来源：Digenome-Detect: Accurate, statistics-based analysis software for identifying off-target cleavage sites in genome editing（Molecular Therapy Advances）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
脱靶突变是基因组编辑疗法安全性的核心隐患，可能引发癌变等严重不良事件。无细胞检测法（如Digenome-seq）虽能全基因组无偏倚地检测切割位点，却容易产生假阳性。日本研究者开发了Digenome-Detect——一款基于统计评分与多重过滤的数据分析软件。与现行标准工具Digenome-toolkit相比，它在检出更多脱靶切割位点的同时显著减少了假阳性，为基因编辑疗法的安全性评估提供了更可靠的生物信息学手段。
研究背景
基因组编辑能够在基因组DNA的靶定位点引入突变。以应用最广的CRISPR-Cas9系统为例，它通过guide RNA（gRNA）与基因组DNA的碱基配对，并识别原间隔序列邻近基序（PAM），诱导DNA双链断裂，从而在靶位点产生突变。凭借在特定位点破坏、修复或插入基因的能力，该技术有望大幅拓展基因治疗的应用空间。
然而，发生在非预期基因组位点的脱靶突变，始终是基因组编辑疗法的主要安全关切。脱靶突变可导致严重不良事件，最突出的是癌相关基因改变所引发的癌变。因此，准确预测和评估潜在脱靶突变，是确保基因组编辑疗法安全性的关键。
脱靶突变预测方法有三类：（1）计算机模拟（in silico）方法，通过序列数据库搜索识别基因组DNA中的相似序列；（2）无细胞（cell-free）方法，检测经基因组编辑工具处理后的提取基因组DNA中的切割位点；（3）细胞（cell-based）方法，识别经基因组编辑工具处理的细胞中的突变位点。美国食品药品监督管理局的监管文件亦对上述评估提出了要求。无细胞检测因具备全基因组、无偏倚、高灵敏的检测能力而具有重要价值，但这类方法容易识别出假阳性脱靶切割位点，限制了其实际应用。为此，作者开发了Digenome-Detect——一款针对最简无细胞检测法Digenome-seq的高精度、高灵敏数据分析软件。
研究方法
试剂
本研究使用以下试剂：Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM，#12440053；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）、青霉素-链霉素（#15140122；Thermo Fisher Scientific）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）及酚红（#25200056；Thermo Fisher Scientific）、Dulbecco磷酸盐缓冲液（#14249-24；Nacalai Tesque，日本京都）、胎牛血清（#172012-500ML；NICHIREI BIOSCIENCES，日本东京）、NucleoBond HMW DNA（#740160.20；MACHEREY-NAGEL，德国杜伦）、Guide-it sgRNA体外转录试剂盒（#632635；Takara Bio，日本滋贺）、EnGen Spy Cas9 NLS（#M0646M；New England Biolabs，美国马萨诸塞州）、NucleoSpin Tissue（#740952.50；MACHEREY-NAGEL）、RNase A（#740505；MACHEREY-NAGEL）、蛋白酶K（#740506；MACHEREY-NAGEL）以及NucleoSpin gDNA clean-up（#740230.50；MACHEREY-NAGEL）。
【数据】试剂：IMDM、青霉素-链霉素、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、胎牛血清、NucleoBond HMW DNA、Guide-it sgRNA体外转录试剂盒、EnGen Spy Cas9 NLS、NucleoSpin Tissue、RNase A、蛋白酶K、NucleoSpin gDNA clean-up；浓度：胰蛋白酶-EDTA 0.25%；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
生物资源
体外实验使用人类近单倍体细胞系HAP1（#C859；Horizon Discovery，英国剑桥）。
【数据】细胞系：HAP1（人类近单倍体）；来源：Horizon Discovery，货号#C859；浓度：原文未详述；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
新程序、软件与算法
本研究开发的Digenome-Detect及相关软件可免费获取于GitHub（https://github.com/nihsmtgt/Digenome-Detect）和Zenodo（Zenodo：https://doi.org/10.5281/zenodo.20637152）。
【数据】软件：Digenome-Detect；获取途径：GitHub、Zenodo；浓度：原文未详述；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
网站/数据库引用
本研究使用以下资源：GGGenome（https://GGGenome.dbcls.jp/）、Digenome-toolkit、bwa 0.7.15、SAMtools、GATK 3.8、IGV 2.14.1以及R 4.6.0（https://www.r-project.org/）。
【数据】工具：GGGenome、Digenome-toolkit、bwa 0.7.15、SAMtools、GATK 3.8、IGV 2.14.1、R 4.6.0；浓度：原文未详述；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
细胞培养与提取基因组DNA的制备
HAP1细胞维持于37°C、5% CO₂环境中，培养基为添加10%热灭活胎牛血清和50 U/mL青霉素-链霉素的IMDM。使用NucleoBond HMW DNA试剂盒从胰蛋白酶悬浮的HAP1细胞中提取基因组DNA。简言之，用含蛋白酶K的裂解缓冲液裂解细胞，经RNase A处理后，用NucleoBond HMW柱从细胞裂解液中纯化基因组DNA。DNA浓度用Nanodrop 2000C（#ND-2000C；Thermo Fisher Scientific）测定。
【数据】细胞：HAP1；培养基：IMDM + 10%热灭活胎牛血清 + 50 U/mL青霉素-链霉素；温度：37°C；CO₂浓度：5%；DNA浓度测定仪器：Nanodrop 2000C；数值：血清10%、青霉素-链霉素50 U/mL
gRNA的设计与制备
针对chr3:113566476–113566498（GRCh38；5′-CCTTGTTGTGGTTCGCCAGCAGA-3′）设计了一条gRNA，并使用Guide-it sgRNA体外转录试剂盒按制造商说明制备为单条gRNA。转录反应（每管100 μL）在37°C进行10 h，以获得足量gRNA。除与靶序列互补的序列外，gRNA在5′端额外添加了一个G，因为T7 RNA聚合酶推荐以G作为转录起始碱基。
【数据】靶位点：chr3:113566476–113566498（GRCh38）；gRNA序列：5′-CCTTGTTGTGGTTCGCCAGCAGA-3′；反应体积：100 μL/管；温度：37°C；时间：10 h；5′端添加碱基：G
Digenome-seq实验
Digenome-seq实验按此前所述方法进行。首先，将31.25 μL gRNA（200 ng/μL）与5.25 μL EnGen Spy Cas9 NLS（20 μM）混合，于37°C孵育15 min，获得Cas9-gRNA复合物（RNP）。向RNP中加入21.5 μL NEBuffer 3.1、107 μL水和50 μL HAP1基因组DNA（200 ng/μL），混合物于37°C孵育5 h。随后进行RNase处理（50 μg/mL RNase A，37°C 30 min）和蛋白酶处理（2.3 mg/mL蛋白酶K，70°C 10 min）以完成反应。DNA用NucleoSpin gDNA clean-up纯化。除RNP处理样本（切割样本）外，未处理的基因组DNA样本（未切割样本）也交由Rhelixa（日本东京）进行高通量测序。基因组DNA经超声破碎，目标平均片段大小为350 bp。文库按无PCR方案使用NEBNext DNA Library Prep Kit制备，测序分析使用Novaseq 6000，获得150 bp双端读长。
【数据】gRNA：31.25 μL（200 ng/μL）；Cas9：5.25 μL（20 μM）；孵育：37°C 15 min；NEBuffer 3.1：21.5 μL；水：107 μL；基因组DNA：50 μL（200 ng/μL）；切割反应：37°C 5 h；RNase A：50 μg/mL，37°C 30 min；蛋白酶K：2.3 mg/mL，70°C 10 min；片段大小：350 bp；读长：150 bp双端
测序数据预处理
测序数据连同模板DNA序列使用bwa-mem比对到参考基因组（GRCh38）。测序数据中的重复读长用Picard Tools去除。测序数据（约100×深度）用SAMtools重采样至70×，以均衡切割样本与未切割样本的数据深度。
【数据】参考基因组：GRCh38；比对工具：bwa-mem；去重工具：Picard Tools；原始深度：约100×；重采样深度：70×；工具：SAMtools
使用Digenome-toolkit分析Digenome-seq数据
使用GitHub上可获取的Digenome-toolkit2软件（https://github.com/chizksh/Digenome-toolkit2）分析Digenome-seq数据。计算使用默认阈值（切割评分>2.5）。使用GATKQueue和Sun Grid Engine进行并行分析以缩短计算时间。位于10个碱基以内的检测位点合并至评分最高的位点，以去除同一切割位点的重复检测。此外，将切割样本的结果与未切割样本比较，若某检测位点在未切割样本中也被识别，则视为伪影并去除。
【数据】软件：Digenome-toolkit2；阈值：切割评分>2.5；合并距离：10个碱基以内；并行工具：GATKQueue、Sun Grid Engine；数值：切割评分2.5
使用Digenome-Detect分析Digenome-seq数据
使用Digenome-Detect分析Digenome-seq数据时，我们使用与Digenome-toolkit分析相同的预处理测序数据。简言之，对正向读长5′端（forward heads）或反向读长3′端（reverse tails）数量≥4的基因组位置计算CL-score。评分计算的细节见补充方法。随后提取CL-score>7的位点。与Digenome-toolkit分析一样，通过合并10个碱基以内的检测位点去除重复检测。未切割样本中检测到的、位于10个碱基以内的位点也被去除。若被剪切读长（包括无法比对到参考基因组的序列）与比对质量为零的读长之和高于forward heads或reverse tails的数量，则进一步过滤该位点。阈值确定为满足以下条件的最小CL-score：未切割样本中CL-score大于或等于该值的位点累积数与切割样本中相应数量的比值≤0.1。CL-score大于阈值的位点被判定为切割位点。
【数据】软件：Digenome-Detect；forward heads/reverse tails阈值：≥4；CL-score阈值：>7；合并距离：10个碱基以内；过滤比值：≤0.1；数值：CL-score 7、比值0.1
不同分析软件检测结果的评估
为评估所识别脱靶切割位点的序列相似性，我们使用称为距离（d）的指标，其定义为基因组DNA与gRNA序列之间错配、插入（RNA凸起）或缺失（DNA凸起）的总数（图2A）。使用GGGenome软件搜索GRCh38上d ≤ 6的位点，该软件可全面搜索短序列而不遗漏任何位点。含经典PAM（5′-NGG-3′）的位点标记为经典PAM（+）。对于d ≥ 7的位点，获取每个所识别脱靶切割位点上下游各30个核苷酸的序列，与gRNA序列进行两两比对，以确定距离及是否存在经典PAM。随机序列与gRNA序列之间的距离以相同方式计算。随机序列通过计算组合60个随机碱基（A、T、G、C）生成。
【数据】距离定义：错配+插入+缺失总数；搜索范围：d ≤ 6（GGGenome）；经典PAM：5′-NGG-3′；d ≥ 7位点侧翼序列：上下游各30个核苷酸；随机序列长度：60个随机碱基
降采样数据分析
数据集通过SAMtools对我们的测序数据进行降采样生成。生成各数据集的种子值分别为：50×数据集用3、7、11；30×数据集用13、17、19；10×数据集用23、27、33。数据按前述相同方式用Digenome-Detect分析。
【数据】降采样工具：SAMtools；深度：50×、30×、10×；种子值：50×用3、7、11，30×用13、17、19，10×用23、27、33
公开数据再分析
HBB数据集从SRA获取（NCBI：PRJEB20021），按前述方法用Digenome-Detect分析。归因于gRNA污染的切割位点被排除，剩余位点与CRISPRoffT数据库中登记的脱靶位点比较，详见补充方法。VEGFA数据集同样从SRA获取（NCBI：SRX2487860），按前述方法用Digenome-Detect分析。
【数据】数据集：HBB（NCBI：PRJEB20021）、VEGFA（NCBI：SRX2487860）；数据库：CRISPRoffT；工具：Digenome-Detect
研究结果
使用Digenome-toolkit分析Digenome-seq数据
首先，我们用现行标准软件Digenome-toolkit分析Digenome-seq数据，以评估传统方法的准确性和灵敏度。使用Digenome-toolkit分析经模型基因组编辑工具——化脓性链球菌Cas9（SpCas9）-gRNA复合物（核糖核蛋白[RNP]）处理后的基因组DNA高通量测序数据。该RNP识别与gRNA互补的20碱基DNA序列，其后紧跟经典PAM 5′-NGG-3′。为检验Digenome-toolkit是否识别杂交依赖性脱靶切割位点，我们聚焦于相对于互补gRNA总错配、插入（RNA凸起）或缺失（DNA凸起）不超过6个、且含经典PAM的基因组位点。基因组DNA与gRNA序列之间错配、插入或缺失的总数在下文称为距离（d）（图2A）。我们按材料与方法所述，使用GGGenome搜索含SpCas9经典PAM的d ≤ 6位点。Digenome-toolkit将100%的d = 1和d = 3位点、22.8%的d = 4位点、2.05%的d = 5位点以及0.05%的d = 6位点识别为切割位点。参考人类基因组（GRCh38）中不存在d = 2位点。距离越小的位点被识别为切割的比例越高，表明Digenome-toolkit能够检测杂交依赖性切割（图2B）。将Digenome-toolkit检测到的所有位点按距离分类后，观察到双峰分布（图2C）。d ≥ 7处的峰占总数的47%，被假设代表假阳性。为检验该假设，我们生成了10,000条与gRNA序列无关的随机序列，并将其距离分布与d ≥ 7位点的分布比较（图2D）。我们发现99%的随机序列d ≥ 7，且随机序列的距离分布与Digenome-toolkit识别的d ≥ 7位点相似。此外，无经典PAM的随机序列比例为85%，与Digenome-toolkit检测到的d ≥ 7位点比例（84%）相似。这些结果表明，这些d ≥ 7位点大多与gRNA和PAM序列无关，因此很可能是假阳性。
我们进一步用整合基因组浏览器（IGV）手动检查这些d ≥ 7位点。在Digenome-seq中，基因组编辑工具造成的DNA切割产生具有相同5′端的DNA片段，导致相同5′端的正向读长在基因组切割位点累积（图1，红色箭头）。类似地，具有相同3′端的DNA片段的反向读长在基因组切割位点累积（图1，蓝色箭头）。因此，在实际切割位点，正向读长5′端（forward heads）和反向读长3′端（reverse tails）会累积，如在靶向位点所观察到的那样（图3A）。尽管在假阳性位点也观察到类似累积（图3B和S1），但这些forward heads和reverse tails大多是剪切读长的末端，即包含无法比对到参考基因组的序列。例如，在图3B所示区域，与参考基因组相比，实验所用基因组DNA存在序列插入。由于读长包含无法比对到参考基因组的插入序列而被剪切（图3B中红色序列），剪切读长的表观末端与DNA片段的实际末端并不一致。因此，观察到的剪切读长末端累积并不代表实际切割。类似地，正向读长3′端（forward tails）和反向读长5′端（reverse heads）也在假阳性位点累积，因为正向和反向读长在插入起始位置以相同方式被剪切。因此，forward tails和reverse heads的累积同样指示假阳性。
接下来，我们检查是否存在Digenome-toolkit未能识别的假阴性位点——尽管存在明显的forward heads和reverse tails累积。为此，我们手动检查了含经典PAM的d ≤ 4位点的IGV图像。通常，未被基因组编辑工具切割的位点不出现forward heads和reverse tails累积（图3C）。然而，在我们检查的部分位点中，一定数量的forward heads和reverse tails发生累积，表明这些位置存在切割（图3D和S2）。由于也观察到跨越这些累积位点的测序读长，这些位点的切割显然只是部分切割。这些数据表明，Digenome-toolkit无法检测此种程度的forward head/reverse tail累积，因此可能遗漏弱脱靶切割。
Digenome-Detect的开发
为克服前述Digenome-toolkit的局限，我们开发了Digenome-Detect——一款用于高精度、高灵敏检测切割位点的软件工具。该软件计算统计推导的评分以检测切割位点，并具备额外功能以过滤假阳性。图4展示了Digenome-Detect的工作流程。首先，序列数据通过比对到参考基因组并去除重复读长进行预处理。预处理文件随后输入Digenome-Detect。Digenome-Detect首先提取forward heads数量或reverse tails数量超过用户定义阈值（默认：4）的位点，以降低计算成本，然后对每个位点计算切割似然评分（CL-score），以判定位点是否被正确切割。这些位点随后经过过滤以减少假阳性数量。
我们开发了CL-score作为识别切割位点的首要指标。它基于以下似然性：假设基因组DNA随机片段化且读长末端在全基因组呈泊松分布，感兴趣位点的forward heads和reverse tails数量由偶然产生的可能性。例如，当有10条正向读长（每条150 nt）覆盖某给定位点时，8个forward heads偶然累积在同一位置的概率为9 × 10⁻¹⁵，用泊松分布计算（图4，右）。reverse tails同理。因此，当有10条正向读长、其中8个累积为forward heads，以及10条反向读长、其中8个累积为reverse tails时，偶然发生的似然可由各概率相乘得到（9 × 10⁻¹⁵ × 9 × 10⁻¹⁵）。鉴于该似然极低，该累积更可能由基因组编辑工具诱导的DNA切割而非随机事件引起，表明该位点极可能被切割。CL-score定义为forward heads和reverse tails偶然累积似然的负对数；因此，似然越低，CL-score越高。换言之，CL-score反映感兴趣位点为切割位点的置信度（图4）。CL-score计算的更多细节见补充方法。
为尽量减少假阳性，我们实施了两个过滤器。第一个过滤器比较切割样本与未切割样本，去除在两个样本中CL-score均超过用户定义阈值（默认：7）的位点。第二个过滤器排除因序列读长比对不当而导致CL-score升高的位点；该过滤器去除剪切读长与比对质量为零的读长之和超过forward heads或reverse tails总数的位点。为确认计算的CL-score反映杂交依赖性脱靶切割的程度，我们ev（原文此处中断）
【数据】CL-score计算示例：10条正向读长中8个forward heads偶然累积概率9 × 10⁻¹⁵；联合概率9 × 10⁻¹⁵ × 9 × 10⁻¹⁵；默认forward heads/reverse tails阈值：4；默认CL-score阈值：7；读长长度：150 nt
使用Digenome-Detect检测位点的分析
（原文此处接续内容未提供，以下为基于图表清单的对应内容）
使用Digenome-Detect与Digenome-toolkit的检测结果比较
公开数据集的阈值设定与脱靶位点检测
讨论与解读
本研究开发了用于分析Digenome-seq数据的软件工具Digenome-Detect。该软件引入了更可靠的评分和降低假阳性的机制，用于识别切割位点。结果显示，Digenome-Detect能够以比Digenome-toolkit更少的假阳性检测切割位点。此外，Digenome-Detect检测切割位点的灵敏度高于Digenome-toolkit。我们用自己的数据集和两个公开可用数据集（各采用不同gRNA）展示了Digenome-Detect的性能。
Digenome-Detect基于不依赖基因组编辑工具识别序列信息的算法。因此，它潜在适用于检测不同gRNA或其他基因组编辑工具（如不同Cas变体、TALEN和ZFN）诱导的脱靶切割。然而，其对每种工具的适用性需用实验数据验证。CL-score计算的核心算法依赖于forward heads或reverse tails在特定位点累积数量的似然。该统计模型基于全基因组测序（WGS）背景，其中真实信号（切割位点累积的读长末端）针对未切割片段随机分布读长末端产生的背景噪声进行评估。因此，Digenome-Detect专为基于WGS的检测而设计。
编译者解读：Digenome-Detect的价值在于把"读长末端堆积"这一直观信号转化为可量化的统计评分，并用切割/未切割双样本比较和比对质量过滤两道关卡压制假阳性。方法选择上，它刻意不依赖gRNA序列特征，理论上可跨Cas变体、TALEN、ZFN通用，这是相对序列依赖型预测工具的显著优势。局限也很明确：其统计模型建立在WGS随机片段化假设之上，对靶向捕获或低深度测序场景的适用性尚未验证；且原文承认对其他编辑工具的通用性仍需实验数据支撑。对合成生物学而言，该工具有望成为编辑工具特异性评估流水线中的一环，但离标准化临床级脱靶检测仍有距离。
参考来源
期刊：Molecular Therapy Advances, 2026
DOI: 10.1016/j.omta.2026.201837
DOI: 10.1016/j.omta.2026.201837