来源：Enhanced CRISPR-Cas3-mediated genome editing using circularized crRNAs（iScience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
I型-E CRISPR-Cas3可在靶位点引入平均数千碱基的大片段缺失，但其编辑效率因靶序列和细胞类型差异极大，难以获得一致结果。本研究开发了环化crRNA（ccrRNA），通过T4 RNA连接酶2介导的分子内连接实现环化。体外切割实验证实ccrRNA可诱导Cascade复合物组装，在K562细胞中靶向EMX1和B2M基因均获得显著编辑活性，长读长测序未检出脱靶效应。ccrRNA胞内稳定性优于线性crRNA，编辑效率提升约2倍。该策略为长片段缺失系统的广泛应用提供了新工具。
研究背景
CRISPR基因编辑技术能够在活细胞中实现精准DNA修饰，具有极高的可控性和效率。CRISPR-Cas系统最初是原核生物的适应性免疫机制，分为两大类：1类系统通过多蛋白复合物发挥作用，2类系统则依赖单一蛋白。CRISPR-Cas9作为2类系统的代表，因其在多种生物中强大的编辑能力而被广泛采用。然而，Cas9的广泛使用在一定程度上限制了对其他CRISPR系统的探索，包括CRISPR-Cas3。
近年来的研究（包括本研究团队的先前工作）表明，1类CRISPR-Cas3在crRNA引导下，可在靶位点PAM序列上游产生单向的大片段基因组缺失，跨度达数千碱基。与Cas9不同——Cas9诱导局部双链断裂，主要依赖宿主DNA修复通路——Cas3以单向、渐进的方式降解靶DNA，从而从编程的靶位点产生长片段缺失。这种长片段缺失活性为基因组工程提供了一种独特的模式，可有效破坏更广泛的基因组区域，包括lncRNA位点、调控区域、重复序列以及其他延伸的非编码元件。
然而，CRISPR-Cas3的基因组编辑效率仍不理想，且因靶序列不同而差异显著。本研究通过向导RNA工程化——而非改造Cas3蛋白本身——来突破这一瓶颈。研究团队假设效率限制源于crRNA的胞内不稳定性，因此开发了具有环状结构的ccrRNA，已知环状结构可在细胞环境中赋予RNA稳定性。
研究方法
细胞系与培养条件
人胚肾293T（HEK293T）、报告基因-HEK293T、人慢性髓系白血病K562和人T淋巴细胞Jurkat细胞维持在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中。HEK293T和报告基因-HEK293T细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）和1% L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。K562和Jurkat细胞培养于添加10% FBS的RPMI-1640培养基中。草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞维持在28°C、130 rpm的PSFM-J1培养基中。本研究所用人细胞系和Sf9细胞未进行进一步鉴定。所有哺乳动物细胞系和Sf9细胞均未进行支原体污染检测。本研究未使用人类参与者或原代人样本。本研究未考虑基于性别和性别的生物学变量，因为所有实验均使用已建立的细胞系进行，未纳入人类参与者或动物模型。
【数据】细胞系：HEK293T、报告基因-HEK293T、K562、Jurkat、Sf9；培养基：DMEM（HEK293T）、RPMI-1640（K562/Jurkat）、PSFM-J1（Sf9）；血清：10% FBS；添加物：1% L-谷氨酰胺；温度：37°C（哺乳动物细胞）、28°C（Sf9）；CO₂：5%；转速：130 rpm（Sf9）
寡核糖核苷酸合成
61-nt线性RNA寡核苷酸采用标准亚磷酰胺化学法在实验室内部制备。简言之，使用市售RNA合成亚磷酰胺单体（ChemGenes, ANP-3201, ANP-3202, ANP-3203, ANP-3205）和可控孔径玻璃固相载体（ChemGenes, N-3201-10）进行合成。使用含有光可裂解疏水标签的化学磷酸化试剂在序列5′端引入磷酸基团。合成后，经脱保护并通过反相HPLC纯化。其纯度和完整性通过变性PAGE和LC-MS分析确认。
【数据】RNA长度：61-nt；合成方法：标准亚磷酰胺化学法；固相载体：可控孔径玻璃；5′修饰：光可裂解疏水标签磷酸化；纯化方法：反相HPLC；验证方法：变性PAGE、LC-MS
环化RNA的合成与表征
环状crRNA通过T4 RNA连接酶2（NEB, Ipswich, MA, USA）介导的分子内连接合成。典型反应中，5′-磷酸化crRNA（100 μM）与互补连接寡核苷酸（100 μM）以2:5摩尔比混合于4 μL体积中，加入2 μL T4 Rnl2反应缓冲液和9 μL无核酸酶水。混合物在90°C变性3分钟，然后在40分钟内逐渐冷却至24°C。退火后，加入4 μL 50%（w/v）PEG 8000和1 μL T4 RNA连接酶2，反应在37°C孵育2小时。反应产物在15% TBE-Urea凝胶（Novex, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）上分离，用SYBR Green II（TaKaRa, Kusatsu, Japan）染色，切胶后用ZR小RNA PAGE回收试剂盒（Zymo Research, Irvine, CA, USA）纯化。环化通过TapeStation（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）确认。
为评估核酸外切酶抗性，将5 μL纯化环化RNA与0.6 μL RNase R、2 μL 10×反应缓冲液（均来自Abcam, Cambridge, UK）和12.4 μL无核酸酶水在37°C孵育15分钟。处理后，取5 μL反应液与15 μL变性凝胶上样缓冲液（DiagnoCine, Hackensack, NJ, USA）混合，70°C加热15分钟。样品在15% TBE-Urea凝胶（Novex, Thermo Fisher）上以恒定电压（180 V）电泳90分钟。RNA用SYBR Green II（TaKaRa）可视化。
【数据】crRNA浓度：100 μM；连接寡核苷酸浓度：100 μM；摩尔比：2:5；变性温度：90°C；变性时间：3 min；冷却：40 min至24°C；PEG 8000浓度：50%（w/v）；连接温度：37°C；连接时间：2 h；凝胶浓度：15% TBE-Urea；电泳电压：180 V；电泳时间：90 min；RNase R用量：0.6 μL；RNase R孵育温度：37°C；RNase R孵育时间：15 min；热变性温度：70°C；热变性时间：15 min
RNA的LC-MS分析
LC-ESI-MS分析使用Agilent 1290 Infinity II系统联用6530 LC/Q TOF质谱仪。LC分离采用Acquity UPLC BEH C18柱（130 Å, 1.7 μm, 2.1 × 50 mm; Waters）。样品用甲醇线性梯度（0–30%，12分钟）在8.6 mM三乙胺–100 mM六氟-2-丙醇缓冲液（pH 8.3）中洗脱，流速0.3 mL/min，柱温维持60°C。质谱检测在负离子模式下进行。
【数据】色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（130 Å, 1.7 μm, 2.1 × 50 mm）；流动相：8.6 mM三乙胺–100 mM六氟-2-丙醇缓冲液（pH 8.3）；甲醇梯度：0–30%；梯度时间：12 min；流速：0.3 mL/min；柱温：60°C；离子模式：负离子
Cas3及Cascade组分混合物的表达与纯化
重组大肠杆菌Cas3（EcoCas3）使用杆状病毒表达系统表达，方法如前所述。简言之，含有八聚组氨酸标签和六天冬酰胺-组氨酸重复标签的EcoCas3 cDNA克隆到pFastBac-1质粒中，标签与EcoCas3之间插入TEV蛋白酶识别位点以便去除标签。对于Cascade复合物表达，编码各Cascade组分的基因克隆到pFastBac-1中，两端带有核定位信号（NLS）序列，N端或C端带有His标签，通过2A肽序列连接。使用Bac-to-Bac系统生成重组杆状病毒，感染Sf9昆虫细胞。感染细胞在28°C培养24小时，随后在20°C培养3天以诱导蛋白表达。收集细胞，裂解，Cas蛋白使用镍亲和树脂纯化。
【数据】标签：八聚组氨酸标签、六天冬酰胺-组氨酸重复标签；蛋白酶：TEV蛋白酶；载体：pFastBac-1；NLS：两端；连接肽：2A肽；表达系统：Bac-to-Bac杆状病毒系统；宿主：Sf9昆虫细胞；感染后培养：28°C 24 h，然后20°C 3天；纯化方法：镍亲和树脂
研究结果
环化crRNA的生成及Cascade组装的体外验证
为生成和纯化ccrRNA，我们采用夹板连接法进行环化（图1A）。靶crRNA序列与序列特异性连接寡核苷酸在T4 RNA连接酶2存在下孵育，促进分子内环化。未环化的crRNA（un-ccrRNA，定义为此处环化前的线性形式ccrRNA，由61-nt线性RNA组成）随后被去除，成功的环化通过变性凝胶电泳验证。
片段分析显示，环化处理后线性crRNA条带消失，出现两条迁移条带（图1B）。该模式表明大多数线性crRNA已被环化。两条条带的存在表明，过程中同时生成了单crRNA和由crRNA-夹板DNA二聚体反应产生的双倍长度环化产物。为确保准确的活性测量，切取对应单ccrRNA的较小条带并纯化用于后续分析。液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示，环化RNA的分子量比线性RNA小18，这是由于丢失了一个水分子（图1C和图S1）。
RNase R敏感性实验证实非环化对照被有效降解，而环化crRNA对应条带的强度不受RNase R处理影响（图1D）。这些结果证明成功实现了对核酸外切酶活性的保护，确保了高纯度环化。为评估ccrRNA对Cascade组装的功能能力，我们进行了体外旁切切割实验，利用CRISPR-Cas3在功能性Cascade形成后的核酸酶活性（图1E）。Cas蛋白组分以优化Cascade组装的化学计量比重组，使用pre-crRNA或ccrRNA作为向导RNA底物测量旁切切割活性。
实验表明，ccrRNA与CRISPR-Cas3诱导的旁切切割活性与pre-crRNA相当（图1F和1G）。当Cas因子以相对于crRNA的确定摩尔比混合时（Cas6:crRNA = 1:1），ccrRNA表现出比pre-crRNA高约2倍的旁切切割活性。该结果表明ccrRNA能够实现更高效的Cascade组装（图1G和1H）。
【数据】crRNA长度：61-nt；环化RNA分子量差异：比线性RNA小18（丢失一分子水）；RNase R处理条件：37°C，15 min；Cas6:crRNA摩尔比：1:1；ccrRNA旁切切割活性：约为pre-crRNA的2倍
ccrRNA在培养人类细胞中增强基因组编辑效率
为评估ccrRNA在哺乳动物细胞中的基因组编辑潜力，我们使用K562 tet-Cas3-cascade细胞，该细胞在多西环素（Dox）诱导下表达CRISPR-Cas3组分。crRNA设计为靶向EMX1基因进行基因组编辑，此前已用pre-crRNA验证。在用Dox预诱导CRISPR-Cas3组分后，通过电穿孔将crRNA转染入细胞（图2A）。初期实验中Dox诱导和crRNA递送同时进行，未能产生可检测的CRISPR-Cas3活性。因此我们推测Cas蛋白表达的时间滞后限制了crRNA功能性。为解决此问题，在crRNA电穿孔前6小时加入Dox，使转染前Cas充分表达，从而产生了强劲的CRISPR-Cas3活性。
转染后2天的基因组PCR分析显示，ccrRNA转染细胞中出现了CRISPR-Cas3活性特征性的大片段缺失，与pre-crRNA观察到的结果相似。相比之下，mat-crRNA未显示可检测的基因组编辑活性，证实观察到的活性可特异性归因于环化（图2B）。电泳结果的定量分析表明，ccrRNA的缺失效率比pre-crRNA高约2倍（图2C），随后通过基于测序的定量得到确认。
接下来，我们评估了Cas因子顺序诱导和crRNA转染后的基因组编辑活性，以研究不同crRNA形式的胞内稳定性。修饰pre-crRNA（mod pre-crRNA）在两端掺入2′-O-甲基和硫代磷酸修饰以增强稳定性，纳入比较。当Cas因子表达在crRNA转染前6小时诱导时，所有RNA形式均检测到指示大片段缺失的较短条带。然而，pre-crRNA在诱导与转染同时或之后进行时未显示基因组编辑活性，表明其在细胞中快速降解。mod pre-crRNA和ccrRNA即使在Cas因子转染后24小时诱导时仍维持基因组编辑活性（图2D和2E），证明其具有优越的胞内稳定性。
我们进一步使用另一个靶标B2M基因验证了这些发现。与先前实验类似，我们根据Dox诱导时间检查了基因组编辑效率的变化。当Cas蛋白表达在转染前6小时诱导时，所有crRNA形式均检测到基因组编辑活性（图2F）。基于PCR条带强度的定量评估表明，ccrRNA活性最高，其次是mod pre-crRNA和pre-crRNA（图2G）。值得注意的是，当Dox在转染后12小时施加时，ccrRNA维持强劲的基因组编辑活性，而pre-crRNA和mod pre-crRNA显示极低活性，表明使用ccrRNA可维持延长的Cascade形成。此外，靶向CCR5基因时，ccrRNA同样在所测试的crRNA形式中表现出最高的基因组编辑活性（图3A和3B）。
进一步评估与基因组编辑相关的表型变化。将编码CRISPR-Cas3组分的mRNA与靶向B2M或TRAC的crRNA共电穿孔入Jurkat细胞。与先前发现一致，ccrRNA在靶位点诱导基因组缺失的频率高于pre-crRNA和mod pre-crRNA（图3C、3D和3G）。此外，流式细胞术分析显示，B2M和TCRαβ表达细胞的比例在ccrRNA处理组中降低最为显著。该趋势与相应位点观察到的缺失频率一致（图3E、3F、3H和3I）。
最后，为评估ccrRNA在RNA转染系统中的功能，我们使用含有整合mCherry-P2A-EGFP序列的HEK293T报告细胞，将靶向内源EGFP的ccrRNA与编码各Cas因子的Cap1加帽mRNA共转染。荧光激活细胞分选（FACS）分析GFP敲除效率显示，mod pre-crRNA和ccrRNA的基因组编辑表现优于pre-crRNA（图S2A和S2B）。然而，mod pre-crRNA与ccrRNA之间的效率差异在EGFP靶向中不如EMX1或B2M靶向中明显，可能是因为mRNA转染效率成为基因组编辑效率的瓶颈。为进一步验证这些发现，实验重复并通过流式细胞术分析。ccrRNA处理组始终表现出最高比例的GFP阴性细胞（图S2C和S2D）。总之，这些结果清楚表明ccrRNA即使在完全基于RNA的递送系统中也维持优异的基因组编辑效率。
【数据】Dox预诱导时间：6 h（有效）；EMX1缺失效率：ccrRNA约为pre-crRNA的2倍；B2M编辑活性排序：ccrRNA > mod pre-crRNA > pre-crRNA；Dox转染后12 h：ccrRNA维持强劲活性，pre-crRNA和mod pre-crRNA极低活性；CCR5：ccrRNA活性最高；Jurkat细胞：ccrRNA缺失频率最高；B2M/TCRαβ表达降低：ccrRNA组最显著；HEK293T报告细胞：mod pre-crRNA和ccrRNA优于pre-crRNA；ccrRNA组GFP阴性细胞比例最高
ccrRNA靶位点突变的综合分析
为表征ccrRNA引导的CRISPR-Cas3基因组编辑所诱导的突变图谱，我们使用Nanopore测序平台进行了详细的测序分析。通过Integrative Genomics Viewer（IGV）可视化，除部分样本外，大多数样本在靶位点上游出现显著的覆盖度降低。
【数据】测序平台：Nanopore；分析工具：IGV；观察结果：大多数样本靶位点上游覆盖度显著降低
ccrRNA的脱靶效应评估
为评估ccrRNA介导的CRISPR-Cas3基因组编辑的脱靶效应，对先前报道的EMX1靶向crRNA的脱靶候选位点进行了PCR分析。泳道1–4对应在crRNA转染前6小时加入多西环素（Dox）的样本；泳道5–8对应其他处理条件的样本。
【数据】脱靶分析方法：PCR；靶基因：EMX1；Dox添加时间：转染前6 h（泳道1–4）；原文未详述其他处理条件
ccrRNA的胞内稳定性
为定量ccrRNA的胞内稳定性，我们建立了胞内crRNA定量流程（图6A）。转染后6、12和24小时通过RT-qPCR进行胞内crRNA水平的时程分析。数据以平均值±标准差表示（n = 3）。∗∗p < 0.01。进一步比较了不同crRNA形式的胞内水平（图6C）。
【数据】检测时间点：转染后6、12、24 h；定量方法：RT-qPCR；样本量：n = 3；统计学显著性：∗∗p < 0.01；原文未详述具体crRNA浓度数值
讨论与解读
本研究开发了针对I型-E CRISPR-Cas3系统的ccrRNA，实现了比传统线性crRNA显著更高的基因组编辑效率。增强的编辑效率通过体外实验和细胞基因组编辑实验得到确认，在多个靶标中观察到一致的改善。此外，ccrRNA表现出比化学修饰crRNA更高的基因组编辑效率，表明环状结构是比化学修饰更有效的修饰策略。本研究确立了环化crRNA作为一种向导RNA工程策略，在维持高靶标特异性的同时提高了Cas3长片段缺失系统的效率和可靠性。
I型-E CRISPR-Cas3基因组编辑系统可诱导靶区域上游跨越数千碱基的大片段缺失，使其在基因敲除应用中极为有效。然而，基因组编辑效率仍不理想，且因靶序列不同而差异显著。本研究通过向导RNA工程化而非改造Cas3蛋白机器本身来解决这一局限。研究团队假设该局限源于crRNA的胞内不稳定性，并开发了具有环状结构的ccrRNA——已知环状结构可在细胞环境中赋予稳定性。Cas3介导的长片段缺失需要Cascade复合物在靶位点的持续存在，而线性crRNA的快速降解限制了这一过程。ccrRNA通过抵抗核酸外切酶降解，延长了Cascade复合物的功能性存在时间，从而在多个靶标和细胞类型中一致地提高了编辑效率。
编译者解读
该研究的亮点在于选择了"向导RNA工程化"而非"蛋白工程化"的策略来提升CRISPR-Cas3效率，路径更简洁、通用性更强。环化crRNA的制备仅需T4 RNA连接酶2和夹板寡核苷酸，合成成本可控，且与现有脂质纳米颗粒或电穿孔递送兼容。从合成生物学应用角度看，ccrRNA解决了Cas3系统"效率不稳定"这一核心痛点，使其更接近可编程长片段删除工具的标准。局限在于：目前仅在少数细胞系和靶标中验证，体内递送效率和免疫原性尚未评估；环化RNA的大规模GMP级生产仍是产业化障碍。未来若能与AAV或LNP递送系统结合，ccrRNA-Cas3有望成为大片段基因组操作的有力工具。
参考来源
期刊：iScience, 2026
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117481
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117481