来源：Metabolic engineering of Escherichia coli based on adaptive evolution and omics technology for highly efficient l-valine production under oxygen-limited conditions（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-缬氨酸的微生物发酵长期受困于前体丙酮酸被TCA循环分流、氧限制条件下NADH再氧化不足与ATP供给匮乏等瓶颈。本研究以大肠杆菌为底盘，先敲除乙酸合成途径四个基因阻断副产物积累，再增强gapA表达以强化NADH补给，构建适配氧限制条件的出发菌株VAL06；随后在密封瓶中开展两轮氧限制自适应实验室进化（ALE），获得生长与产量同步提升的进化菌ALE2-40；结合比较基因组学与转录组学解析有益靶点并回补验证，最终菌株VAL19在5 L生物反应器中28 h产L-缬氨酸93.7 g/L，葡萄糖得率60.4%（理论得率的92.9%），生产强度3.35 g/L/h。
研究背景
自然界中微生物所处环境含氧与否并不确定，它们通常依赖呼吸链或底物水平磷酸化产能。呼吸链的ATP产生效率远高于底物水平磷酸化，但其运转需要氧气，同时TCA循环被激活，对以丙酮酸为前体的化学品合成构成强力竞争途径。因此，利用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等兼性厌氧菌生产丙酮酸及其衍生物时，研究者尝试将发酵从有氧转向氧限制或厌氧条件，以减少丙酮酸经TCA循环的消耗、提高碳源到目标产物的得率。氧限制或厌氧条件下，糖酵解产生的NADH必须重新氧化以维持辅因子平衡，否则乙酸、乳酸、琥珀酸等发酵副产物积累会抑制细胞生长和目标产物合成。本研究即针对这一核心矛盾，通过代谢工程改造、氧限制自适应进化与组学指导的逆向代谢工程，构建高效合成L-缬氨酸的细胞工厂。
研究方法
2.1 微生物与质粒
本研究所用菌株与质粒列于表1，所用引物列于补充表S1。出发菌株VAL0为本实验室先前构建。大肠杆菌DH5α用作质粒构建的克隆宿主，质粒pSTV28用于基因过表达。质粒pREDCas9和pGRB由天津大学陈涛教授惠赠，用于基因操作。
【数据】菌株：VAL0、DH5α；质粒：pSTV28、pREDCas9、pGRB；出发菌株来源：本实验室先前构建；克隆宿主：E. coli DH5α
2.2 CRISPR/Cas9介导的基因组编辑
菌株改造中，染色体缺失或整合采用Li等人描述的CRISPR/Cas9系统进行。以基因poxB的敲除为例说明：简要而言，使用CRISPR RGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计一对20 bp互补序列，随后在引物中合成并退火形成dsDNA。将带有与pGRB骨架同源侧翼序列的退火dsDNA，使用ClonExpress® II One Step Cloning Kit（Vazyme，中国）连接入线性化pGRB质粒，构建gRNA表达质粒（pGRB-poxB）。通过重叠PCR连接两条同源臂，生成供体DNA片段（DNA-poxB）。将质粒pGRB-poxB与供体DNA-poxB共转化入携带质粒pREDCas9的目标菌株电感受态细胞中。使用0.1 mM IPTG诱导λ-Red重组酶表达。使用分别含50 μg/mL氨苄青霉素和壮观霉素的LB平板进行阳性菌落筛选。阳性菌落进一步通过菌落PCR和DNA测序验证。验证正确的菌落接种于含0.2% L-阿拉伯糖的LB中过夜培养，以消除质粒pGRB-poxB。质粒pREDCas9的消除通过在42 °C过夜培养完成。
【数据】gRNA互补序列长度：20 bp；IPTG浓度：0.1 mM；抗生素浓度：氨苄青霉素50 μg/mL、壮观霉素50 μg/mL；L-阿拉伯糖浓度：0.2%；pREDCas9消除温度：42 °C；时间：过夜
2.3 摇瓶有氧发酵
自适应实验室进化（ALE）之前构建的工程菌株的有氧摇瓶发酵在220 rpm摇床转速下进行。这些工程菌株首先从固体平板接种至LB液体培养基，于37 °C、220 rpm振荡培养约12 h。随后，将菌株接种至500 mL摇瓶中的30 mL LB培养基作为种子培养，于37 °C、220 rpm培养约12 h。种子培养阶段结束后，以10%接种量将种子转入500 mL挡板摇瓶，最终发酵体积30 mL。发酵过程在37 °C、220 rpm下进行24 h。发酵培养基（每升）含20 g葡萄糖、1 g酵母提取物、4 g柠檬酸盐、6 g K2HPO4、1 g MgSO4·7H2O、60 mg FeSO4·7H2O、5 mg MnSO4·H2O、0.5 mg VH、数滴消泡剂和8 mg酚红。整个发酵过程中，通过微量注射器控制加入25%（v/v）氨水（NH3·H2O），以酚红颜色变化为指示，将pH仔细调节并维持在约7.0。一旦发酵培养基中葡萄糖耗尽，加入1 mL 60%（w/v）葡萄糖溶液以维持补料分批发酵。
【数据】摇床转速：220 rpm；种子培养温度：37 °C；种子培养时间：约12 h；接种量：10%；发酵体积：30 mL；发酵温度：37 °C；发酵时间：24 h；发酵培养基组分（每升）：葡萄糖20 g、酵母提取物1 g、柠檬酸盐4 g、K2HPO4 6 g、MgSO4·7H2O 1 g、FeSO4·7H2O 60 mg、MnSO4·H2O 5 mg、VH 0.5 mg、酚红8 mg；pH：约7.0；氨水浓度：25%（v/v）；补料葡萄糖浓度：60%（w/v）；补料体积：1 mL
2.4 氧限制条件下的自适应实验室进化
为增强菌株对氧限制条件的耐受性并促进L-缬氨酸高产，我们采用ALE优化其在氧限制胁迫下的生长性能。使用装满发酵培养基的密封试剂瓶建立缺氧环境。ALE所用培养基含20 g/L葡萄糖、1 g/L酵母提取物、4 g/L柠檬酸盐、6 g/L K2HPO4、5 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4·7H2O、60 mg/L FeSO4·7H2O、5 mg/L MnSO4·H2O、0.5 mg/L VH、20 g/L MOPS以维持pH稳定，以及8 mg/L酚红。连续传代过程中，取1 mL细胞培养物转移至新鲜试剂瓶。培养物于37 °C、220 rpm持续振荡培养。当菌株经过多轮连续传代进化培养后表现出显著增强的生长性能时，将培养物稀释并均匀涂布于LB固体平板。随机挑选共48个单菌落，通过96深孔板发酵进行初筛。随后，在初筛中表现出显著增强生长性能的菌株，通过氧限制条件下的摇瓶发酵进行二次筛选。氧限制摇瓶发酵后，将L-缬氨酸效价最高的菌株引入第二轮ALE。
【数据】ALE培养基组分（每升）：葡萄糖20 g、酵母提取物1 g、柠檬酸盐4 g、K2HPO4 6 g、(NH4)2SO4 5 g、MgSO4·7H2O 1 g、FeSO4·7H2O 60 mg、MnSO4·H2O 5 mg、VH 0.5 mg、MOPS 20 g、酚红8 mg；传代体积：1 mL；培养温度：37 °C；摇床转速：220 rpm；单菌落挑选数：48个；初筛方式：96深孔板发酵
2.5 ALE衍生工程菌株的氧限制发酵
ALE实验后，在96深孔板中对进化菌株进行初步发酵筛选。用无菌牙签从LB固体平板挑取单菌落，接种至含450 μL LB培养基的96深孔板中进行种子培养。种子培养在37 °C、220 rpm下进行12 h。随后，将种子培养物转移至含450 μL发酵培养基的新96深孔板中，并加入葡萄糖溶液（60%，w/v）至终浓度10 g/L。用密封垫密封96深孔板以建立氧限制条件。发酵过程在37 °C、220 rpm下进行。对于摇瓶氧限制发酵，种子培养基和发酵培养基与有氧条件相同，仅发酵阶段摇床转速从220 rpm降至80 rpm以营造氧限制环境。
【数据】种子培养基体积：450 μL；种子培养温度：37 °C；种子培养转速：220 rpm；种子培养时间：12 h；发酵培养基体积：450 μL；葡萄糖终浓度：10 g/L；葡萄糖母液浓度：60%（w/v）；发酵温度：37 °C；发酵转速：220 rpm；氧限制摇瓶转速：80 rpm
2.6 5 L生物反应器氧限制补料分批发酵
将斜面培养的细胞接种至含2 L发酵培养基的5 L生物反应器（Biotech-5BG，保兴，中国）中。发酵培养基与摇瓶发酵所用相同，仅省略酚红pH指示剂。发酵温度维持在37 °C，通过自动加入25%（v/v）氨水（NH3·H2O）将pH维持在约7.0。初始培养基中葡萄糖耗尽后，以最佳速率加入80%（w/v）葡萄糖溶液，确保残余葡萄糖浓度低于2 g/L。为建立氧限制环境，搅拌转速仅设为300 rpm，通气量设为0.2 L/min。发酵约8 h后，DO降至0并维持至发酵结束。
【数据】生物反应器：5 L（Biotech-5BG）；发酵培养基体积：2 L；发酵温度：37 °C；pH：约7.0；氨水浓度：25%（v/v）；补料葡萄糖浓度：80%（w/v）；残余葡萄糖：<2 g/L；搅拌转速：300 rpm；通气量：0.2 L/min；DO降至0时间：约8 h
2.7 胞内NADH/NAD+比值分析
在摇瓶发酵16 h收获细胞，用预冷PBS缓冲液洗涤，随后用专用裂解缓冲液快速裂解。接着，使用增强型NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8法，S0176S，碧云天生物技术，上海，中国）定量胞内NADH水平。NADH和NAD+浓度通过NADH标准曲线标准化，从而计算NADH/NAD+比值。
【数据】取样时间：摇瓶发酵16 h；洗涤液：预冷PBS；检测试剂盒：Enhanced NAD+/NADH Assay Kit（WST-8法，S0176S，碧云天）；标准化方式：NADH标准曲线
2.8 胞内ATP水平分析
在摇瓶发酵16 h收获细胞，用预冷PBS缓冲液洗涤，并用裂解缓冲液快速裂解。随后，使用基于荧光素酶的增强型ATP检测试剂盒S0027（碧云天生物技术，上海，中国），按照先前研究所述方法测定胞内ATP水平。ATP浓度通过ATP标准曲线标准化，以μmol/DCW表示。
【数据】取样时间：摇瓶发酵16 h；洗涤液：预冷PBS；检测试剂盒：Enhanced ATP Assay Kit S0027（碧云天）；标准化方式：ATP标准曲线；单位：μmol/DCW
2.9 PDH酶活分析
在摇瓶发酵16 h收获细胞，洗涤后……（原文节选至此结束）
【数据】取样时间：摇瓶发酵16 h；原文未详述后续步骤
研究结果
3.1 出发菌株的代谢工程改造以构建适配氧限制条件下自适应进化的底盘
在我们先前的研究中，构建了一株L-缬氨酸超产菌株VAL0，其通过两阶段发酵过程展现出高效生产L-缬氨酸的能力，性能与先前报道的VHY18菌株相似。具体而言，第一阶段发酵需要 aerobic 条件以促进细胞快速生长；随后在第二阶段氧限制发酵中，L-缬氨酸以高得率生产。尽管细胞生长与生产的解耦相比传统有氧发酵提高了L-缬氨酸得率，但两阶段发酵方法仍面临挑战，包括发酵周期延长和有氧细胞生长阶段得率相对较低。为解决这些问题，我们旨在采用自适应实验室进化（ALE）建立单阶段氧限制发酵过程，并减少前体丙酮酸经TCA循环的旁路消耗。然而，在进行ALE之前必须考虑几个关键问题。首先，为促进从有氧发酵向氧限制发酵的转变，必须阻断出发菌株中的乙酸合成途径。这是因为大肠杆菌在葡萄糖充足且厌氧或氧限制条件下培养时，固有地倾向于积累乙酸作为副产物。具体而言，编码丙酮酸脱氢酶的基因poxB、编码乙酸激酶的基因ackA、编码丙酸激酶的基因tdcD和编码磷酸乙酰转移酶的基因pta，在VAL0中被依次敲除，分别构建了菌株VAL01、VAL02、VAL03和VAL04。以VAL0为对照，在摇瓶发酵中比较了这些菌株在有氧条件下的发酵特性，结果如图1所示。如图1A所示，随着乙酸合成基因的依次敲除，乙酸积累逐渐减少。菌株VAL01-VAL04的乙酸效价逐渐降至4.8、3.5、2.4和1.5 g/L，分别比出发菌株VAL0低7.7%、32.7%、53.8%和71.2%。同时，相应的L-缬氨酸效价增至38.8、39.6、41.1和42.2 g/L，分别比出发菌株VAL0高0.3%、2.3%、6.2%和9.1%。这些菌株之间没有显著的生长损伤。上述结果表明，VAL04中乙酸合成基因的敲除显著减少了乙酸积累，同时通过保留原本会转化为乙酸的丙酮酸，增强了L-缬氨酸合成。
【数据】菌株：VAL0、VAL01、VAL02、VAL03、VAL04；敲除基因：poxB、ackA、tdcD、pta；乙酸效价：VAL01 4.8 g/L、VAL02 3.5 g/L、VAL03 2.4 g/L、VAL04 1.5 g/L；乙酸降幅：7.7%、32.7%、53.8%、71.2%；L-缬氨酸效价：38.8、39.6、41.1、42.2 g/L；L-缬氨酸增幅：0.3%、2.3%、6.2%、9.1%
微生物在厌氧或氧限制条件下普遍遇到的另一个关键问题是ATP供给不足和辅因子再生失衡。关于氧限制条件下L-缬氨酸的生物合成，需要经EMP途径提供充足ATP以保证细胞生长。由于在出发菌株VAL0构建过程中，L-缬氨酸合成的辅因子需求已从NADPH改为NADH，因此需要充足的NADH补充以实现高效L-缬氨酸合成。在EMP途径中，由基因gapA编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化3-磷酸甘油醛和NAD+转化为1,3-二磷酸甘油酸和NADH。随后，1,3-二磷酸甘油酸在基因pgk编码的磷酸甘油酸激酶催化下转化为3-磷酸甘油酸，生成一分子ATP。因此，我们进一步增强了gapA和pgk的表达，以获得更适应氧限制条件的L-缬氨酸微生物工作母机。在菌株VAL04中分别在Ptrc启动子下过表达pgk和gapA基因，构建了菌株VAL05（VAL04, rph::Ptrc-pgk）和VAL06（VAL04, rph::Ptrc-gapA）。比较了菌株VAL04、VAL05和VAL06的有氧摇瓶发酵特性，结果如图1B所示。菌株VAL05的L-缬氨酸效价和OD600分别为42.4 g/L和23.9，与对照菌株VAL04相比无显著差异。这表明pgk基因的过表达对L-缬氨酸生物合成或细胞生长没有实质性影响，可能是因为磷酸甘油酸激酶不是EMP途径中的限速酶。对于菌株VAL06，L-缬氨酸效价达到44.5 g/L，比对照菌株VAL04提高6.0%；但其细胞OD600降至20.0，比对照菌株下降16.7%。这一结果可能归因于gapA的过表达，可能提高了胞内NADH水平并增强了代谢驱动力，从而促进碳通量流向消耗NADH的L-缬氨酸生物合成途径。胞内NADH含量和NADH/NAD+比值的测定结果证实了这一推论（图S1）。因此，进入TCA循环的碳通量减少，进而损害了细胞生长，导致L-缬氨酸产量增加而生物量形成减少。换言之，由于NADH补充的增强，葡萄糖到L-缬氨酸的得率显著提高。因此，菌株VAL06被顺利制备为后续ALE实验的合适底盘。
【数据】菌株：VAL04、VAL05、VAL06；过表达基因：pgk、gapA；启动子：Ptrc；整合位点：rph；VAL05 L-缬氨酸效价：42.4 g/L；VAL05 OD600：23.9；VAL06 L-缬氨酸效价：44.5 g/L；VAL06效价增幅：6.0%；VAL06 OD600：20.0；VAL06 OD600降幅：16.7%
3.2 VAL06在氧限制条件下的自适应实验室进化
随后以VAL06为出发菌株进行氧限制条件下的ALE实验。具体而言，使用装满发酵培养基的密封试剂瓶为ALE创造氧限制环境（图2A）。以有限氧气作为选择压力，期望通过ALE获得改善的细胞生长和L-缬氨酸生产。每七天，将1 mL细胞培养物转移至另一个装满新鲜发酵培养基的100 mL试剂瓶中。经过上述连续传代培养六轮后，菌株表现出改善的生长性能。随后将进化培养物稀释并涂布于琼脂平板以分离单菌落。挑选的克隆在密封96孔板中于氧限制条件下培养20 h。结果如图2B所示。如图2B所示，进化菌株ALE1-1、ALE1-5、ALE1-23、ALE1-32、ALE1-33、ALE1-43、ALE1-45、ALE1-46和ALE1-47的OD600显著高于其他菌株，表明这些菌株可能获得了对氧限制条件的改善适应性。这些菌株随后进行氧限制摇瓶发酵，结果如图2C所示。如图2C所示，ALE1-1、ALE1-5、ALE1-23、ALE1-32、ALE1-33、ALE1-43、ALE1-45、ALE1-46和ALE1-47的L-缬氨酸效价分别为45.6、45.2、47.1、46.9、46.7、49.0、49.0、47.0和46.4 g/L；OD600值分别为19.2、20.7、19.3、19.8、18.9、19.4、20.0、18.5和18.5。与出发菌株VAL06相比，大多数进化菌株的L-缬氨酸产量增加，其中ALE1-43和ALE1-45改善最为显著。然而，仅ALE1-5和ALE1-45的OD600值高于对照菌株，其他菌株表现出不同程度的生长下降。尽管ALE1-5表现出显著改善的生长，但其L-缬氨酸产量没有显著提高。经过比较，ALE1-45在氧限制条件下表现出L-缬氨酸效价的显著增加和细胞生长的改善。由于本研究的目的是鉴定在氧限制条件下具有可存活细胞生长和增强生产性能的菌株……（原文节选至此结束）
【数据】ALE传代间隔：7天；传代体积：1 mL；传代次数：6轮；试剂瓶体积：100 mL；96孔板培养时间：20 h；进化菌株L-缬氨酸效价：ALE1-1 45.6 g/L、ALE1-5 45.2 g/L、ALE1-23 47.1 g/L、ALE1-32 46.9 g/L、ALE1-33 46.7 g/L、ALE1-43 49.0 g/L、ALE1-45 49.0 g/L、ALE1-46 47.0 g/L、ALE1-47 46.4 g/L；OD600：19.2、20.7、19.3、19.8、18.9、19.4、20.0、18.5、18.5
讨论与解读
在微生物细胞工厂构建中，追求高效价、高得率和高生产强度是实验室研究最常见的目標。但在实际工业应用中，高效价并非总是最优目标。例如，某些化学品溶解度低，效价过高会导致晶体析出，给下游纯化带来重大障碍。在这种情况下，较高的得率和生产强度配合适当的效价更为适用且经济高效。L-缬氨酸生产就是面临此类问题的典型过程，高效价往往伴随L-缬氨酸结晶问题。在此背景下，提高葡萄糖得率成为降低生产成本的关键瓶颈和主要关注点。由于有氧条件下TCA循环的作用，丙酮酸向TCA循环的分流一直是限制L-缬氨酸得率的主要因素。本研究中，在装满发酵培养基的密封瓶中对工程化L-缬氨酸生产菌株进行自适应进化，改善了氧限制条件下的细胞生长，并显著提高了葡萄糖到L-缬氨酸的得率。这表明“生存或死亡”压力构成了直接且高效的进化驱动力……（原文节选至此结束）
编译者解读：该研究的方法学价值在于将ALE与组学指导的逆向代谢工程串联：先在密封瓶中用氧限制作为选择压力富集生长优势突变，再通过比较基因组学和转录组学定位有益靶点并逐一回补验证，避免了盲目过表达。最终93.7 g/L效价、60.4%葡萄糖得率（理论值92.9%）和3.35 g/L/h生产强度的组合，在氧限制单阶段发酵中确实构成新标杆。局限在于ALE周期较长、密封瓶传代通量有限，且组学筛选到的靶点仍需逐个验证，工业化放大时氧限制条件下的传质与热管理仍是工程难题。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2027
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.05.011
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.05.011