来源：Systems-level analysis of 1,6-hexanediol stress response and tolerance engineering in Escherichia coli（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
1,6-己二醇（1,6-HDO）是聚合物与医药工业的重要平台化学品，但其毒性严重制约微生物高效生产。本研究以大肠杆菌KA-12 (AG1)为对象，通过转录组分析揭示1,6-HDO胁迫下能量代谢、硫代谢与氨基酸代谢的全局重编程，并利用ASKA全基因组过表达文库筛选获得93个耐受相关基因。其中rumA与yhbO共表达使菌体生物量达9.43，较对照提高2.61倍，为构建稳健的1,6-HDO细胞工厂提供了靶点与策略。
研究背景
1,6-HDO作为线性二醇，广泛用于聚酯、聚氨酯和涂料生产，工业需求持续增长。微生物合成1,6-HDO被视为传统化学合成的可持续替代路线，已有多项研究证实其在大肠杆菌中生产的可行性。然而，产物在胞内积累会对宿主产生固有毒性，损害细胞稳健性并限制生产效率。
醇类化学品通常通过多种胁迫响应抑制微生物生长，包括膜扰动、渗透失衡、氧化胁迫和胞内毒性物质积累。结构相关的短链二醇如1,2-丙二醇和2,3-丁二醇也表现出类似毒性模式。当前提升耐受性的工程策略主要依赖局部遗传改造（如膜工程、外排工程和全局调控因子工程）以及适应性实验室进化。针对1,6-HDO，也有研究提出通过外排工程降低胞内积累。但化学胁迫响应通常由复杂的调控与代谢网络支配，仅靠局部工程手段难以系统识别关键决定因子。因此，本研究结合转录组分析与全基因组功能筛选，系统解析1,6-HDO胁迫响应并挖掘耐受靶点。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
用于转录组分析和全基因组过表达筛选的菌株为大肠杆菌KA-12 (AG1)（表S1）。ASKA（A Complete Set of E. coli K-12 ORF Archive）文库由4123株菌组成，每株携带基于pCA24N的质粒，该质粒携带来自大肠杆菌K-12 W3110的开放阅读框（ORF），受IPTG诱导型T5/lac启动子控制[13]，用于耐受性筛选。空载pCA24N质粒作为对照。
关于培养基，LB培养基（用于菌株活化和种子培养）含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl；固体培养基另加20 g/L琼脂。M9基本培养基（用于生长抑制实验和耐受性筛选）含17.91 g/L Na₂HPO₄、2.72 g/L KH₂PO₄、1.07 g/L NH₄Cl和0.58 g/L NaCl，并补充0.4%（w/v）葡萄糖。丰富培养基（用于组合耐受性筛选）含20 g/L葡萄糖、10 g/L (NH₄)₂SO₄、5 g/L蛋白胨、23.13 g/L 3-吗啉丙磺酸（MOPS）钠盐、1.6 g/L MgSO₄·7H₂O、0.5 g/L KCl、2 g/L酵母提取物、0.3 g/L CaCO₃，以及微量元素包括0.08 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.3 g/L甲硫氨酸、0.07 g/L CuSO₄、0.01 g/L烟酰胺、0.03 g/L MnSO₄·H₂O、0.3 g/L苏氨酸、30 μg/L生物素、0.06 g/L维生素B1和0.03 g/L FeSO₄·7H₂O。pH用HCl或NH₄OH调节至7.0。含1,6-HDO的培养基通过向上述M9和丰富培养基中加入过滤灭菌的1,6-HDO至所需浓度（5、10、15、20 g/L）制备。
【数据】菌株：E. coli KA-12 (AG1)；文库：ASKA文库4123株；质粒：pCA24N；LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl；M9培养基：17.91 g/L Na₂HPO₄、2.72 g/L KH₂PO₄、1.07 g/L NH₄Cl、0.58 g/L NaCl、0.4%葡萄糖；丰富培养基：20 g/L葡萄糖、10 g/L (NH₄)₂SO₄、5 g/L蛋白胨、23.13 g/L MOPS钠盐等；1,6-HDO浓度：5、10、15、20 g/L；pH：7.0
2.2 1,6-HDO胁迫下大肠杆菌生长抑制曲线与存活率测定
将大肠杆菌KA-12 (AG1)的过夜种子培养物以初始OD₆₀₀为0.1接种至含不同浓度1,6-HDO（0、5、10、15、20 g/L）的培养基中。培养在含50 mL培养基的250 mL摇瓶中进行，37°C、200 rpm振荡培养24 h。每4 h取样一次，用分光光度计测定600 nm光密度（OD₆₀₀）以构建生长曲线。
对于细胞活力测定，取生长12 h后的培养物等分试样，用无菌水连续稀释至10²、10⁴和10⁶倍。然后，每个稀释度取100 μL涂布于LB琼脂平板，37°C培养24 h后计数菌落。存活率（%）按（含1,6-HDO平板上的菌落数/对照平板上的菌落数）×100%计算。
【数据】接种初始OD₆₀₀：0.1；1,6-HDO浓度：0、5、10、15、20 g/L；培养体积：50 mL/250 mL摇瓶；温度：37°C；转速：200 rpm；时间：24 h；取样间隔：4 h；稀释倍数：10²、10⁴、10⁶；涂布体积：100 μL；存活率公式：（含1,6-HDO平板菌落数/对照平板菌落数）×100%
2.3 转录组测序与数据分析
大肠杆菌KA-12 (AG1)在含15 g/L 1,6-HDO的M9培养基中培养18 h，以不含1,6-HDO的相同培养条件作为对照。细胞通过4°C、4000 rpm离心10 min收集，用预冷PBS洗涤两次，液氮速冻后于−80°C保存。样品送至上海欧易生物医学科技有限公司进行RNA提取、rRNA去除、cDNA合成、文库构建和Illumina测序。质控后，测序数据比对至大肠杆菌K-12 (AG1)参考基因组。差异表达基因（DEGs）使用DESeq2鉴定，标准为|log₂ FC| ≥ 1且校正P < 0.05。
【数据】1,6-HDO浓度：15 g/L；培养基：M9；培养时间：18 h；离心条件：4000 rpm、10 min、4°C；洗涤：预冷PBS两次；保存：−80°C；DEG标准：|log₂ FC| ≥ 1、校正P < 0.05
2.4 胞内ATP水平测定
大肠杆菌KA-12 (AG1)在含系列浓度1,6-HDO的M9培养基中培养18 h。细胞通过4°C、4000 rpm离心10 min收集，然后用预冷PBS洗涤两次。将细胞重悬至OD₆₀₀约为1，离心后，沉淀重悬于1 mL提取缓冲液中。细胞通过冰浴超声破碎（30%振幅，2 s开、1 s关脉冲，总计1 min）。裂解液于4°C、10,000 rpm离心10 min，上清液与500 μL氯仿涡旋混合。再次离心3 min后，收集上层水相。ATP浓度使用ATP检测试剂盒（Solarbio）在340 nm波长下测定，并根据标准曲线计算ATP浓度。
【数据】1,6-HDO浓度：系列浓度；培养基：M9；培养时间：18 h；离心条件：4000 rpm、10 min、4°C；重悬OD₆₀₀：约1；提取缓冲液体积：1 mL；超声条件：30%振幅、2 s开/1 s关、总计1 min；离心条件：10,000 rpm、10 min、4°C；氯仿体积：500 μL；检测波长：340 nm；试剂盒：Solarbio ATP检测试剂盒
2.5 胞内活性氧（ROS）水平测定
胞内ROS水平使用活性氧检测试剂盒（Beyotime，DCFH-DA法）测定。大肠杆菌KA-12 (AG1)在含系列浓度1,6-HDO的M9培养基中培养18 h。细胞通过4°C、4000 rpm离心10 min收集，用预冷PBS洗涤两次，重悬至OD₆₀₀为1.0。然后加入1 μL DCFH-DA（终浓度10 μM），混合物在37°C摇床中避光孵育1 h。孵育后，细胞用PBS洗涤两次以去除胞外探针，重悬于1 mL PBS中。荧光强度使用荧光分光光度计测定（激发波长：488 nm，发射波长：525 nm）。结果以每OD₆₀₀的相对荧光单位表示。
【数据】1,6-HDO浓度：系列浓度；培养基：M9；培养时间：18 h；离心条件：4000 rpm、10 min、4°C；重悬OD₆₀₀：1.0；DCFH-DA体积：1 μL；终浓度：10 μM；孵育条件：37°C、1 h、避光；激发波长：488 nm；发射波长：525 nm；试剂盒：Beyotime活性氧检测试剂盒
2.6 利用ASKA文库筛选1,6-HDO耐受基因
对于文库活化，向96孔浅孔板的每个孔中加入180 μL LB培养基（含34 μg/mL氯霉素），接种20 μL各培养物，然后在37°C恒温摇床中200 rpm培养8 h。
对于耐受基因的初筛，将活化的ASKA文库培养物以10%（v/v）接种量转移至新的96孔板中，每孔含180 μL M9培养基，补充15 g/L 1,6-HDO、34 μg/mL氯霉素和0.5 mmol/L IPTG，在37°C、200 rpm培养18 h。使用酶标仪测定OD₆₀₀，以空载pCA24N菌株为对照，选择OD₆₀₀显著高于对照的克隆作为阳性候选。
对于质粒提取和测序，将阳性克隆在含34 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上划线分离；挑取单菌落接种至5 mL LB肉汤（含34 μg/mL氯霉素）中培养12 h。使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，送至测序公司进行插入片段测序以鉴定过表达基因。
对于摇瓶复筛，将测序确认的候选基因重新转化至大肠杆菌KA-12 (AG1)，转化子在含50 mL M9培养基（补充15 g/L 1,6-HDO、34 μg/mL氯霉素和0.5 mmol/L IPTG）的250 mL摇瓶中培养18 h，之后测定OD₆₀₀以进一步验证耐受表型。
【数据】96孔板：180 μL LB培养基/孔、20 μL接种量；氯霉素：34 μg/mL；活化条件：37°C、200 rpm、8 h；初筛接种量：10%（v/v）；初筛培养基：M9 + 15 g/L 1,6-HDO + 34 μg/mL氯霉素 + 0.5 mmol/L IPTG；初筛条件：37°C、200 rpm、18 h；复筛体积：50 mL/250 mL摇瓶；复筛条件：18 h
2.7 组合基因的构建
以ASKA文库质粒为模板，设计特异性引物扩增目标基因（如yhbO、rumA等）。同时，使用引物pCA24N F/R从pCA24N空质粒扩增线性化载体片段。为了将第二个基因插入已含第一个基因的pCA24N质粒，使用同源重组试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit，诺唯赞，南京，中国）。连接产物转化至感受态细胞，转化子涂布于含氯霉素的琼脂平板。挑取单菌落，通过菌落PCR和测序验证，获得双基因共表达菌株。经测序确认的携带两个基因的质粒重新转化至大肠杆菌KA-12 (AG1)和大肠杆菌NT1003。转化子接种至含50 mL丰富培养基（补充15 g/L 1,6-HDO、34 μg/mL氯霉素和0.5 mmol/L IPTG）的250 mL摇瓶中。培养18 h后，测定OD₆₀₀以进一步验证耐受表型。
【数据】模板：ASKA文库质粒；目标基因：yhbO、rumA等；载体：pCA24N；引物：pCA24N F/R；重组试剂盒：ClonExpress II One Step Cloning Kit（诺唯赞）；抗生素：氯霉素；培养体积：50 mL/250 mL摇瓶；1,6-HDO浓度：15 g/L；IPTG浓度：0.5 mmol/L；培养时间：18 h；宿主：E. coli KA-12 (AG1)、E. coli NT1003
2.8 统计分析
DEGs的生物信息学分析：使用基因本体（GO）数据库（http://www.geneontology.org/）和京都[原文未详述]
【数据】数据库：GO数据库（http://www.geneontology.org/）；其余原文未详述
研究结果
3.1 1,6-HDO对细胞的抑制作用
为评估1,6-HDO对大肠杆菌KA-12 (AG1)的抑制作用，在不同1,6-HDO浓度（0–20 g/L）下培养细胞并监测生长性能。1,6-HDO对细胞生长表现出明显的浓度依赖性抑制作用（图1A）。在5 g/L时，细胞生长仅受轻微影响，最大生物量（OD₆₀₀, max）为2.75（对照的85.97%）。然而，将浓度提高至10 g/L和15 g/L时，OD₆₀₀, max分别显著降低至1.82和1.33，同时存活率分别降至88.15%和46.96%（图1B）。在20 g/L时，细胞生长几乎完全被抑制。此外，最大比生长速率（μmax）随1,6-HDO浓度增加而逐渐降低，从对照的0.47 h⁻¹降至5 g/L时的0.38 h⁻¹和10–15 g/L时的0.36 h⁻¹。而且，达到μmax的时间段从处理细胞的0–4 h偏移至1,6-HDO暴露下的4–8 h，表明1,6-HDO不仅降低了生长速率，还延长了大肠杆菌的滞后期（表S2）。其他醇类也报道了类似的浓度依赖性抑制作用[14]。值得注意的是，先前研究报道工程化大肠杆菌可实现高达14.5 g/L的1,6-HDO滴度[15]。这表明工业相关生产水平已接近强烈抑制细胞生长的浓度。因此，产物毒性是进一步提高1,6-HDO生物合成的主要制约因素。减轻产物抑制对于实现更高生产水平至关重要。
【数据】1,6-HDO浓度：0–20 g/L；5 g/L时OD₆₀₀, max：2.75（对照的85.97%）；10 g/L时OD₆₀₀, max：1.82，存活率：88.15%；15 g/L时OD₆₀₀, max：1.33，存活率：46.96%；20 g/L时生长几乎完全抑制；μmax：对照0.47 h⁻¹、5 g/L 0.38 h⁻¹、10–15 g/L 0.36 h⁻¹；达到μmax时间：对照0–4 h、1,6-HDO暴露4–8 h；工程化大肠杆菌1,6-HDO滴度：14.5 g/L
3.2 1,6-HDO胁迫响应的转录组分析
通过RNA-seq分析1,6-HDO添加对大肠杆菌转录组的影响。差异表达分析在1,6-HDO组相比对照组中鉴定出394个上调DEGs和385个下调DEGs（图2A）。KEGG通路富集分析显示，DEGs显著参与鞭毛组装、乙醛酸代谢和氨基酸代谢（图2B），这与先前报道乙醇胁迫下氨基酸代谢差异调控的结果一致[16]。为鉴定参与1,6-HDO响应的调控通路，GO功能注释分析将DEGs分为21个生物学过程条目、5个细胞组分条目和10个分子功能条目（图2C）。富集的条目大致可分为三大功能类别。第一，多个与能量代谢相关的条目显著富集，包括TCA循环、乙醛酸途径和ATP相关活性，表明胁迫条件下发生广泛的代谢重编程。第二，多个与细菌鞭毛、分泌系统、孔复合物和离子转运相关的条目富集，表明细胞结构和膜相关功能发生显著重塑。第三，DNA结合、未折叠蛋白结合和ATP依赖性蛋白折叠伴侣的富集指向蛋白质量控制和胁迫适应机制的激活。类似的功能响应在微生物适应乙醇和其他醇类胁迫中已有报道[7,9,17–20]。总体而言，这些发现表明细胞通过协调调控能量依赖过程、细胞结构适应和蛋白稳态相关功能来响应1,6-HDO胁迫。
【数据】DEGs：394个上调、385个下调；GO分类：21个生物学过程、5个细胞组分、10个分子功能；显著富集通路：鞭毛组装、乙醛酸代谢、氨基酸代谢
3.3 DEGs的功能分析
#### 3.3.1 能量代谢
细胞能量代谢在微生物适应环境胁迫中发挥核心作用[21]。在1,6-HDO胁迫下，转录组分析揭示TCA循环和乙醛酸支路基因上调，包括sucC、sucD、acnA、aceA和aceB，分别增加1.44、1.83、2.11、2.32和2.99倍（图3A）。能量代谢的类似增强在适应醇类和有机溶剂胁迫中已被广泛报道[22]。同时，与ATP消耗分子功能相关的基因下调，以减少其他细胞能量消耗。与这些转录变化一致，胞内ATP水平随1,6-HDO浓度从0增加至15 g/L而从0.79 μmol增至1.56 μmol（图3B）。总之，这些结果表明1,6-HDO胁迫伴随以TCA循环和乙醛酸支路为中心的代谢重编程，这可能有助于在胁迫适应期间维持细胞能量稳态[23,24]。
【数据】上调基因及倍数：sucC 1.44倍、sucD 1.83倍、acnA 2.11倍、aceA 2.32倍、aceB 2.99倍；胞内ATP：0 g/L时0.79 μmol、15 g/L时1.56 μmol
#### 3.3.2 硫代谢
转录组分析揭示硫相关GO条目显著富集，包括细胞对硫饥饿的响应、硫化合物代谢过程和铁硫簇组装（图2C）。具体而言，ssuA、ssuC、tauA、tauB和tauC的转录水平分别上调2.70、2.04、1.90、2.75和3.96倍（图3A）。在大肠杆菌中，ssuABC和tauABC操纵子编码烷基磺酸盐和牛磺酸的转运系统[25]，有助于硫同化和参与氧化胁迫防御的含硫化合物的生物合成[26]。为进一步评估1,6-HDO暴露下的氧化胁迫，测定了胞内ROS水平。如图3C所示，ROS水平在0至10 g/L 1,6-HDO范围内保持相对稳定，但在15 g/L时显著增加至对照的2.99倍。这些结果表明，硫代谢基因的上调可能有助于在中等胁迫下维持ROS稳态，而在较高1,6-HDO浓度下则发生过量ROS积累。类似ROS介导的毒性在其他醇类胁迫中也有报道[27,28]。
【数据】上调基因及倍数：ssuA 2.70倍、ssuC 2.04倍、tauA 1.90倍、tauB 2.75倍、tauC 3.96倍；ROS：0–10 g/L相对稳定、15 g/L为对照的2.99倍
#### 3.3.3 氨基酸代谢
相比之下，参与精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的基因在1,6-HDO胁迫下显著下调。具体而言，argABCDEGH、ilvBDEI和leuBC操纵子的转录水平下降约1至3倍（图3A）。氨基酸生物合成途径的类似抑制在大肠杆菌正丁醇和其他环境胁迫下已有报道[4,29]。为评估氨基酸限制是否导致生长抑制，在15 g/L 1,6-HDO胁迫下分别补充精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和谷氨酸。然而，没有任何补充剂显著改善细胞生长，仅对生长抑制提供边际缓解（图3D）。这些结果表明，1,6-HDO的影响不能通过补充单一或有限数量的氨基酸轻易补偿，而可能反映胁迫诱导的更广泛代谢扰动。总之，1,6-HDO胁迫触发大肠杆菌中主要涉及氧化胁迫、代谢重编程和运动调控的协调胁迫响应。具体而言，1,6-HDO胁迫与硫代谢激活和胞内ROS水平升高相关，表明氧化胁迫是其毒性的重要组成部分（图3A和C）。同时，细胞表现出TCA循环和乙醛酸支路激活以及胞内ATP水平升高（图3B），表明1,6-HDO胁迫诱导广泛的代谢重编程并改变细胞能量代谢。并行地，多个氨基酸生物合成途径下调，表明胁迫条件下氨基酸代谢受到扰动。此外，鞭毛组装和趋化性相关基因上调，暗示在不利环境条件下可能存在基于运动的适应性策略。
【数据】下调操纵子：argABCDEGH、ilvBDEI、leuBC（下降约1–3倍）；补充氨基酸：精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸（15 g/L 1,6-HDO下均无显著改善）；ROS：15 g/L时为对照2.99倍；ATP：15 g/L时1.56 μmol
3.4 耐受基因元件文库的筛选与功能分析
#### 3.4.1 耐受基因元件文库的筛选
为鉴定与1,6-HDO耐受相关的基因，在15 g/L 1,6-HDO条件下筛选ASKA过表达文库（图4A）。[原文节选至此，后续内容未详述]
【数据】筛选条件：15 g/L 1,6-HDO；文库：ASKA过表达文库；其余原文未详述
讨论与解读
本研究通过转录组分析和全基因组功能筛选，系统表征了大肠杆菌在1,6-HDO胁迫下的细胞响应与耐受决定因子。转录组结果揭示，1,6-HDO胁迫诱导显著的代谢重编程，特征为TCA循环、乙醛酸循环和硫代谢激活，伴随ATP和ROS水平升高，而氨基酸合成与代谢受到抑制。ASKA文库筛选鉴定出的耐受基因涉及大致重叠的功能类别，支持这些通路在胁迫适应中的相关性。转录组与筛选数据集的整合进一步揭示，胁迫响应通路与耐受决定因子部分重叠但不完全一致。这突出表明，某些有益功能在天然胁迫响应中未被完全激活，因此代表理性耐受工程的潜在靶点。此外，通过RumA-YhbO共表达成功增强耐受性，表明翻译和蛋白稳态的协调保护是提高溶剂胁迫下细胞稳健性的额外策略。总体而言，这项工作既提供了机制见解，也提供了工程化稳健1,6-HDO生产菌株的实用策略。
编译者解读
该研究采用"转录组解析+全基因组过表达筛选"的双轨策略，在1,6-HDO胁迫这一具体场景中实现了从机制认知到工程靶点的闭环。方法上的亮点在于ASKA文库覆盖4123个ORF，筛选通量足以捕获分散的耐受决定因子；而rumA与yhbO共表达使生物量提升2.61倍，提示翻译保真与蛋白稳态维护在溶剂胁迫下的协同价值。局限在于组合验证仅限双基因，且未在产1,6-HDO的工程菌株中直接测试耐受改造对产量的贡献。从合成生物学视角看，将耐受元件与生产途径解耦评估，再逐步叠加，是构建稳健细胞工厂的务实路径。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2027
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.07.012
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.07.012