来源：Engineered Aspergillus niger enables high-yield heterologous kojic acid production（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
曲酸（KA）在化妆品、食品和医药领域应用广泛，但其工业规模生产长期受限于天然生产菌（如米曲霉）代谢工程策略不足、过度依赖随机诱变的问题。本研究以黑曲霉为异源宿主，采用组合代谢工程策略：多拷贝整合带His标签的kojA、过表达异源转运蛋白AokojT、敲除阻遏因子nrkC、扩增全局调控因子laeA、表达透明颤菌血红蛋白vgb增强氧利用。该整合策略将摇瓶曲酸滴度逐步提升至38 g/L，经培养基优化实现无缓冲剂条件下pH稳定（约5.5），产量提升至50 g/L；生物反应器放大后曲酸产量达56 g/L（产率0.58 g/g，生产率8.0 g/L/天），展现出强劲的工业潜力。
研究背景
曲酸（5-羟基-2-羟甲基-4-吡喃酮）是一种多功能次级代谢产物，具有抗氧化、抑制酪氨酸酶和抗菌等特性，可用于美白护肤品、食品保鲜、杀虫剂以及抗糖尿病和抗癌药物等领域。全球美白市场的需求推动其商业规模预计在2028年达到3800万美元，亟需开发高效、遗传可操作且可持续的微生物生产平台。
曲酸天然由某些曲霉和青霉属物种合成，其中米曲霉因产量高而成为主要工业宿主。然而当前生产平台面临关键瓶颈：高产菌株传统上通过诱变获得，曲酸生物合成途径尚未完全阐明，制约了代谢工程改造。同位素示踪研究表明，曲酸由葡萄糖经涉及关键基因kojA和kojT的简单途径直接合成。kojA介导氧化还原反应，但其精确反应物和产物仍未解析。kojT编码的曲酸转运蛋白的表征推进了对途径的理解，转录调控因子（包括……原文此处截断）等方面的研究也在推进中。
在此背景下，本研究选择黑曲霉作为异源宿主——该菌不天然合成曲酸，但遗传操作体系成熟，且已构建了消除柠檬酸和草酸副产物形成的底盘菌株S834。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究使用的黑曲霉菌株详见支持信息表S1。菌株S834是黑曲霉ATCC 1015的衍生株，作为后续所有遗传改造的出发菌株。菌株S1991是先前报道的表达单拷贝、无标签kojA基因的黑曲霉菌株，作为参考菌株用于比较。大肠杆菌JM109用于质粒构建和扩增，在37 °C的Luria–Bertani（LB）培养基中培养。根癌农杆菌AGL-1用于黑曲霉的农杆菌介导转化（AMT），在28 °C的LB培养基中生长。孢子制备、转化子筛选以及基因过表达或敲除突变体的表型分析分别在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、IM固体培养基（IM）、完全培养基（CM）和基本培养基（MM）上进行，遵循先前描述的方案。所有黑曲霉培养物均在28 °C下孵育。在需要时，培养基中补充250 μg/mL潮霉素B或100 μg/mL卡那霉素，用于菌株构建和质粒维持期间的选择。
摇瓶实验中使用的曲酸发酵培养基改编自最初为米曲霉开发的方案。最终组成包括100.0 g/L葡萄糖、2.5 g/L酵母提取物、1.0 g/L K₂HPO₄、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O和0.75 M 2-吗啉乙磺酸（MES），使用前调节至pH 6.0。
用于原位曲酸检测的显色琼脂平板制备方法：首先将FeCl₃·6H₂O（1.0 g）和浓HCl（2.25 mL）溶解于蒸馏水中，定容至100 mL获得显色剂；随后将琼脂糖（1.5 g）在100 °C下溶解于蒸馏水（50 mL）中制备1.5%（w/v）琼脂糖溶液。将该溶液与等体积（50 mL）显色剂在60 °C下混合，立即倾倒（20 mL/平板）到已预先定殖工程菌株（28 °C培养5–7天）的曲酸发酵培养基平板上，室温固化10分钟后进行比色评估。
【数据】菌株：S834（出发菌株）、S1991（参考菌株）、大肠杆菌JM109、农杆菌AGL-1；培养基：LB、PDA、IM、CM、MM、曲酸发酵培养基；温度：大肠杆菌37 °C、农杆菌28 °C、黑曲霉28 °C；抗生素：潮霉素B 250 μg/mL、卡那霉素100 μg/mL；发酵培养基：葡萄糖100.0 g/L、酵母提取物2.5 g/L、K₂HPO₄ 1.0 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、MES 0.75 M，pH 6.0；显色剂：FeCl₃·6H₂O 1.0 g、浓HCl 2.25 mL、定容100 mL；琼脂糖：1.5 g/50 mL（1.5% w/v）；显色平板倾倒量：20 mL/平板；预培养时间：5–7天；固化时间：10 min
2.2 质粒构建
本研究使用的所有质粒列于支持信息表S1，相应引物见表S2。质粒构建使用南京诺唯赞生物科技有限公司（中国江苏省南京市）提供的ClonExpress II一步克隆试剂盒（C112-01/02）。kojA（AO090113000136）和AokojT（AO090113000138）的序列从米曲霉cDNA中扩增，而laeA（ASPNIDRAFT_176969）和AngkojT（ASPNIDRAFT_43217）的序列从菌株S834的cDNA中扩增。vgb过表达质粒（pLHVHB）和AngkojT的破坏质粒（pLH1737）在先前研究中已构建，实验室中可用。表达kojA-his、AngkojT、AokojT和laeA的质粒按照与先前研究相同的策略构建，使用质粒pLH454作为骨架。
例如，kojA-his过表达质粒（pKH）通过将kojA-his编码序列（CDS）插入pLH454中3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子（PgpdA）下游而生成。具体而言，为便于后续蛋白质检测和纯化，采用长引物策略将6×His标签编码序列融合到kojA编码区3′端、紧邻天然终止密码子上游。以米曲霉cDNA为模板，使用引物对KH-F/KH-R进行PCR扩增。所得PCR产物随后连接入经BamHI和EcoRI消化的pLH454中，得到重组质粒pKH。按照相同的构建策略，生成AngkojT、AokojT和laeA的过表达质粒，分别命名为pANKT、pAOKT和pLAEA。
用于laeA基因破坏的质粒以pLH594为母载体，按照先前研究描述的相同策略构建。以S834基因组DNA为模板，使用引物对laeA-UF/laeA-UR和laeA-DF/laeA-DR分别PCR扩增laeA的上下游同源臂。所得片段依次连接入pLH594中潮霉素抗性盒（loxP-hph-loxP）的上下游区域，得到AngkojT缺失质粒pDLAEA。
【数据】试剂盒：ClonExpress II一步克隆试剂盒（C112-01/02）；基因来源：kojA（AO090113000136）和AokojT（AO090113000138）来自米曲霉cDNA，laeA（ASPNIDRAFT_176969）和AngkojT（ASPNIDRAFT_43217）来自S834 cDNA；骨架质粒：pLH454；限制性内切酶：BamHI、EcoRI；标签：6×His；启动子：PgpdA；母载体（破坏质粒）：pLH594；抗性盒：loxP-hph-loxP；质粒命名：pKH、pANKT、pAOKT、pLAEA、pDLAEA
2.3 菌株构建
一系列重组黑曲霉菌株通过农杆菌介导转化（AMT）结合Cre-loxP系统切除hph抗性标记构建。所有质粒通过AMT导入受体菌株。转化后，将转化子在含多西环素（30 μg/mL）的基本培养基（MM）平板上培养以切除侧翼为loxP位点的hph标记基因，随后选择潮霉素B敏感菌落并用引物hph-F/hph-R通过PCR确认。
对于基因过表达，使用携带目标编码序列、由PgpdA控制的质粒。转化子在含头孢噻肟钠（100 μg/mL）、潮霉素B（250 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）和链霉素（100 μg/mL）的CM平板上于28 °C选择5天。对潮霉素B具有抗性的菌落进一步在含250 μg/mL潮霉素B的PDA平板上验证，并通过PCR确认正确盒整合。
对于基因破坏，通过AMT导入含同源侧翼和选择标记的敲除盒。转化子在含250 μg/mL潮霉素B的PDA平板和补充1000 μg/mL草铵膦的MM平板上筛选。对潮霉素B具有抗性但对草铵膦敏感的菌落视为推定敲除体，并通过PCR确认。
菌株构建步骤如下：首先将过表达质粒pKH导入黑曲霉S834获得KH-R，随后切除hph生成KH-S。KH-S随后用pKH再次转化两次，分别生成2 KH-R/2 KH-S和3 KH-R/3 KH-S。以3 KH-S为出发菌株，用pANKT和pAOKT转化分别获得AngkojT-R和AogkojT-R。随后从AogkojT-R中去除hph标记生成AogkojT-S。以AogkojT-S为出发菌株，通过pLH1497转化构建ΔnrkC-R突变体，随后切除hph获得ΔnrkC-S。ΔnrkC-S随后用pLAEA转化获得LaeA-R，从中衍生LaeA-S。LaeA-S随后用pLHVHB转化，获得最终重组菌株VHb-R。同时，将pLH1737转化入KH-S构建破坏菌株ΔAngkojT-R，将pLH1497转化入ΔnrkC-S生成ΔLaeA-R，遵循相同的破坏和验证程序。
【数据】转化方法：农杆菌介导转化（AMT）；标记切除：多西环素30 μg/mL；选择抗生素：头孢噻肟钠100 μg/mL、潮霉素B 250 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、链霉素100 μg/mL；选择温度：28 °C；选择时间：5天；敲除筛选：潮霉素B 250 μg/mL、草铵膦1000 μg/mL；菌株系列：KH-R/KH-S、2 KH-R/2 KH-S、3 KH-R/3 KH-S、AngkojT-R、AogkojT-R/AogkojT-S、ΔnrkC-R/ΔnrkC-S、LaeA-R/LaeA-S、VHb-R、ΔAngkojT-R、ΔLaeA-R
2.4 不同菌株中kojA的转录分析
黑曲霉菌株中kojA基因的转录水平按照基于先前报道方法的改良方案评估。在曲酸发酵培养基中摇瓶培养3天后，收集菌丝体并进行总RNA提取。使用PrimeScript™ II第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa Biomedical Technology Co., Ltd.）合成第一链cDNA。为检测kojA的表达，使用SYBR Premix Taq II试剂在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行定量实时PCR（qRT-PCR）。管家基因actin作为内参。相对表达水平使用2^–ΔΔCt方法计算，基于各菌株中kojA和actin的循环阈值（Ct）值。
【数据】培养时间：3天；试剂盒：PrimeScript™ II第一链cDNA合成试剂盒；qRT-PCR试剂：SYBR Premix Taq II；仪器：StepOnePlus实时PCR系统；内参基因：actin；计算方法：2^–ΔΔCt
2.5 黑曲霉摇瓶发酵
发酵和取样方案改编自先前描述的方法。将工程黑曲霉菌株（1 × 10⁶个分生孢子/mL）接种到250 mL……（原文此处截断）
【数据】接种量：1 × 10⁶个分生孢子/mL；培养基体积：50 mL；摇瓶规格：250 mL；其他参数：原文未详述
研究结果
3.1 kojA拷贝数优化增强曲酸生产
先前研究已将曲酸生物合成途径表征为源自葡萄糖的简洁三步路线。虽然每个酶促步骤的具体生化作用仍未完全明确，但编码氧化还原酶KojA的kojA基因已被鉴定为曲酸形成所必需。在不天然合成曲酸的黑曲霉异源生产系统中，仅导入并过表达kojA就足以实现曲酸生物合成，凸显了其关键功能。这一观察引出了增加kojA表达可能增强曲酸生产的假设。
为研究这一可能性，使用强组成型gpdA启动子驱动kojA转录，并通过增加基因拷贝数进一步提高表达。每个拷贝附加C端6×His标签（KojA-His），以便简化下游纯化。使用组成型启动子PgpdA，将kojA-his表达盒以单拷贝、双拷贝或三拷贝整合到黑曲霉菌株S834的基因组中，该背景菌株经过工程改造以消除柠檬酸和草酸副产物的形成。每次整合，转化子首先基于潮霉素抗性（hph）进行选择，获得中间菌株KH-R、2 KH-R和3 KH-R。随后通过标记回收切除hph标记，分别生成最终的无标记、潮霉素敏感菌株KH-S（1×kojA-his）、2 KH-S（2×）和3 KH-S（3×）。
在摇瓶发酵第3天进行的定量RT-PCR表明，相对于KH-S，2 KH-S和3 KH-S中kojA-his转录水平分别增加约5.1倍和9.2倍（图2A）。这些结果证实了成功转录以及基因拷贝数与mRNA丰度之间的正相关。在曲酸发酵琼脂上，曲酸生产特有的紫色色素在第3天仅出现在工程菌株中，颜色强度从KH-S到2 KH-S再到3 KH-S递增。这一梯度与基因拷贝数匹配，支持曲酸积累的剂量依赖性增加（图2E）。
在以100 g/L葡萄糖启动的7天发酵中，所有工程菌株的曲酸产量稳步增加，2 KH-S和3 KH-S的最终滴度分别为21.5 g/L和22.5 g/L，而KH-S为8.0 g/L，亲本菌株S834中可忽略不计（图2B）。葡萄糖消耗呈现类似趋势。第7天残留葡萄糖水平分别为74.0 g/L（KH-S）、55.2 g/L（2 KH-S）和54.1 g/L（3 KH-S）（图2C）。基于葡萄糖消耗计算的产率显示，2 KH-S为0.48 g/g，3 KH-S为0.49 g/g，大幅超过KH-S的0.31 g/g。所有菌株的DCW在第5天达到峰值5–6 g/L，随后小幅下降（图2D）。工程菌株之间未检测到生物量的显著差异，表明增加kojA-his拷贝数未损害生长或细胞生理。曲酸积累在稳定期持续进行，表明生物合成在生物量峰值之后仍保持活跃。
与先前报道的表达无标签KojA的单拷贝菌株S1991比较，KH-S（带标签KojA-His）的曲酸产量高出48.8%（8.0 g/L vs. 5.4 g/L）（图2A）。然而，qRT-PCR分析表明两菌株间kojA转录水平无显著差异（图2A）。这一观察表明His标签的存在与曲酸产量增加相关，但无法就潜在机制得出直接结论。先前研究报道，包括His标签在内的亲和标签可能影响酶的稳定性或活性等特性。因此，KH-S中观察到的曲酸产量提高可能与KojA-His生化特性的改变有关。然而，在缺乏蛋白质水平或酶活性数据的情况下，导致这一效应的具体机制仍未解析。
尽管3 KH-S中kojA-his转录水平比2 KH-S高约1.8倍，但在摇瓶条件下未观察到曲酸滴度或产率的进一步增加。两菌株达到相似的最终滴度（约22 g/L）和葡萄糖到曲酸的转化率（约0.62–0.63 g/g），表明存在饱和点，超过该点后额外基因拷贝带来的益处有限。然而，3 KH-S在最终曲酸产量上保持轻微优势，使其成为进一步代谢工程的合适宿主。在PDA平板上观察到从KH-S到3 KH-S色素沉着和分生孢子形成逐渐减少（图2F），表明过高的基因剂量或插入效应可能影响发育性状。
该研究确定了kojA剂量效应的三个不同阶段：第一，线性阶段（1到2个基因拷贝）导致曲酸滴度增加2.7倍；第二，平台阶段（2到3个拷贝）仅产生不到5%的改善；第三，生理权衡阶段，3拷贝菌株（3 KH-S）表现出分生孢子形成减少。尽管3 KH-S仅显示边际滴度优势，但其9.2倍的转录激活和稳定的基因组整合为后续转运蛋白工程提供了稳健平台。
【数据】拷贝数：1×、2×、3×kojA-his；转录水平：2 KH-S较KH-S增加约5.1倍，3 KH-S增加约9.2倍；曲酸滴度（7天）：KH-S 8.0 g/L、2 KH-S 21.5 g/L、3 KH-S 22.5 g/L、S834可忽略；残留葡萄糖（第7天）：KH-S 74.0 g/L、2 KH-S 55.2 g/L、3 KH-S 54.1 g/L；产率：KH-S 0.31 g/g、2 KH-S 0.48 g/g、3 KH-S 0.49 g/g；DCW峰值：5–6 g/L（第5天）；KH-S vs S1991：8.0 g/L vs 5.4 g/L（高48.8%）；3 KH-S vs 2 KH-S转录比：约1.8倍；转化率：约0.62–0.63 g/g；线性阶段滴度增加：2.7倍；平台阶段改善：<5%
3.2 过表达KojT转运蛋白增强曲酸外排
为解决曲酸生物合成的下游瓶颈，对分泌步骤作为潜在限制因素进行了评估。在微生物系统中，次级代谢产物外排不足被广泛认为会通过施加产物相关的代谢和调控限制来制约整体生产效率，即使生物合成能力已增强。因此，增强曲酸外排能力被探索为kojA扩增所实现的生物合成通量增加的互补策略。
为进一步评估曲酸（KA）在高浓度下是否可能施加生理限制，我们使用外源供应的曲酸进行了额外的生长抑制实验。当黑曲霉S834和米曲霉NRRL3488在PDA平板上以递增曲酸浓度（0–50 g/L）培养5天时，曲酸表现出明显的浓度依赖性抑制效应。菌落大小随曲酸浓度增加逐渐减小；在40 g/L时观察到明显的生长抑制，在50 g/L时无可见菌落生长（图S1）。在相同条件下，两菌株表现出高度相似的抑制模式，表明对曲酸的耐受性相当。这些结果表明足够高的曲酸浓度可抑制黑曲霉生长，支持了研究生产系统中曲酸外排能力的合理性。
首先基于序列相似性评估曲酸转运蛋白的功能保守性。AngKojT（ASPNIDRAFT_43217，GenBank EHA28474.1），黑曲霉中预测的内源性曲酸外排蛋白，与米曲霉的AoKojT（AO090113000138）共享78%的氨基酸同一性，表明跨物种的功能保守性。为验证AngkojT的功能相关性，在1×kojA-his背景（KH-S）中敲除该基因，生成菌株ΔAngkojT-R。7天摇瓶发酵后，ΔAngkojT-R仅积累0.3 g/L曲酸，与KH-S的8.0 g/L形成鲜明对比（图3A）。ΔAngkojT-R中残留葡萄糖保持在78.0 g/L的高水平，而KH-S为72.4 g/L（图3B），生物量积累相当（两菌株均为5.1 g/L干重；图3C）。总体而言，这些结果表明AngkojT失活严重破坏培养液中曲酸积累，证实AngkojT在测试发酵条件下对高效曲酸外排至关重要。
在确立了KojT介导外排的功能重要性后，我们接下来测试了增强外排能力是否可进一步提高高通量背景下的生产力……（原文此处截断）
【数据】KA抑制浓度：0–50 g/L，40 g/L明显抑制，50 g/L无可见生长；培养时间：5天；AngKojT与AoKojT氨基酸同一性：78%；ΔAngkojT-R曲酸产量：0.3 g/L vs KH-S 8.0 g/L；残留葡萄糖：ΔAngkojT-R 78.0 g/L vs KH-S 72.4 g/L；DCW：两菌株均为5.1 g/L
后续工程策略（基于摘要与图注补充）
在转运蛋白工程之后，研究进一步进行了顺序调控和氧供应工程。以AogkojT-S（3×kojA-his + AokojT过表达）为出发菌株，敲除nrkC生成ΔnrkC-S；随后laeA缺失和过表达分别产生ΔLaeA-R和LaeA-S。
碳氮源对工程菌株VHb-R曲酸生产的影响通过7天摇瓶发酵评估，测试了不同碳源和氮源条件下的曲酸滴度、DCW和残留葡萄糖浓度。
酵母提取物（YE）浓度和缓冲条件对VHb-R曲酸生产的影响在四种条件下评估：YE 2.5 g/L + MES（+）、YE 2.5 g/L + MES（−）、YE 10.0 g/L……（原文截断），监测7天摇瓶发酵中的曲酸滴度、DCW、残留葡萄糖浓度和pH。
在2 L搅拌罐生物反应器中评估VHb-R的曲酸生产，比较了原始配方（100 g/L葡萄糖、2.5 g/L酵母提取物、0.75 M MES）和改进配方，监测曲酸滴度、残留葡萄糖浓度、DCW和pH。
最终，该整合方法将摇瓶曲酸滴度逐步提升至38 g/L。培养基优化实现了无缓冲剂条件下稳定pH（约5.5），将产量提升至50 g/L。生物反应器放大后曲酸产量达56 g/L（产率0.58 g/g；生产率8.0 g/L/天）。
【数据】最终摇瓶滴度：38 g/L；优化后滴度：50 g/L；pH：约5.5（无缓冲剂）；生物反应器产量：56 g/L；产率：0.58 g/g；生产率：8.0 g/L/天；生物反应器规模：2 L搅拌罐
讨论与解读
本研究通过组合代谢工程策略在黑曲霉中实现了异源曲酸的高产合成。核心策略包括五个层面：kojA-his多拷贝整合（1→2→3拷贝）、异源转运蛋白AokojT过表达、阻遏因子nrkC敲除、全局调控因子laeA扩增、透明颤菌血红蛋白vgb表达增强氧利用。拷贝数优化揭示了三个阶段的剂量效应——线性期、平台期和生理权衡期，为基因剂量策略提供了参考。转运蛋白工程证实AngKojT是曲酸高效外排的关键，其失活导致产量从8.0 g/L骤降至0.3 g/L。最终整合策略将摇瓶产量从8.0 g/L逐步提升至38 g/L，经培养基优化（无缓冲剂pH稳定约5.5）达50 g/L，2 L生物反应器放大后达56 g/L，产率0.58 g/g，生产率8.0 g/L/天。
编译者解读： 该研究的亮点在于将成熟的黑曲霉底盘与多层级代谢工程策略系统整合，特别是通过转运蛋白工程解除产物外排瓶颈这一思路，对真菌次级代谢产物高产改造具有普适参考价值。His标签意外提升产量但机制未明的现象值得后续从蛋白稳定性或酶活角度深入探究。局限在于kojA的具体生化功能仍未解析，且vgb增强氧利用的分子机制在节选中未展开。从工业角度看，56 g/L的产量和8.0 g/L/天的生产率已具备一定竞争力，但无缓冲剂条件下的pH稳定策略能否在更大规模反应器中重现仍需验证。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.03.003
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.03.003