传操作（如基因转化）困难，基因组编辑在许多非模式林草植物中的应用仍然有限，如花卉、果树、蔬菜、林木、牧草和药用植物。植物的稳定遗传转化因再生耗时且困难而面临重大挑战，对落叶松等非模式物种尤为如此。因此，原生质体瞬时表达系统因其流程简单快速，已被广泛用于植物基因组编辑。本研究在日本落叶松中建立了高效的基于原生质体的瞬时表达系统，实现了高原生质体产量，活力超过90%，转染效率达40%。结合PCR扩增子的高通量测序，该系统成功检测了内源蛋白编码基因和非编码基因的基因编辑，并在落叶松多基因编辑评价中表现良好。制备和收集的原生质体的条件受多种因素影响，这些因素随后影响了[原文此处截断]。
编译者解读：该研究的核心策略是以原生质体瞬时体系替代稳定转化，绕开落叶松再生困难的瓶颈，这一思路对多数难转化的木本植物具有借鉴意义。LarPE004的筛选基于基因组-转录组联合分析，从819个高表达转录本中锁定41个候选启动子，再经功能验证缩小到1个，路径清晰但通量有限。STU-Cas9在编辑效率上优于TTU-Cas9和常规强启动子，提示转录单元结构对编辑活性的影响可能不亚于启动子强度本身。局限在于编辑效率绝对值仍偏低（最高8%），且多基因编辑数据在节选中不完整，SpRY变体的PAM兼容性优势有待全文数据支撑。
参考来源
期刊：Horticultural Plant Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.hpj.2025.02.020
DOI: 10.1016/j.hpj.2025.02.020