来源：Whole-Genome Sequencing of Mycobacterium tuberculosis in Lebanon: Updated Genomic Insights（International Journal of Infectious Diseases）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黎巴嫩是结核病低负担国家，但移民、经济危机和医疗中断使其防控形势复杂。本研究对2018—2024年收集的218株结核分枝杆菌分离株进行全基因组测序，196株通过质控。结果显示谱系4占主导（71.4%），耐药相关突变检出率41.3%，WGS耐药预测与表型药敏及线性探针试验一致率达91.8%—100%，并识别出14个推定传播簇。这是黎巴嫩迄今最大规模的结核分枝杆菌WGS分析。
研究背景
结核病仍是全球传染病致死的主要原因之一。2024年全球估算新增1070万例、死亡123万例。黎巴嫩属低负担国家，估算发病率约10/10万，2024年报告544例。但该国人口构成特殊——黎巴嫩国民、外来务工人员与大量难民混杂——使传播与控制动态异常复杂。2019年经济崩溃、新冠疫情、贝鲁特港爆炸及持续武装冲突接连冲击医疗体系，结核病监测与控制活动受到严重干扰。在此背景下，强化分子监测成为理解传播动态、支撑有效防控的关键。结核分枝杆菌分子流行病学已从传统基因分型演进至全基因组测序（WGS），后者现为高分辨率分析的金标准。
研究方法
2.1 伦理考量
本项目经贝鲁特圣约瑟夫大学研究伦理委员会批准（编号：USJ-2024-160）。因使用归档、去标识化的分枝杆菌分离株以保护患者隐私，知情同意被豁免。
【数据】伦理批号：USJ-2024-160；知情同意：豁免；样本状态：归档去标识化
2.2 分离株收集
MTB分离株选自黎巴嫩国家结核病参考实验室（NTRL）——Rodolphe Mérieux实验室（LRM）的菌株保藏库，该库保存2018至2024年间收集的约600株分离株。采用分层抽样选取分离株，每年抽取约三分之一，且每年内的国籍和药敏谱选取均反映黎巴嫩结核病患者的人口学与微生物学多样性。为应对预期测序失败和质控排除，最终处理218株分离株，约占研究期间归档MTB分离株的36%。牛分枝杆菌分离株被排除。
【数据】菌株库规模：约600株；收集年份：2018—2024；抽样比例：每年约1/3；最终处理：218株；占比：约36%；排除：牛分枝杆菌
2.3 数据收集
患者人口学与临床数据，以及分离株相关数据（包括标本类型和药敏试验结果），从NTRL数据库和国家结核病规划（NTP）记录中回顾性提取，并在分析前匿名化。
【数据】数据来源：NTRL数据库、NTP记录；数据性质：回顾性；处理：匿名化
2.4 基因组DNA提取、文库构建与全基因组测序
分离株在BSL-3条件下于Löwenstein–Jensen培养基上传代培养。基因组DNA使用Qiagen DNeasy® UltraClean® Microbial Kit（Qiagen，Hilden，德国）按制造商说明提取。测序文库使用Nextera XT DNA Library Preparation Kit（Illumina，San Diego，CA，美国）按制造商推荐构建，产生双端 reads（2 × 150 bp）。WGS在圣约瑟夫大学医学遗传学单元使用Illumina平台（MiSeq和NextSeq 550）进行；初次测序失败的分离株在贝鲁特美国大学（Illumina MiSeq i100）重新运行。
【数据】培养条件：BSL-3、Löwenstein–Jensen培养基；DNA提取试剂盒：Qiagen DNeasy UltraClean Microbial Kit；文库试剂盒：Nextera XT；读长：2 × 150 bp；测序平台：MiSeq、NextSeq 550、MiSeq i100
2.5 生物信息学分析
生物信息学分析在Galaxy平台（https://usegalaxy.org/）上进行。原始reads使用FastQC和MultiQC进行质控，用Trimmomatic修剪并重新评估（补充图1）。仅保留平均覆盖深度>30×的基因组。污染筛查使用MetaPhlAn4，保留MTBC纯度100%的分离株。TB-Profiler v6.6.4分配谱系/亚谱系，并预测对14种WHO认可抗结核药物的耐药性，依据WHO突变目录第二版判读。使用TB-Annotator v3.1进行互补的基于SNP条形码的谱系分配和系统发育聚类，将黎巴嫩基因组整合入>247,000个MTBC基因组的全球数据库，采用已建立的层级SNP条形码。系统发育树使用RAxMLv8重建，用iTOL可视化。聚类使用成对SNP距离矩阵和12-SNP传播阈值定义推定传播簇。
【数据】平台：Galaxy；质控工具：FastQC、MultiQC、Trimmomatic；覆盖深度阈值：>30×；纯度：100% MTBC；TB-Profiler版本：v6.6.4；药物数：14种；TB-Annotator版本：v3.1；全球数据库：>247,000基因组；树重建：RAxMLv8；可视化：iTOL；传播阈值：12-SNP
2.6 表型与基因型药敏试验
LRM的药敏试验结合表型和分子方法。一线表型药敏使用BACTEC® MGIT 960系统配合SIRE和PZA试剂盒（Becton Dickinson，Sparks，MD，美国）进行。对检测到一线耐药的分离株，视实验室能力使用BACTEC MGIT 960系统进行二线表型药敏。二线药物面板在研究期间随WHO指南更新而演变——早期检测注射用氨基糖苷类（卡那霉素/阿米卡星）和氧氟沙星，后期检测莫西沙星，与WHO从注射剂方案转向耐药结核治疗的趋势一致。表型耐药依据BACTEC® MGIT培养基的WHO临界浓度定义。分子检测包括线性探针试验（LPA）GenoType® MTBDRplus（Hain Lifescience）检测利福平和异烟肼耐药相关突变，以及GenoType® MTBDRsl检测氟喹诺酮类和氨基糖苷类耐药。
【数据】系统：BACTEC MGIT 960；一线试剂盒：SIRE、PZA；二线药物：卡那霉素/阿米卡星、氧氟沙星、莫西沙星；LPA试剂盒：GenoType MTBDRplus、GenoType MTBDRsl；耐药定义：WHO临界浓度
2.7 耐药分类
耐药类别依据WHO标准定义：利福平耐药（RR-TB）、单耐药、多耐药、耐多药（MDR）和准广泛耐药（pre-XDR）。
【数据】耐药类别：RR-TB、单耐药、多耐药、MDR、pre-XDR；标准：WHO
2.8 统计分析
数据使用IBM SPSS Statistics version 29.0分析。分类变量以频率和百分比汇总。WGS、表型药敏和LPA之间的一致性以百分比表示。
【数据】软件：IBM SPSS Statistics v29.0；分类变量：频率、百分比；一致性：百分比
2.9 数据可用性
原始测序数据已提交至美国国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取存档（SRA），提交编号SUB16313458。公共登录号将在数据集发布时提供。
【数据】数据库：NCBI SRA；提交编号：SUB16313458；登录号：发布时提供
研究结果
3.1 人口学与临床特征
218个测序的结核分枝杆菌基因组中，196个符合质控标准并保留用于下游分析。研究人群性别分布均等（98男98女）。患者以25—44岁为主（50.0%），而15岁以下儿童和65岁及以上成人占比较低（分别为8.7%和5.6%）。出生国方面，黎巴嫩出生患者占44.9%，外国出生者略占多数（55.1%），主要来自埃塞俄比亚（18.4%）和叙利亚（13.8%）。肺结核占主导（83.7%），痰液为最常见标本类型（55.6%），其次为支气管肺泡灌洗液（19.4%）（表1：研究人群基线特征，按结核部位分层，N = 196）。肺外标本中，淋巴结活检最常见（7.1%）。
【数据】测序数：218；质控通过：196；性别：98男/98女；年龄25—44岁：50.0%；<15岁：8.7%；≥65岁：5.6%；黎巴嫩出生：44.9%；外国出生：55.1%；埃塞俄比亚：18.4%；叙利亚：13.8%；肺结核：83.7%；痰液：55.6%；BAL：19.4%；淋巴结活检：7.1%
3.2 地理分布与转诊网络
如图1所示，贝鲁特省占分离株的58.2%，其次为贝卡（10.7%）和南部（9.7%）；Karantina的NTP中心是主要转诊中心（54.1%）。
【数据】贝鲁特省：58.2%；贝卡：10.7%；南部：9.7%；主要转诊中心：Karantina NTP中心（54.1%）
3.3 谱系与亚谱系分配
TB-Profiler和TB-Annotator鉴定谱系4为主导（71.4%），其次为谱系3（15.3%）、谱系2（6.6%）和谱系1（6.1%）。鉴定到1株谱系7分离株（0.5%）。最常见的TB-Profiler亚谱系为L4.2.2.1（14.3%）、L3（13.3%；多数谱系3分离株TB-Profiler仅能解析至谱系水平，少数进一步解析至亚谱系3.1或3.1.1）和L4.8（10.7%）。使用TB-Annotator和已建立层级SNP条形码生成的更高分辨率亚谱系分配见补充表1。
【数据】谱系4：71.4%；谱系3：15.3%；谱系2：6.6%；谱系1：6.1%；谱系7：0.5%；L4.2.2.1：14.3%；L3：13.3%；L4.8：10.7%
3.4 耐药谱分析
据TB-Profiler，58.7%的分离株预测为药物敏感。耐药分离株中，单耐药最常见（18.4%；36/196），主要由氟喹诺酮耐药驱动（21/36单耐药分离株，58.3%），其次为多耐药（11.2%；22/196）、MDR-TB（7.1%；14/196）、pre-XDR-TB（2.6%；5/196）和RR-TB（2.0%；4/196）。在经典耐药基因中鉴定到耐药相关突变（补充表2）。全队列中，异烟肼总耐药频率最高（19.4%；38/196），以高水平、katG Ser315Thr驱动为主（占INH耐药分离株的65.8%），inhA启动子突变占多数低水平耐药。氟喹诺酮耐药第二常见（14.8%；29/196），全部由gyrA突变介导，主要影响密码子94（69.0%），以Asp94Gly为主要替换（34.5%）。利福平耐药（12.2%；24/196）主要与经典rpoB Ser450Leu突变相关（54.2%）。对有配对结果的分离株，评估了WGS耐药预测（TB-Profiler）、分子药敏（LPA）和表型药敏之间的一致性。总体一致性高，依药物和检测方式不同在91.8%至100%之间（表2：WGS耐药预测（TB-Profiler）与基因型LPA及表型药敏的一致性）。基因型-WGS和表型-WGS一致性最高见于异烟肼（分别为97.6%和97.6%）、利福平（分别为96.4%和98.2%）和氟喹诺酮类（分别为98.9%和95.5%）。乙胺丁醇（100%）和二线注射剂（基因型-WGS 100%；表型-WGS 96.6%）也观察到完全或近乎完全一致，而链霉素（92.8%）和吡嗪酰胺（93.9%）的表型-WGS一致性相对较低，但仍较高。利奈唑胺、氯法齐明和贝达喹啉观察到完全表型-WGS一致性（100%），但基于极少数敏感分离株。
【数据】药物敏感：58.7%；单耐药：18.4%（36/196）；氟喹诺酮驱动单耐药：58.3%（21/36）；多耐药：11.2%（22/196）；MDR-TB：7.1%（14/196）；pre-XDR-TB：2.6%（5/196）；RR-TB：2.0%（4/196）；INH耐药：19.4%（38/196）；katG Ser315Thr：65.8%；氟喹诺酮耐药：14.8%（29/196）；gyrA密码子94：69.0%；Asp94Gly：34.5%；RIF耐药：12.2%（24/196）；rpoB Ser450Leu：54.2%；一致性范围：91.8%—100%；INH基因型/表型：97.6%/97.6%；RIF：96.4%/98.2%；氟喹诺酮：98.9%/95.5%；乙胺丁醇：100%；二线注射剂：100%/96.6%；链霉素：92.8%；吡嗪酰胺：93.9%；利奈唑胺/氯法齐明/贝达喹啉：100%
3.5 聚类分析
对195株研究分离株（1株无法上传至TB-Annotator平台）的成对SNP距离分析，在≤12 SNP阈值下鉴定出14个推定传播簇，涵盖29/195株分离株（14.9%）。13个簇含2株，1个簇含3株。多数簇位于谱系4内（11/14簇；23/29株），包括5个簇（11株）位于亚谱系4.2.2.1；其余簇属于谱系3（n = 2，亚谱系3.1.1）和谱系2（n = 1，亚谱系2.2.1.1）。谱系1或7中未观察到聚类。10个簇仅涉及黎巴嫩出生患者，2个仅涉及叙利亚出生患者，2个包含不同国籍患者，提示跨国传播有限。耐药谱在10个簇中一致、4个簇中不一致，多涉及1株药物敏感和1株耐药分离株。NTP的流行病学调查评估了基因组簇是否对应记录的传播。3/14簇（21.4%）鉴定到确诊流行病学联系；另3/14（21.4%）为间接联系（共享临床医生、未追踪接触者或姓氏）；7/14（50.0%）无联系。另有1个簇代表同一患者以两个标识符重复登记，而非真实传播事件。纳入从TB-Annotator按报告原产国为黎巴嫩过滤的49个公开基因组（BioProjects PRJNA1138325、PRJEB29276和PRJNA488372）后，数据集增至244株，鉴定出17个传播簇涉及37/244株（15.2%），而仅研究数据集为14个簇（图2）。检测到3个额外簇，1个现有簇从3株扩展至5株。所有新鉴定或扩展的簇均包含至少1株研究分离株和1个公开基因组，且属于谱系4亚谱系。
【数据】分析株数：195；阈值：≤12 SNP；簇数：14；涉及株数：29/195（14.9%）；2株簇：13；3株簇：1；谱系4簇：11/14（23/29株）；4.2.2.1簇：5（11株）；谱系3簇：2（3.1.1）；谱系2簇：1（2.2.1.1）；仅黎巴嫩出生：10簇；仅叙利亚出生：2簇；混合国籍：2簇；耐药谱一致：10簇；不一致：4簇；确诊流行病学联系：3/14（21.4%）；间接联系：3/14（21.4%）；无联系：7/14（50.0%）；重复登记：1簇；公开基因组：49；总数据集：244；总簇：17；涉及：37/244（15.2%）；新增簇：3；扩展簇：3→5株
讨论与解读
本研究是黎巴嫩迄今最大规模的MTBC全基因组测序分析，评估了2018至2024年间的菌株多样性、耐药和传播动态。谱系4占主导，与既往黎巴嫩研究及地中海和中东报道一致。谱系1—3的检出——这些谱系更常与南亚、东亚和印度洋地区相关——很可能反映黎巴嫩高度多样化的移民人群和反复的菌株输入，而非持续本地传播。在1例埃塞俄比亚出生患者中鉴定到1株谱系7分离株——人类适应性MTBC谱系中最罕见者之一，历史上局限于非洲之角——与TB-Annotator对247,000个公共SRA基因组的分析一致，该分析全球仅鉴定到93个谱系7基因组，凸显埃塞俄比亚移民与黎巴嫩结核病格局的联系。WGS级亚谱系分辨率揭示了传统分型无法触及的多样性。L4.2.2.1——"TUR"亚谱系，起源于黑海以南安纳托利亚——的高流行率反映了黎凡特与土耳其和叙利亚的联系，而L4.8（RD219缺失，Rv3083–Rv3085）的频率指向一个独特、广泛分布的簇。在9株分离株中检测到特征不明的L4.13"East-Med 1"亚谱系，主要在黎巴嫩和叙利亚患者中，提示此前未……
编译者解读
该研究将WGS嵌入国家结核病参考实验室的常规监测流程，方法选择务实——TB-Profiler做快速耐药预测、TB-Annotator做高分辨聚类、12-SNP阈值界定传播，三者互补且与表型药敏高度一致。价值在于用基因组数据揭示了移民输入与本地传播的边界，14.9%的成簇率提示本地传播规模有限但真实存在。局限也明显：单国单库回顾性抽样、部分谱系分辨率不足、公开基因组仅49株，聚类推断的流行病学验证仅21.4%确诊。将WGS常规化仍需成本与生物信息学能力的持续投入。
参考来源
期刊：International Journal of Infectious Diseases, 2026
DOI: 10.1016/j.ijid.2026.109155
DOI: 10.1016/j.ijid.2026.109155