来源：p38 MAPK inhibition safeguards genome integrity during gene editing of hematopoietic stem and progenitor cells（Molecular Therapy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
造血干祖细胞的离体基因编辑具有重要治疗潜力，但核酸酶诱导的DNA双链断裂、供体模板递送及离体培养中的增殖压力带来基因毒性风险。本研究评估了瞬时p38 MAPK抑制在临床相关CRISPR-Cas9编辑中对基因组完整性的影响。结果显示，该干预可减轻离体培养相关应激，不增加可检测的基因毒性结局：微核显著减少，大片段靶向缺失、AAV载体误整合及CAST-seq易位检测均无显著差异；长期异种移植结合全外显子测序表明p38i处理细胞突变负荷降低。这些发现支持将瞬时p38 MAPK抑制作为临床相关CRISPR-Cas9编辑流程的优化策略。
研究背景
CRISPR-Cas9基因编辑已成为多种遗传病的变革性治疗策略，多项临床试验正在进行，首批基因编辑疗法近期获批。尽管替代编辑平台不断发展，当前多数临床策略仍依赖CRISPR-Cas9核酸酶，通过诱导靶向DNA双链断裂实现基因破坏或同源定向修复。然而，DSB诱导可产生复杂且不可预测的靶向及脱靶修复结局，包括大片段缺失、杂合性丢失、染色体重排，以及罕见情况下更广泛的结构异常，引发对基因毒性风险和长期基因组稳定性的担忧。许多此类事件发生频率低，在HSPC等异质性原代细胞群体中难以用标准基因分型方法捕获。此外，不良基因组改变可能因细胞适应性受损而被负向选择，随时间推移或体内植入后逐渐被低估。另一类编辑策略通过递送治疗性DNA模板后经HDR实现精确基因校正。与主要利用易错末端连接途径的纯核酸酶方法不同，HDR依赖模板导向修复，但其效率受细胞状态和培养条件影响。
研究方法
详细材料与方法见补充信息。
研究局限性 本研究主要聚焦于CRISPR-Cas9 RNP递送和/或AAV6介导的HDR方法。p38 MAPK抑制是否在包括碱基编辑、先导编辑或非病毒供体模板在内的其他编辑平台上发挥类似有益且安全的作用，仍有待探索。此外，近期已有多种旨在提高基因编辑中HDR效率的策略被报道。尽管这些方法已被证明可在RAG1等挑战性位点大幅提高模板导向修复效率，但其与p38 MAPK抑制的联合应用仍有待测试。最后，尽管SB203580是成熟的研究工具而非临床兼容的生产试剂，但多种结构不同的p38 MAPK抑制剂——包括具有既往临床开发历史的化合物——均能重现其主要分子、细胞及安全性相关效应，这支持p38 MAPK通路抑制而非化合物特异性效应作为潜在机制。未来研究需要优化临床兼容的p38 MAPK抑制剂，以适应GMP合规的生产流程。
【数据】本研究聚焦编辑平台：CRISPR-Cas9 RNP递送和/或AAV6介导的HDR；所用p38抑制剂：SB203580；其他验证抑制剂：LY2228820、TAK-715、PH-797804；其他编辑平台（碱基编辑、先导编辑、非病毒供体模板）：原文未详述具体参数；温度：原文未详述；时间：原文未详述
研究结果
p38 MAPK抑制在多种临床相关靶点中减少基因编辑HSPC的氧化应激和DNA损伤
为确定瞬时p38 MAPK抑制的保护效应是否可扩展至治疗相关场景，我们评估了在临床相关靶点进行CRISPR-Cas9介导编辑时SB203580（以下称p38i）处理的效果。我们选择IL2RG和RAG1——这两个基因的功能缺失突变导致重症联合免疫缺陷，且已被广泛验证为基因编辑和基因治疗靶点。在离体培养期间，人动员外周血来源的HSPC在核转染靶向IL2RG或RAG1的Cas9 RNP之前先用p38i预处理。细胞随后接受位点特异性AAV6供体模板，以介导HDR驱动的整合——在IL2RG位点整合GFP报告基因，或在内源性RAG1位点整合校正型RAG1序列（图1A）。
在两个靶点上，p38i均不影响细胞活力或培养组成，也未改变靶向编辑效率或HDR效率——分别通过T7 assay和微滴数字PCR评估（图1B和S1A–S1C）。重要的是，CRISPR诱导的indel谱在两个位点的DMSO和p38i处理样本之间，修复结局分布无定性差异（图S2和S3）。相反，p38i持续降低了基因编辑HSPC在离体培养过程中积累的细胞内氧化应激（图1C）。这种氧化应激的减弱与细胞增殖的可测量减缓及DNA损伤标志物的显著减少相关，包括免疫荧光成像定量的γH2AX焦点减少，以及碱性彗星实验定量的物理DNA断裂水平降低，尽管这些效应的幅度因编辑靶点和检测方法而异（图1D–1F和S1D）。在功能上，p38i处理的HSPC生成的集落数量略有增加，多系祖细胞比例升高，与此前报道的细胞适应性改善一致（图1G、1H和S1E）。
【数据】靶基因：IL2RG、RAG1；p38抑制剂：SB203580（p38i）；编辑方式：Cas9 RNP核转染+AAV6供体模板；检测方法：T7 assay、ddPCR、免疫荧光γH2AX、碱性彗星实验、集落形成实验；细胞活力：p38i无影响；HDR效率：p38i无影响；氧化应激：p38i持续降低；DNA损伤标志物：γH2AX焦点减少、DNA断裂降低；集落数：p38i处理组略增；多系祖细胞：比例升高；具体数值：原文未详述
我们进一步在AAVS1编辑的脐血来源HSPC中评估了三种结构无关的p38 MAPK抑制剂（LY2228820、TAK-715和PH-797804）（图1I）。与SB203580类似，这些化合物不影响HSPC活力或HDR效率，且基本保持培养组成，其中LY2228820引起CD90+ HSPC组分的明显增加（图S1F–S1H）。三种抑制剂均显示出增殖减缓、DNA损伤相关读数降低及集落形成能力增加的趋势（图1J、1K、S1I和S1J）。在LY2228820处理的mPB来源HSPC中也观察到类似趋势（图S1K–S1N）。总之，这些结果表明，瞬时p38 MAPK抑制减轻了氧化应激和增殖相关的内源性DNA损伤，从而在多种编辑场景中改善了基因编辑HSPC的质量和功能输出，且未改变编辑效率或修复结局。
【数据】抑制剂：LY2228820、TAK-715、PH-797804；编辑位点：AAVS1；细胞来源：脐血来源HSPC、mPB来源HSPC；CD90+ HSPC：LY2228820处理组明显增加；HSPC活力：无影响；HDR效率：无影响；增殖：减缓趋势；DNA损伤读数：降低趋势；集落形成能力：增加趋势；具体数值：原文未详述
讨论与解读
HSPC基因编辑已成为临床现实，但其更广泛的应用仍受基因组完整性和长期安全性担忧的制约。核酸酶诱导的DNA DSB、病毒载体递送DNA供体，以及离体操作和移植的增殖需求，共同构成了一个可能产生不良修复结局、结构变异和克隆偏斜的生物学环境。该领域的核心挑战不仅是提高基因编辑效率，更要在保持干细胞适应性的同时最小化显性和隐性基因毒性风险。虽然一百个中期染色体核型分析仍是检测大体染色体重排的临床金标准，但其灵敏度有限，凸显了多层互补基因毒性评估的必要性。与作者此前建立HSPC培养中靶向p38 MAPK通路的生物学基础的工作不同，本研究提供了人HSPC中CRISPR-Cas9基因编辑基因组完整性和长期安全性的全面评估。HSPC基因编辑临床转化的主要挑战在于离体操作中维持干细胞完整性——激活、增殖和延长培养使HSPC暴露于显著的氧化和复制压力，加剧基因毒性结局。
编译者解读 本研究的方法学价值在于将"培养应激"而非"编辑工具"本身作为基因毒性干预靶点。p38i不改变编辑效率却降低突变负荷，提示编辑流程优化可与编辑工具改良并行。局限在于SB203580非GMP兼容试剂，且未在碱基编辑、先导编辑等新平台上验证；长期安全性依赖异种移植模型，其人源微环境差异仍需考量。未来需开发临床级p38抑制剂并完成GMP流程适配。
参考来源
期刊：Molecular Therapy, 2026
DOI: 10.1016/j.ymthe.2026.09.024
DOI: 10.1016/j.ymthe.2026.09.024