来源：Heterologous expression of Xanthophyllomyces dendrorhous crtS/crtR in Escherichia coli for preliminary astaxanthin formation（Protein Expression and Purification）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虾青素是水产养殖与保健品领域的高价值酮基类胡萝卜素。工程菌合成虾青素通常依赖细菌来源的CrtW/CrtZ酶，而酵母P450型CrtS/CrtR模块在大肠杆菌中的功能重建报道较少。本研究将Xanthophyllomyces dendrorhous的crtS与crtR导入pBR322衍生载体，与pAC-BETAipi在大肠杆菌DH5α中共表达，通过HPLC检测到虾青素相关目标峰，并筛选出麦芽糖为最优碳源、标称C/N比6:1时产物选择性达73.8%。
研究背景
虾青素是一种酮基类胡萝卜素，其共轭多烯骨架及两端环上的羟基和酮基赋予其清除自由基、淬灭单线态氧的能力。凭借抗氧化、抗炎和氧化应激调节等活性，虾青素在水产养殖、动物饲料、功能食品、营养品和化妆品领域受到持续关注。在水产养殖中，它是鲑鳟鱼、虾和蟹的重要着色化合物；在健康相关应用中，其天然来源、立体化学组成、稳定性和安全性是重要考量。随着天然色素和清洁标签产品需求增长，稳健、可控且经济可行的虾青素生产体系仍有价值。目前虾青素主要依赖化学合成、微藻提取和微生物发酵。化学合成成熟且成本较低，但产物通常是异构体混合物，限制了其在部分食品和营养品中的应用。雨生红球藻等微藻可在胁迫条件下积累高水平虾青素，但生产需要长周期培养、光照控制、营养调控、胁迫诱导和细胞破碎，总体成本较高。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
大肠杆菌DH5α用作克隆和表达宿主。pAC-BETAipi质粒（9259 bp；Addgene #53277）用于提供上游β-胡萝卜素途径，携带crtE、crtB、crtI、crtY和idi。X. dendrorhous PR2为实验室保藏菌株，用作crtS和crtR的模板来源。本研究所用crtS和crtR序列分别对应GenBank登录号JQ342973.1和LN554260.1。pBR322衍生构建体pCrtS（5045 bp）和pCrtS-CrtR（7479 bp）携带氨苄青霉素抗性，由基础lac启动子表达。总RNA用Trizol试剂（Sangon Biotech，B511311-0025）提取，反转录使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（Vazyme，R312-01），无缝克隆使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（Vazyme，C115）。β-胡萝卜素标准品（B21973）和虾青素标准品（B45743）购自上海源叶生物科技有限公司。本研究所用菌株和质粒列于表1。
【数据】菌株：E. coli DH5α；质粒：pAC-BETAipi（9259 bp）、pCrtS（5045 bp）、pCrtS-CrtR（7479 bp）；抗生素：氨苄青霉素；启动子：基础lac启动子；试剂：Trizol（B511311-0025）、HiScript III RT SuperMix（R312-01）、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（C115）；标准品：β-胡萝卜素（B21973）、虾青素（B45743）
2.2 crtS/crtR的获取与扩增
收集对数期X. dendrorhous PR2细胞，8000 rpm离心2 min，用Trizol裂解。总RNA经氯仿抽提、异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤并溶于无RNase水。反转录前用gDNA wiper去除残留基因组DNA。第一链cDNA在37 °C合成45 min，85 °C终止5 s。cDNA立即用于PCR扩增或存于−20 °C。crtS和crtR片段从cDNA扩增，20 μL高保真PCR反应体系含10 μL高保真酶混合液、正反向引物各1 μL、2 μL cDNA，ddH2O补足至20 μL。crtS的循环条件为95 °C 5 min；30个循环的95 °C 30 s、58 °C 30 s、72 °C 76 s；随后72 °C 10 min。crtR使用相同程序，仅72 °C延伸步骤为141 s。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离并纯化。crtS的预期/观察大小约为1674/1674 bp，crtR约为2244/2247 bp。使用天然序列，未针对大肠杆菌进行密码子优化。引物序列列于表2。
【数据】菌株：X. dendrorhous PR2；离心：8000 rpm、2 min；反转录：37 °C、45 min，85 °C、5 s；PCR体系：20 μL（10 μL酶混合液、引物各1 μL、2 μL cDNA）；crtS循环：95 °C 5 min，30循环（95 °C 30 s、58 °C 30 s、72 °C 76 s），72 °C 10 min；crtR延伸：72 °C 141 s；片段大小：crtS 1674/1674 bp，crtR 2244/2247 bp；凝胶：1%琼脂糖
2.3 重组质粒与双质粒菌株的构建
下游表达质粒以pBR322为骨架构建。线性化载体（约50 ng）与纯化的crtS和/或crtR插入片段（各约50–100 ng）用5 μL ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit的2× CE Mix组装，50 °C孵育15 min。反应产物经42 °C 90 s热激导入化学感受态大肠杆菌DH5α。转化子在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂上37 °C过夜筛选，阳性菌落通过菌落PCR和限制性分析筛选。验证后的pCrtS或pCrtS-CrtR构建体随后与pAC-BETAipi共转化大肠杆菌DH5α，在含100 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的LB琼脂上筛选。pCrtS-CrtR通过全长测序验证，pCrtS通过PCR和限制性分析验证。为验证双质粒菌株中质粒共存，从相应共转化子提取的质粒制备物用SphI酶切。每个质粒含单个SphI位点，因此线性化预期产生对应pAC-BETAipi（9259 bp）及pCrtS（5045 bp）或pCrtS-CrtR（7479 bp）的条带。因此，双条带模式代表从同一双质粒菌株中回收的两个共存质粒，而非人工混合质粒样品的限制性酶切。
【数据】载体：pBR322；线性化载体：约50 ng；插入片段：各约50–100 ng；组装：5 μL 2× CE Mix、50 °C、15 min；热激：42 °C、90 s；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素、34 μg/mL氯霉素；筛选：37 °C过夜；验证酶：SphI；预期条带：9259 bp + 5045 bp（pAC-BETAipi + pCrtS）或9259 bp + 7479 bp（pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR）
2.4 摇瓶发酵与培养条件调整
从双抗生素平板挑取单菌落接种于含相应抗生素的LB培养基，过夜培养。随后以2%接种量转接至发酵培养基。发酵在250 mL摇瓶中进行，装液量10 mL，初始pH 7.0，30 °C、220 rpm、黑暗条件下培养96 h。未添加IPTG，表达主要依赖基础lac启动子活性。氨苄青霉素和氯霉素母液分别为100 mg/mL和34 mg/mL；培养基中终浓度分别为100 μg/mL和34 μg/mL。在96 h培养的前24 h内用Evolution 300紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific [China] Co., Ltd.）监测OD600以表征细胞生长。最终发酵培养基含9.3 g/L麦芽糖、9 g/L酵母提取物、2 g/L硫酸铵、2 g/L磷酸二氢钾、0.2 g/L氯化钙、0.5 g/L硫酸镁和0.6 g/L硫酸锰。初始碳源筛选中，麦芽糖、木糖、葡萄糖、α-乳糖和蔗糖各添加10 g/L。随后评估5、10、15、20和25 g/L的麦芽糖浓度。后续C/N实验中，标称C/N比操作定义为麦芽糖与硫酸铵的质量比。麦芽糖固定为10 g/L，硫酸铵调整为2.50、1.67和1.25 g/L以获得标称比4:1、6:1和8:1。三组中酵母提取物（9 g/L）及所有其他培养基组分保持恒定。
【数据】接种量：2%；摇瓶：250 mL、装液10 mL；pH：7.0；温度：30 °C；转速：220 rpm；时间：96 h；光照：黑暗；诱导剂：无IPTG；抗生素终浓度：100 μg/mL氨苄青霉素、34 μg/mL氯霉素；培养基：9.3 g/L麦芽糖、9 g/L酵母提取物、2 g/L硫酸铵、2 g/L磷酸二氢钾、0.2 g/L氯化钙、0.5 g/L硫酸镁、0.6 g/L硫酸锰；碳源筛选浓度：各10 g/L；麦芽糖浓度梯度：5、10、15、20、25 g/L；C/N实验：麦芽糖10 g/L，硫酸铵2.50/1.67/1.25 g/L（对应4:1、6:1、8:1）
2.5 类胡萝卜素提取、HPLC分析与计算
发酵结束时收集10 mL培养液，12000 rpm离心2 min。弃上清，菌体沉淀用1 mL ddH2O洗涤一次。去除残余水分后加入1 mL丙酮。吹打重悬沉淀，室温黑暗孵育10 min，12000 rpm离心5 min。收集上清作为类胡萝卜素提取液。提取重复两次，最终合并提取液体积为2 mL。两次提取后，额外用1 mL丙酮提取以检查沉淀中是否残留可见色素，作为提取完全性的定性评估。HPLC分析在Shimadzu LC-40D系统（Shimadzu，京都，日本）上进行，配备Agilent C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）和紫外-可见检测器。柱温维持25 °C。流动相为51%溶剂A（甲醇/水，98:2，v/v）和49%溶剂B（乙酸乙酯/水，98:2，v/v），等度洗脱，流速1.0 mL/min。检测波长470 nm，进样体积10 μL。用虾青素和β-胡萝卜素标准品建立标准曲线。β-胡萝卜素标准曲线为Y = 176913.5X−800472.8（R² ≈ 0.9958），虾青素标准曲线为Y = 16974.5X−40922.7（R² ≈ 0.9992），其中X为浓度（μg/mL），Y为峰面积（mAU·s）。目标浓度根据相应标准曲线计算。总提取量按浓度乘以提取液体积计算，湿生物量归一化产量按总量除以细胞湿重计算：产量（μg/g湿生物量）= C×V/W，其中C为提取液浓度（μg/mL），V为提取液体积（mL），W为细胞湿重（g）。共进样分析中，取一份pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR提取液先单独分析，另一份相同提取液加入虾青素标准品后在相同色谱条件下分析。两次分析进样体积均为10 μL。记录目标峰和β-胡萝卜素峰的保留时间及积分峰面积。碳源筛选中，计算虾青素相关目标峰的湿生物量归一化产量，并以麦芽糖组设为100%计算相对目标峰形成。标称C/N实验中，浓度……
【数据】培养液：10 mL；离心：12000 rpm、2 min（洗涤后离心5 min）；洗涤：1 mL ddH2O；提取溶剂：1 mL丙酮；孵育：室温、黑暗、10 min；提取次数：2次；合并体积：2 mL；HPLC系统：Shimadzu LC-40D；色谱柱：Agilent C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；柱温：25 °C；流动相：51% A（甲醇/水，98:2）+ 49% B（乙酸乙酯/水，98:2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：470 nm；进样体积：10 μL；β-胡萝卜素标准曲线：Y = 176913.5X−800472.8（R² ≈ 0.9958）；虾青素标准曲线：Y = 16974.5X−40922.7（R² ≈ 0.9992）
研究结果
3.1 重组质粒与工程菌株的构建
以X. dendrorhous PR2的cDNA为模板，crtS和crtR分别扩增为约1674和2247 bp的片段。所用序列对应GenBank登录号JQ342973.1（crtS）和LN554260.1（crtR）。pCrtS（5045 bp）和pCrtS-CrtR（7479 bp）在pBR322骨架上构建，并与pAC-BETAipi共转化大肠杆菌DH5α。双抗生素筛选后获得阳性菌落。双质粒菌株质粒制备物的SphI酶切产生预期双条带模式：pAC-BETAipi + pCrtS约为9259和5045 bp，pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR约为9259和7479 bp。全长测序进一步验证了pCrtS-CrtR。由于pCrtS单独不提供β-胡萝卜素前体，pAC-BETAipi + pCrtS用作仅CrtS共表达对照，而非独立生产菌株。整体构建策略见图1。
【数据】片段大小：crtS约1674 bp、crtR约2247 bp；质粒大小：pCrtS 5045 bp、pCrtS-CrtR 7479 bp；骨架：pBR322；酶切验证：SphI；条带：9259 + 5045 bp（pAC-BETAipi + pCrtS）、9259 + 7479 bp（pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR）；登录号：JQ342973.1（crtS）、LN554260.1（crtR）
3.2 亲本菌株与CrtS/CrtR菌株的生长曲线
pAC-BETAipi亲本菌株和pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR菌株表现出高度可比的生长动力学（图2）。两株菌在6至12 h间快速增加，约14 h后接近稳定期。亲本菌株OD600从2 h的0.21 ± 0.02增至12 h的7.94 ± 0.13，18 h达8.56 ± 0.12。CrtS/CrtR菌株对应值分别为0.20 ± 0.02、7.80 ± 0.06和8.45 ± 0.04。两条曲线在24 h观察期内保持接近，表明在所测条件下引入CrtS/CrtR模块未引起明显生长缺陷。OD600仅用于表征细胞生长；类胡萝卜素形成通过HPLC独立评估。
【数据】菌株：pAC-BETAipi亲本、pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR；OD600（亲本）：2 h 0.21 ± 0.02、12 h 7.94 ± 0.13、18 h 8.56 ± 0.12；OD600（CrtS/CrtR）：2 h 0.20 ± 0.02、12 h 7.80 ± 0.06、18 h 8.45 ± 0.04；观察期：24 h；重复数：n = 3
3.3 目标产物的初步色谱归属
在当前HPLC条件下，虾青素标准品在2.673 min显示主峰（面积4,386,178），β-胡萝卜素标准品在10.024 min显示主峰（面积1,088,978）（图3A和B）。pAC-BETAipi亲本对照在9.828 min显示主导性β-胡萝卜素相关峰（面积2,294,562），在2.7 min附近无明确目标峰（图3C）。pAC-BETAipi + pCrtS菌株同样保留β-胡萝卜素主导图谱，无明确目标区域峰（图3D）。相比之下，pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR在2.734 min显示目标峰（面积448,930），同时在10.136 min显示β-胡萝卜素峰（面积800,022）（图3E）。向同一提取液加入虾青素标准品后，目标峰面积增至812,037，保留时间基本不变，为2.732 min；β-胡萝卜素峰仍可检测（图6A和B）。因此，配对色谱图显示与虾青素标准品一致的共洗脱行为。
【数据】虾青素标准品：RT 2.673 min、面积4,386,178；β-胡萝卜素标准品：RT 10.024 min、面积1,088,978；亲本对照：β-胡萝卜素峰RT 9.828 min、面积2,294,562，2.7 min无目标峰；pAC-BETAipi + pCrtS：β-胡萝卜素主导，无目标区域峰；pAC-BETAipi + pCrtS-CrtR：目标峰RT 2.734 min、面积448,930，β-胡萝卜素峰RT 10.136 min、面积800,022；加标后：目标峰面积812,037、RT 2.732 min
3.4 碳源与麦芽糖浓度的影响
碳源对虾青素相关峰的湿生物量归一化产量有明显影响（图4）。相同发酵条件下，麦芽糖组产量最高，为16.28 ± 0.29 μg/g湿生物量。木糖、葡萄糖、α-乳糖和蔗糖的产量分别为8.74 ± 0.22、7.52 ± 0.28、3.56 ± 0.20和2.79 ± 0.17 μg/g湿生物量。单因素方差分析显示碳源组间差异显著（P < 0.001），Tukey事后检验表明麦芽糖组显著高于其他组（均P < 0.05）。随后更详细评估麦芽糖浓度。10 g/L麦芽糖获得最高产量，达16.48 ± 0.36 μg/g湿生物量（图5）。5、15、20和25 g/L麦芽糖时，产量分别为12.48 ± 0.43、14.57 ± 0.34、10.52 ± 0.31和8.70 ± 0.23 μg/g湿生物量。组间差异有统计学意义（P < 0.001），10 g/L组显著高于其他浓度组（均P < 0.05）。这些结果表明麦芽糖浓度存在明确的有效范围；麦芽糖不足可能限制前体供应，而麦芽糖过量可能增加渗透压、代谢负担或副产物形成。
【数据】碳源（10 g/L）产量：麦芽糖16.28 ± 0.29、木糖8.74 ± 0.22、葡萄糖7.52 ± 0.28、α-乳糖3.56 ± 0.20、蔗糖2.79 ± 0.17 μg/g湿生物量；统计：单因素ANOVA P < 0.001，Tukey事后检验麦芽糖组显著高于其他组（P < 0.05）；麦芽糖浓度产量：5 g/L 12.48 ± 0.43、10 g/L 16.48 ± 0.36、15 g/L 14.57 ± 0.34、20 g/L 10.52 ± 0.31、25 g/L 8.70 ± 0.23 μg/g湿生物量；统计：P < 0.001，10 g/L组显著高于其他组（P < 0.05）；重复数：n = 3
3.5 不同碳源下的相对目标峰形成
为进一步描述碳源对目标峰形成的影响，碳源筛选后计算了相对目标峰形成。以麦芽糖组虾青素相关峰产量设为100%，可直接比较其余碳源的目标峰形成。木糖、葡萄糖、α-乳糖和蔗糖的相对值分别为53.69%、46.19%、21.87%和17.14%（表3）。该排序与湿生物量归一化产量数据一致，表明麦芽糖在当前双质粒系统中支持更强的目标峰形成。
【数据】相对目标峰形成（麦芽糖=100%）：木糖53.69%、葡萄糖46.19%、α-乳糖21.87%、蔗糖17.14%
3.6 不同标称C/N比下的目标峰分布
碳源筛选和麦芽糖浓度调整后，比较了标称C/N比4:1、6:1和8:1下虾青素相关峰与残留β-胡萝卜素峰的相对分布。如2.4节所定义，这些值代表麦芽糖与硫酸铵的质量比，麦芽糖固定10 g/L，硫酸铵调整，酵母提取物及所有其他培养基组分保持恒定。代表性色谱图见图6C–E。标称C/N比6:1时，虾青素相关峰面积为294,052（19.73 μg/mL），β-胡萝卜素峰面积为437,440（7.00 μg/mL），Asta/Beta质量比2.82，摩尔比2.54，产物选择性73.8%。4:1时，对应峰面积/浓度为200,990/14.25 μg/mL和651,420/8.21 μg/mL，摩尔比1.56，选择性63.4%。8:1时为225,993/15.72 μg/mL和378,781/6.67 μg/mL，摩尔比2.12，选择性70.2%（表4）。三种标称C/N条件中，6:1产生最高目标峰浓度和最高目标峰选择性。非单调模式（4:1、6:1和8:1分别为63.4%、73.8%和70.2%）表明在所测条件内存在中间最优值，而非随标称C/N比增加而简单上升。
【数据】C/N 6:1：目标峰面积294,052（19.73 μg/mL）、β-胡萝卜素峰面积437,440（7.00 μg/mL）、质量比2.82、摩尔比2.54、选择性73.8%；C/N 4:1：目标峰200,990（14.25 μg/mL）、β-胡萝卜素651,420（8.21 μg/mL）、摩尔比1.56、选择性63.4%；C/N 8:1：目标峰225,993（15.72 μg/mL）、β-胡萝卜素378,781（6.67 μg/mL）、摩尔比2.12、选择性70.2%；麦芽糖固定：10 g/L；硫酸铵：2.50/1.67/1.25 g/L
讨论与解读
本研究考察了酵母来源P450型CrtS/CrtR模块在产β-胡萝卜素大肠杆菌背景中的行为。CrtS/CrtR共表达菌株在虾青素保留区域出现目标峰，而亲本和仅CrtS对照在该区域无明确峰。配对共进样分析中，目标峰面积从448,930增至812,037，保留时间基本不变（2.734 vs 2.732 min）。这些观察共同支持与虾青素形成一致的CrtS/CrtR相关色谱表型。CrtS是P450型酶，CrtR是X. dendrorhous中其还原酶伙伴。P450催化依赖兼容的电子传递，此前工作已将CrtR与CrtS依赖性类胡萝卜素加氧联系起来。在本大肠杆菌平台中，目标区域峰仅出现在同时携带crtS和crtR的菌株中，这一模式与酵母P450系统的氧化还原伙伴需求一致。大肠杆菌DH5α用作最终宿主。表达依赖基础lac启动子活性，未添加IPTG诱导，crtS/crtR使用天然未密码子优化形式。这些特征有利于相对简单的质粒系统，但可能限制异源P450表达。碳源筛选显示麦芽糖给出更高的湿生物量归一化目标峰产量。
编译者解读：该工作以最简质粒策略在细菌宿主中重建了酵母P450加氧模块，绕开了常规CrtW/CrtZ路线，方法学上具有探索价值。但目标峰仅靠保留时间与加标共洗脱归属，缺乏质谱或NMR结构确证，且产量停留在μg/g湿生物量水平，距工业可用的mg/g级相差数个数量级。密码子优化、P450还原酶化学计量调控及宿主改造应是后续突破重点。
参考来源
期刊：Protein Expression and Purification, 2027
DOI: 10.1016/j.pep.2026.107006
DOI: 10.1016/j.pep.2026.107006