来源：Impact of fermentation containers and Bacillus subtilis BCB-19 starter culture on the microbial, sensory, and textural quality of Hawaijar（Food and Humanity）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
Hawaijar是印度东北部曼尼普尔邦梅泰族传统碱性发酵大豆食品，长期以来依赖香蕉叶包裹的自然发酵，工艺粗放、品质不稳定。本研究系统比较了香蕉叶、玻璃和不锈钢三种发酵容器对Hawaijar微生物群落及理化品质的影响，并从不锈钢发酵样品中分离出一株本土枯草芽孢杆菌BCB-19作为发酵剂。结果表明，不锈钢容器支持更高的有益芽孢杆菌丰度并显著提升粗蛋白和粗脂肪含量；接种BCB-19后，产品在第5天即达到理想质构，硬度和咀嚼性降低，感官评分和色泽品质均优于自然发酵。该研究为传统发酵大豆食品的标准化和商业化提供了可规模化的技术路径。
研究背景
大豆（Glycine max）原产于东亚，营养密集，长期食用与降低心血管疾病、2型糖尿病、癌症和神经退行性疾病风险相关。在亚洲饮食文化中，大豆主要以发酵形式消费，包括酱油、味噌、天贝、纳豆和腐乳等，发酵可改善消化率、增强感官品质并提高营养价值。
Hawaijar是印度曼尼普尔邦梅泰族社区的传统碱性发酵大豆产品，以黏性质地、氨味香气和浓郁鲜味为特征。传统制法为：大豆煮沸后包裹于香蕉叶或无花果叶中，叠放于竹篮内，以稻壳或稻草保温，发酵3–5天。发酵主要由芽孢杆菌属驱动，但受大豆品种、包裹材料、发酵环境和本土微生物群差异影响，过程高度不稳定。与kinema等其他东南亚发酵大豆食品相比，Hawaijar的微生物生态和工艺优化研究仍相对薄弱。已有研究表明包裹材料可能不会大幅改变核心微生物群落，但容器类型可通过改变微环境和系统稳定性来影响发酵行为——这一因素在热导率、保湿性和气体交换调控方面的意义尚未得到充分关注。
研究方法
2 材料与方法
本研究所用大豆种子购自印度曼尼普尔邦当地市场。化学试剂和生化试剂盒购自HiMedia Laboratories（印度孟买）。
#### 2.1 不同发酵容器中Hawaijar的制备
Hawaijar的制备从过夜浸泡和发酵开始。人工清理干净的大豆籽粒在37 °C下过夜浸泡，然后在100 °C下蒸煮2小时或直至变软。弃去残余水分后，将蒸煮后的大豆冷却至约40 °C。为进行实验评估，将冷却后的大豆分成三等份：(i) 包裹于无菌香蕉叶中并置于竹篮内；(ii) 转移至灭菌不锈钢容器中；(iii) 转移至灭菌玻璃容器中。随后所有样品在37 °C下培养5–6天，以在受控条件下进行自发发酵（Tamang et al., 2016）。为确保处理间可比性，所有容器系统均使用同一批次大豆制备，并保持相同的浸泡、蒸煮、冷却、发酵温度和培养时间条件。唯一预设的实验变量为发酵环境：香蕉叶包裹、不锈钢容器或玻璃容器。每个处理制备三个独立发酵批次，从每个批次中无菌采集样品用于后续微生物学和理化分析。
【数据】浸泡温度：37 °C；蒸煮温度：100 °C；蒸煮时间：2 h；冷却温度：约40 °C；发酵温度：37 °C；发酵时间：5–6 d；分批：每处理3个独立批次
#### 2.2 Hawaijar样品中微生物的微生物学表征
用于微生物计数时，从生大豆和浸泡大豆、浸泡用反渗透水、香蕉叶以及发酵Hawaijar（香蕉叶、不锈钢和玻璃容器发酵）中无菌采集1 g样品。每个样品在10 mL无菌0.85%生理盐水中匀质化。制备连续十倍稀释至10⁻⁸。从适当稀释度中取0.1 mL等分试样，以双份涂布于营养琼脂（NA）用于细菌分离、De Man, Rogosa and Sharpe琼脂（MRS）用于乳酸菌（LAB）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）用于酵母和霉菌、平板计数琼脂（PCA）用于总活菌计数（TVC）。NA、MRS和PCA平板在37 °C下培养，PDA平板在28 °C下培养24–48小时。随后，从NA上挑取菌落悬浮于生理盐水中，在水浴中于80 °C放置10分钟以分离产芽孢细菌。选择菌落数在可计数范围内的平板进行计数，每个稀释度的双份平板取平均值后转换为log₁₀ CFU/g。培养依赖法用于比较各处理间的广泛发酵微生物类群；但本研究并非设计为全面的病原菌监测。通过连续划线纯化不同菌落形态型，并保存在4 °C琼脂斜面上。纯化分离株在40倍放大下用显微镜（Stereozen Microscope; Biovis BA310, Motic, Canada）检查。形态多样的分离株使用HiMedia KB013试剂盒进行生化鉴定，评估丙二酸利用、Voges-Proskauer反应、柠檬酸利用、ONPG水解、硝酸盐还原、过氧化氢酶活性和碳水化合物发酵。
【数据】样品量：1 g；生理盐水浓度：0.85%；稀释度：至10⁻⁸；涂布量：0.1 mL；NA/MRS/PCA培养温度：37 °C；PDA培养温度：28 °C；培养时间：24–48 h；水浴温度：80 °C；水浴时间：10 min；显微镜放大倍数：40×
#### 2.3 Hawaijar样品中微生物的分子表征
用于分子鉴定时，选定的细菌分离株送至Eurofins全球中心实验室（班加罗尔）。从纯菌落中提取基因组DNA，并在1.0%琼脂糖凝胶上分析。使用通用引物27F和1492R通过PCR扩增16S rRNA基因，获得约1500 bp的扩增子。纯化后的PCR产物使用BDT v3.1循环测序试剂盒在ABI 3730xl分析仪上进行双向测序。正向和反向读长组装为一致序列，并使用BLAST对NCBI GenBank进行分析以进行分类鉴定。高一致性分离株被注释，其16S rRNA序列提交获取登录号。因此，微生物数据应解释为发酵相关微生物动态的证据，而非完整的食品安全验证。大肠杆菌、沙门氏菌属、金黄色葡萄球菌、产毒蜡样芽孢杆菌群菌株和产生物胺微生物的靶向检测不在本研究范围内。
【数据】琼脂糖凝胶浓度：1.0%；引物：27F和1492R；扩增子大小：约1500 bp；测序平台：ABI 3730xl；测序试剂盒：BDT v3.1
#### 2.4 近似成分分析
对生大豆种子、浸泡种子、蒸煮种子以及在锈钢容器、玻璃容器和香蕉叶中发酵的Hawaijar样品，测定近似成分，包括水分含量（烘箱干燥法）、粗蛋白（以氮×6.25计算）、粗脂肪和灰分含量（AOAC, 2023）。
【数据】粗蛋白换算系数：氮×6.25；检测方法：AOAC (2023)；检测指标：水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分
#### 2.5 使用发酵剂制备Hawaijar
通过综合形态学、生化和分子分析鉴定的一株微生物分离株被选为发酵剂以启动受控Hawaijar发酵。所选菌株在100 mL NA肉汤中培养，30 °C下孵育24小时。当光密度（OD₆₀₀）达到约0.4时，表明细菌种群密度约为10⁷ CFU/mL，培养物被认为适合接种（Huidrom et al., 2024）。随后，在无菌条件下将500 g新鲜蒸煮并冷却的大豆接种制备好的枯草芽孢杆菌BCB-19发酵剂培养物。另一批次通过将蒸煮大豆包裹于香蕉叶中制备，允许自然发酵，不添加发酵剂。两批次均进行静态发酵，在37 °C下孵育5–6天。在本研究中，受控发酵指在灭菌不锈钢系统中接种所选本土枯草芽孢杆菌BCB-19培养物，而自然发酵指由固有和环境微生物群驱动的未接种香蕉叶发酵。在发酵第4、5和6天进行感官评价和质构剖面分析（TPA），以监测品质变化并确定最佳发酵时长。
【数据】发酵剂培养体积：100 mL NA肉汤；培养温度：30 °C；培养时间：24 h；OD₆₀₀：约0.4；菌密度：约10⁷ CFU/mL；大豆用量：500 g；发酵温度：37 °C；发酵时间：5–6 d；检测时间点：第4、5、6天
#### 2.6 Hawaijar的质构特性
在不锈钢容器和香蕉叶中发酵的Hawaijar样品于发酵第4、5和6天使用HD Plus质构分析仪（Stable Microsystems, Godalming, UK）进行TPA，参照Kavya et al. (2025)所述方案。在本研究中，弹性（springiness）报告为质构分析仪软件生成的弹性距离，因此以毫米表示。这不应解释为常规的无量纲弹性比值。硬度、胶黏性和咀嚼性以牛顿表示，黏附性以N·s表示，内聚性和回弹性为无量纲参数。
【数据】仪器：HD Plus质构分析仪（Stable Microsystems, Godalming, UK）；检测时间点：第4、5、6天；弹性单位：mm；硬度/胶黏性/咀嚼性单位：N；黏附性单位：N·s；内聚性/回弹性：无量纲
#### 2.7 Hawaijar的感官特性
在受控（不锈钢容器）和传统（香蕉叶）发酵条件下生产的Hawaijar样品于发酵第4、5和6天进行感官评价，参照Goswami et al. (2015)的方法并稍作修改。评价设计为基于属性的享乐可接受性测试，而非完整的描述性感官剖面分析或定量描述分析（QDA）。招募了20名熟悉Hawaijar的半培训评价员（年龄25–50岁）。评价前，评价员接受导向培训，以对关键感官属性建立共识，包括气味、滋味、黏滑感（质构）和色泽。不同发酵时间（第4、5、6天）和加工条件的样品用随机三位数字编码，并以随机顺序呈现以最小化偏差。感官评价使用九点享乐
【数据】评价员人数：20人；年龄范围：25–50岁；评价时间点：第4、5、6天；评分方法：九点享乐标度；样品编码：随机三位数字
研究结果
3 结果与讨论
#### 3.1 不同发酵容器中Hawaijar的制备
Hawaijar是一种传统碱性发酵大豆产品，因其黏性质地和浓郁鲜味而受重视，通常由曼尼普尔邦各少数民族社区使用本土黄色和深棕色大豆品种生产（Das et al., 2023）。发酵主要由芽孢杆菌属驱动；然而，由于大豆类型、包裹材料、发酵环境和本土微生物群的差异，该过程仍然高度不稳定（Das et al., 2023）。与kinema等其他东南亚发酵大豆食品相比，Hawaijar的研究仍相对不足，尤其是在微生物生态学和工艺优化方面（Das et al., 2023），见图1。在本研究中，发酵容器材料的作用被作为影响微生物演替和产品品质的关键决定因素加以考察——尽管其在调节容器热导率、保湿性和气体交换方面具有重要意义，但这一方面此前受到的关注有限。虽然先前报道表明包裹材料可能不会大幅改变核心微生物群落（Ren et al., 2023），但容器类型可通过改变微环境和系统稳定性来塑造发酵行为。为评估这一影响，发酵在两种常用于受控发酵的惰性容器中进行：不锈钢和玻璃。不锈钢因其卫生表面、耐久性和适用于工业规模食品发酵而被广泛认可，能够有效控制温度、pH和卫生条件（Pablo, 2023）。相比之下，玻璃具有化学惰性和实时视觉监测的实用优势。此外，在受控发酵中，它有助于为特定发酵剂培养物提供有利的氧气浓度（Stora and Stmad 2023）。培养依赖的微生物谱分析显示，两种容器类型在整个发酵过程中均支持以芽孢杆菌为主的生态系统，与先前关于发酵大豆产品的研究一致。然而，在微生物丰度和产品特征方面观察到可测量的差异。不锈钢发酵产生了更有利的产芽孢芽孢杆菌种群，表明其封闭、热稳定的环境可能促进有益发酵细菌的生长和代谢活性。这种增强的微生物性能反映在不锈钢发酵样品中观察到的改善的近似成分上，特别是相对于玻璃容器或传统香蕉叶包裹所生产的产品，粗蛋白和脂肪水平升高。这些结果突显了容器材料微妙影响微生物代谢并因此调节营养结果的能力。总体而言，这些发现表明不锈钢容器为Hawaijar发酵提供了更稳定和卫生的环境，导致改善的微生物动态和一致的理化属性。这些优势使不锈钢成为将Hawaijar生产扩展到传统家庭环境之外的有前景的候选材料。纳入基于容器的受控发酵符合未来食品系统的更广泛目标，即实现标准化加工、降低与自发发酵相关的安全风险，并支持具有文化根基的发酵食品的商业扩展（Jevcsák et al., 2026）。
【数据】发酵容器：不锈钢、玻璃、香蕉叶；不锈钢发酵粗蛋白和粗脂肪含量：高于玻璃和香蕉叶（原文未给出具体数值）；发酵时间：5–6 d
#### 3.2 Hawaijar中微生物的微生物学和分子表征
Hawaijar加工和发酵过程中的微生物谱分析揭示了生大豆、浸泡、蒸煮和发酵阶段微生物种群的明显变化。根据Chessa et al. (2023)，发酵剂培养物应易于培养，以确保适当的操作、维护和一致的工艺控制，这对于可重复发酵至关重要。产芽孢细菌、酵母、LAB和TVC的选择性计数显示了统计学显著差异（p ≤ 0.05）（表1）。产芽孢细菌范围为6.60至7.88 log₁₀ CFU/g，其中浸泡大豆显示最高的发酵前负荷（6.57 log₁₀ CFU/g）。蒸煮后观察到的减少与营养细胞和热敏感芽孢的热灭活一致（Singh et al., 2023），而耐热芽孢的持续存在支持了其在启动碱性大豆发酵中已被充分记录的作用（Kim & Mah, 2025）。发酵后，不锈钢容器产生最高的产芽孢菌计数（7.88 log₁₀ CFU/g），与香蕉叶发酵（7.80）接近，超过玻璃发酵样品（6.60），再次证实了产芽孢芽孢杆菌属在碱性发酵大豆产品中的优势地位（Kim & Mah, 2025）。酵母在生大豆中未检出，但在浸泡后出现，可能是由于水合作用增加和营养可及性增强，从而实现了代谢激活（Riyanto et al., 2024）。其最高丰度出现在不锈钢和香蕉叶发酵中（约4.48–4.49 log₁₀ CFU/g），而玻璃容器中较低（3.54 log₁₀ CFU/g），表明容器依赖的保湿性和通气性差异。类似的容器依赖性酵母定殖变化已在酸菜发酵中被记录（Satora & Strnad, 2024）。LAB在生大豆和浸泡水样品中不存在，在浸泡和蒸煮后出现，并在发酵过程中持续增加。不锈钢发酵支持最高的LAB负荷（5.62 log₁₀ CFU/g），超过玻璃容器（4.67），与香蕉叶发酵（5.58）相当。这些观察结果与先前研究一致，强调LAB作为发酵大豆产品中风味开发、安全性增强和微生物平衡的机会性但有益的贡献者（Kharnaior & Tamang, 2023）。TVC模式进一步说明了容器对微生物增殖的影响。虽然浸泡大豆表现出最高的发酵前负荷（4.61 log₁₀ CFU/g），但不锈钢和香蕉叶系统的发酵样品显示出相似且升高的TVC值（5.79–5.78 log₁₀ CFU/g），玻璃再次显示相对较低的微生物密度（4.76）。这些结果表明，不锈钢容器可以复制香蕉叶的发酵性能，同时提供比传统容器更好的卫生、一致性和工艺控制。为表征优势微生物种类，基于形态和菌落差异选择了六株分离株。所有分离株均表现出典型的芽孢杆菌属粗糙、不透明菌落，除了一株革兰氏阴性分离株（表2）。生化表征和16S rRNA基因测序确认了枯草芽孢杆菌BCB-19、解淀粉芽孢杆菌Gor1、贝莱斯芽孢杆菌YL2021、枯草芽孢杆菌BRZ6、肠杆菌属CG3和枯草芽孢杆菌LG4的身份。这些物种以产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、抗菌肽和胞外聚合物而闻名，这些是碱性大豆发酵生化转化所必需的（Li et al., 2023）。枯草芽孢杆菌在不同容器类型中的优势与先前报道的Hawaijar、bekang、akhone和其他传统发酵大豆产品的微生物谱一致（Anand Singh et al., 2023; Das et al., 2023）。这一解释进一步得到近期关于大豆发酵和发酵剂技术的综述的支持，这些综述强调受控接种可以改善发酵大豆系统中的微生物可重复性、产品一致性和工艺安全性（Elhalis et al., 2024; Gänzle et al., 2024）。尽管酵母可能参与发酵，但
【数据】产芽孢细菌范围：6.60–7.88 log₁₀ CFU/g；浸泡大豆产芽孢菌：6.57 log₁₀ CFU/g；不锈钢产芽孢菌：7.88 log₁₀ CFU/g；香蕉叶产芽孢菌：7.80 log₁₀ CFU/g；玻璃产芽孢菌：6.60 log₁₀ CFU/g；不锈钢/香蕉叶酵母：约4.48–4.49 log₁₀ CFU/g；玻璃酵母：3.54 log₁₀ CFU/g；不锈钢LAB：5.62 log₁₀ CFU/g；玻璃LAB：4.67 log₁₀ CFU/g；香蕉叶LAB：5.58 log₁₀ CFU/g；浸泡大豆TVC：4.61 log₁₀ CFU/g；不锈钢/香蕉叶TVC：5.79–5.78 log₁₀ CFU/g；玻璃TVC：4.76 log₁₀ CFU/g；显著性：p ≤ 0.05；分离株数：6株
讨论与解读
本研究通过将卫生不锈钢发酵与靶向枯草芽孢杆菌BCB-19发酵剂相结合，建立了一条科学稳健的Hawaijar生产现代化路径。不锈钢容器促进了有利的微生物动态并改善了营养属性，而明确的发酵剂培养物在质构、感官品质和整体产品可接受性方面提供了持续增强。这些干预措施共同改善了自发香蕉叶发酵固有的工艺控制，并在缩短的发酵周期内实现可重复的产品。在不锈钢系统中，发酵剂介导的发酵产生了硬度、咀嚼性和内聚性降低的Hawaijar，在第5天达到理想质构。感官评分和色泽属性进一步表明发酵剂培养物带来了更优的产品品质。机械化不锈钢系统的开发已获得印度专利（申请号：202511041218），进一步证明了将Hawaijar生产扩展至商业市场的可行性。未来研究应关注工艺放大、基于代谢组学的最终产品表征以及详细的食品安全评估，包括靶向病原菌筛查和产毒蜡样芽孢杆菌群的评价。
编译者解读：该研究将传统发酵食品从"经验依赖"推向"参数可控"，核心策略并不复杂——换容器、加一株本土发酵剂——但效果明确。不锈钢容器兼顾卫生与热稳定性，BCB-19作为同源发酵剂规避了外源菌株的法规与风味风险，这是合成生物学"就地改造"思路在传统食品中的典型应用。局限在于：微生物数据基于培养依赖法，未做全基因组或代谢组深度解析；感官评价为半培训 panel，规模有限。若要真正落地商业化，菌株遗传稳定性、规模化发酵的传质传热均匀性以及全程食品安全指标仍需系统验证。
参考来源
期刊：Food and Humanity, 2026
DOI: 10.1016/j.foohum.2026.101347
DOI: 10.1016/j.foohum.2026.101347