来源：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the biosynthesis of indole-derived compounds（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
吲哚类化合物结构多样、生物活性广泛，在医药、农药和营养保健品领域应用前景广阔。本研究在酿酒酵母中构建了一个模块化微生物平台，以葡萄糖为底物从头合成多种吲哚类衍生物。核心产物吲哚-3-乙腈（IAN）产量达189.02 mg/L，并进一步实现了吲哚-3-甲醛（I3A，65.85 mg/L）、吲哚-3-羧酸（I3CA，13.95 mg/L）和3,3′-二吲哚甲烷（DIM，12.30 mg/L）的从头合成。该平台通过酶筛选、氧化还原伴侣优化、NADPH供应增强、内质网膜容量扩展、L-色氨酸可利用性提升及pH控制发酵等策略逐步优化，为复杂P450依赖型植物天然产物的微生物制造提供了概念验证。
研究背景
吲哚类衍生物在制药、农业和营养品行业中应用广泛。IAN带有腈基官能团，是合成抗癌药物——包括色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂——的重要中间体，同时可作为天然除草剂和环保型生物农药，用于防治杂草和松材线虫，还是有机发光二极管（OLED）等有机光电材料开发的关键前体。I3A具有高反应活性的醛基，是合成裸盖菇素及海洋来源抗癌生物碱isobatzelline C和batzelline C等高价值化合物的关键中间体，并通过激活芳香烃受体（AhR）表现出免疫调节、抗炎、抗菌和抗肿瘤活性。I3CA是合成托烷司琼等药物的重要前体。DIM是吲哚-3-甲醇（I3C）的天然二聚体，已临床用于复发性呼吸道乳头状瘤病和宫颈病变的辅助治疗。
尽管大肠杆菌已被广泛工程化用于高水平L-色氨酸生产，并作为吲哚衍生物生物合成的常用宿主，但酿酒酵母在重建含多个细胞色素P450酶的植物来源途径方面具有独特优势。作为真核宿主，酵母具备内质网膜系统、天然蛋白折叠机制和胞内氧化还原环境，与膜结合型植物P450酶及其还原酶天然兼容，有利于功能性表达和电子传递。本研究旨在建立酿酒酵母模块化平台，以葡萄糖为底物从头合成IAN及其下游吲哚类衍生物。
研究方法
培养基与化学试剂
LB培养基（5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl）用于质粒扩增。必要时添加终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素的抗生素。携带URA3、LEU2或HIS3选择标记的工程化酿酒酵母菌株在SD缺陷型固体培养基（SD-Ura、SD-Leu、SD-His）上筛选。用于URA3标记去除的平板含0.8 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）、20 g/L葡萄糖、6.7 g/L无氨基酸酵母氮源（YNB）、50 mg/L尿嘧啶、200 mg/L组氨酸和100 mg/L亮氨酸。酵母培养和摇瓶发酵在YPD培养基（10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖）或SD-Ura培养基中进行，温度30°C，转速220 rpm。用于DIM生物合成时，SD-Ura培养基额外补充1 g/L CaCO₃、6.78 g/L Na₂HPO₄和3 g/L KH₂PO₄。SD缺陷型培养基（SD-Ura、SD-Leu和SD-His）购自FunGenome（北京，中国）。5-FOA、尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和YNB等化学试剂购自Macklin（上海，中国）。L-色氨酸、IAOx、色醇、IAN、I3A、I3CA和DIM的分析标准品购自Macklin（上海，中国），I3C购自Sigma-Aldrich（北京，中国）。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl；抗生素浓度：100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素；5-FOA浓度：0.8 g/L；YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；培养温度：30°C；转速：220 rpm；DIM发酵补充：1 g/L CaCO₃、6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄
质粒与DNA操作
大肠杆菌DH5α感受态细胞（TransGen Biotech，北京，中国）用于质粒构建和扩增。酿酒酵母CEN.PK2-1D（MATα ura3-52 trp1-289 leu2-3112 his3Δ1 MAL2-8C SUC2）作为所有基因工程的亲本菌株。质粒pSP-GM2作为质粒构建的骨架载体。用于酵母基因组整合的多个已表征位点包括ADE2、X4、XII-2、XII-5、X2、X3、CAN1、GAL80、TES1、HO、LPP1、FAA1、FAA4和POX1。ARO8和ARO9的基因敲除采用CRISPR–Cas9技术。向导RNA（gRNA）序列使用在线工具（http://chopchop.cbu.uib.no）设计，列于表S1。gRNA表达质粒通过Golden Gate组装构建，方法如前所述[54]。本研究使用的所有菌株和质粒分别列于表S2和表S3。基因SCO7468从Streptomyces coelicolor A3(2)基因组DNA中扩增。表达盒PTEF1-SCO7468-TCYC1通过融合PCR使用TEF1启动子和CYC1终止子构建。CYP79B2、CYP79B3、CYP71A12、CYP71A13、ATR1、ATR2、CYP71B6、AtMSBP1和AtCYB5等基因从拟南芥cDNA中扩增。这些基因通过融合PCR与合适的启动子和终止子组装，生成表达盒如PTEF1-CYP79B2-TCYC1、PTEF1-CYP79B3-TCYC1、PPGK1-CYP71A13-TADH1、PTDH3-ATR1-TTDH3、PTDH3-ATR2-TTDH3、PTEF1-CYP71B6-TCYC1、PTEF1-AtMSBP1-TCYC1和PTDH3-AtCYB5-TTDH3。ZWF1、GND1、POS5、INO2、TRP1、TRP3、TRP4、TRP5和ARO1等基因从酿酒酵母基因组DNA中扩增。相应表达盒构建如下：PTDH3-ZWF1-TTDH3、PTEF2-GND1-TCYC1、PTEF1-POS5-TPGK1、PTEF1-INO2-TPGK1、PTDH3-TRP1-TTDH3、PADH1-TRP3-TADH1、PTDH3-TRP4-TTDH3、PPGK1-TRP5-TADH1和PTEF1-ARO1-TCYC1。aroL、aroG、trpE、yahK、yjgB、yqhD、dkgA和yeaE等基因从大肠杆菌基因组DNA中扩增。ADH2、ADH5和ADH6基因从酿酒酵母基因组DNA中扩增。用于还原酶筛选的质粒构建如下：pSP-GM2-ADH2、pSP-GM2-ADH5、pSP-GM2-ADH6、pSP-GM2-yahK、pSP-GM2-yjgB、pSP-GM2-yqhD、pSP-GM2-dkgA和pSP-GM2-yeaE。来自拟南芥的AtCYP71B6、来自毛果杨的CYP79D6V3、来自白芥的CYP79B1和来自Erythroxylum fischeri的CYP79D60经密码子优化以适应酿酒酵母表达。来自Isatis tinctoria的ItCYP71B6、来自花椰菜的BobCYP71B6、来自甘蓝的BocCYP71B6、来自甘蓝型油菜的BnCYP71B6和来自萝卜的RsCYP71B6从相应植物cDNA文库中扩增。每种酶与ATR1共表达，通过克隆至pSP-GM2载体生成用于体内活性筛选的质粒。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α、酿酒酵母CEN.PK2-1D；骨架质粒：pSP-GM2；整合位点：ADE2、X4、XII-2、XII-5、X2、X3、CAN1、GAL80、TES1、HO、LPP1、FAA1、FAA4、POX1；敲除基因：ARO8、ARO9；方法：CRISPR-Cas9、Golden Gate组装、融合PCR；其余：原文未详述
基因组修饰
酿酒酵母的基因组修饰采用CRISPR-Cas9和DNA组装方法进行。对于CRISPR-Cas9介导的基因敲入和敲除，供体DNA片段通过重叠延伸PCR构建。对于基因敲入，供体DNA由启动子、编码序列、终止子和靶向特定基因组位点的同源臂组成。对于基因敲除，供体DNA片段通过融合靶基因的上游和下游同源臂生成。供体DNA和相应的gRNA表达质粒通过电穿孔共转化至酵母感受态细胞。转化子通过菌落PCR和DNA测序筛选和验证。此外，采用DNA组装策略将多个基因表达盒同时整合至酵母基因组。每个表达盒包含启动子、目标基因和终止子，并与选择标记基因（LEU2或HIS3）及同源重组臂共组装。以菌株Y21的构建为例：制备六个DNA片段——PTEF1-CYP79B2-TCYC1、PTDH3-ATR1-TTDH3、PPGK1-CYP71A13-TADH1、LEU2选择标记、rDNA-up和rDNA-down。LEU2选择标记及rDNA位点的上下游同源区域从菌株CEN.PK2-1D基因组中扩增。这些片段通过电穿孔共转化至菌株Y17，使用先前报道的DNA组装方法[55]。转化子在SD-Leu平板上筛选，阳性克隆通过菌落PCR和DNA测序确认。所得菌株命名为Y21。
【数据】方法：CRISPR-Cas9、重叠延伸PCR、电穿孔、DNA组装；菌株：Y21（由Y17构建）；DNA片段数：6个；筛选平板：SD-Leu；验证方法：菌落PCR、DNA测序
定量实时PCR（qPCR）测定拷贝数
工程菌株中外源基因（CYP79B2、CYP71A13和CYP71B6）的整合拷贝数通过qPCR使用2−ΔCt方法测定。基因组DNA从菌株CEN.PK2-1D（阴性对照）、Y21和Y82的过夜培养物中提取，使用TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒（DP307，TIANGEN Biotech，北京，中国），按照制造商说明操作。qPCR使用2×Realab Green PCR Fast Mixture（Lambo Lide，南京，中国）进行。单拷贝基因ALG9作为内参，CEN.PK2-1D基因组DNA作为阴性对照[56]。进行熔解曲线分析以验证扩增特异性，所有反应设三个重复。每个目标基因的相对拷贝数计算如下：ΔCt = Ct(目标) − Ct(ALG9)，相对拷贝数 = 2−ΔCt [57,58]。qPCR所用引物列于表S5。
【数据】方法：qPCR、2−ΔCt法；试剂盒：TIANGEN DP307；荧光染料：2×Realab Green PCR Fast Mixture；内参基因：ALG9；阴性对照：CEN.PK2-1D；重复数：3；计算公式：ΔCt = Ct(target) − Ct(ALG9)，相对拷贝数 = 2−ΔCt
YqhD体外酶学 assay
纯化的YqhD用于体外酶活性测定。通过测量底物消耗速率评价纯化YqhD对I3A的催化活性。反应体系终体积1 mL，含0.5 mM NADPH、0.02–1.0 mM I3A、154 μg纯化YqhD和磷酸缓冲液（pH 6.0）。I3A溶于DMSO，不同底物浓度反应中DMSO终浓度保持一致。反应通过加入纯化YqhD启动，30°C孵育20 min。加入等体积甲醇终止反应。
【数据】NADPH浓度：0.5 mM；I3A浓度范围：0.02–1.0 mM；纯化YqhD用量：154 μg；缓冲液：磷酸缓冲液，pH 6.0；反应温度：30°C；反应时间：20 min；终止方法：等体积甲醇；溶剂：DMSO
摇瓶培养
菌株构建时，阳性克隆首先在含5 mL YPD或SD-Ura培养基的50 mL培养管中预培养，温度30°C，转速220 rpm，培养16 h。随后，种子培养物以2%（v/v）接种比例接种至含50 mL YPD或SD-Ura培养基的250 mL摇瓶中。培养物在30°C、220 rpm条件下孵育96 h。发酵结束后，测定所有样品的细胞密度和产物浓度。
【数据】预培养体积：5 mL；预培养时间：16 h；预培养温度：30°C；预培养转速：220 rpm；接种比例：2%（v/v）；发酵体积：50 mL；发酵容器：250 mL摇瓶；发酵温度：30°C；发酵转速：220 rpm；发酵时间：96 h
DIM的无细胞稳定性测定
DIM的无细胞稳定性在柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液中评价。（原文节选至此，后续内容未详述。）
【数据】缓冲液：柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液；其余：原文未详述
研究结果
IAN生物合成途径的构建与优化
IAN的生物合成以L-色氨酸为前体，由色氨酸N-羟化酶催化转化为IAOx，随后经IAOx脱水酶催化形成IAN（图2A）。鉴定高效的色氨酸N-羟化酶和IAOx脱水酶对于构建IAN从头生物合成途径至关重要。通过文献综述和数据库检索，我们鉴定了若干报道具有色氨酸N-羟化酶活性的酶，包括来自Streptomyces coelicolor A3(2)的黄素依赖型单加氧酶SCO7468，以及来自多种植物来源的细胞色素P450酶，如来自拟南芥的CYP79B2和CYP79B3 [35–37]、来自毛果杨的CYP79D6V3 [38]、来自白芥的CYP79B1 [39]和来自Erythroxylum fischeri的CYP79D60 [40]。此外，来自拟南芥的细胞色素P450酶CYP71A12和CYP71A13已被报道具有IAOx脱水酶活性 [31,41]。然而，这些酶在酿酒酵母中的催化效率尚未被系统比较。为比较这些候选酶的催化能力，我们在酿酒酵母中构建了IAN生物合成途径并评价了各种候选酶的性能。我们首先通过过表达TRP1基因（编码磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶）改善L-色氨酸生物合成。将PTDH3-TRP1表达盒整合至CEN.PK2-1D菌株的FAA1位点，获得菌株Y01。为筛选最优色氨酸N-羟化酶，将六种不同的候选酶分别与IAOx脱水酶CYP71A12及来自拟南芥的细胞色素P450还原酶（CPR）ATR1配对，然后整合至菌株Y01的ADE2位点，获得菌株Y11–16（补充信息在线表S1–S3）。结果显示色氨酸N-羟化酶的催化性能存在显著差异。其中，表达来自拟南芥CYP79B2的菌株Y15表现出最高的IAN滴度，达到27.38 mg/L（图2B）。发酵液中IAN的存在通过高效液相色谱（HPLC）（补充信息在线图S1和S2）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）（补充信息在线图S3）进一步确认。为筛选IAOx脱水酶，我们将菌株Y15中的CYP71A12替换为CYP71A13，生成菌株Y17。结果表明，携带CYP71A13的菌株Y17产生34.30 mg/L IAN，较Y15提高25%（图2C）。接下来，为筛选最优P450还原酶（CPR），我们选择了ATR1和ATR2——拟南芥的天然CPR，已被广泛用作异源宿主中重建P450的氧化还原伴侣 [42,43]。我们将菌株Y17中的ATR1替换为ATR2，获得菌株Y18。结果显示Y18产生16.65 mg/L IAN，表明滴度下降（图2C）。这些结果表明CYP79B2、CYP71A13和ATR1是IAN生物合成的最优候选酶。为进一步提高IAN产量，我们优化了外源生物合成途径中关键基因的表达水平。将CYP79B2、CYP71A13和ATR1的表达盒整合至菌株Y17的多拷贝rDNA位点，获得菌株Y21。qPCR分析确认CYP79B2和CYP71A13在菌株Y21的rDNA位点以约3–4个拷贝整合（补充信息在线表S4和S5）。IAN产量增至62.29 mg/L（图2D），较亲本菌株Y17提高81.6%。在此平台基础上，我们通过将额外的CYP79B2、ATR1和CYP71A13拷贝分别整合至菌株Y21的X2和X3位点，进一步优化基因表达，获得菌株Y31、Y32和Y33。如图2D所示，额外整合CYP79B2和ATR1未显著影响IAN产量，而增强菌株Y33中CYP71A13的表达导致产量达85.41 mg/L，较菌株Y21提高37%。此外，我们观察到除前体L-色氨酸（10.31 mg/L）外，其他中间体无明显积累，表明CYP79B2和CYP71A13的催化效率仍是IAN生物合成途径的限制因素。
【数据】菌株Y15 IAN滴度：27.38 mg/L；菌株Y17 IAN滴度：34.30 mg/L（较Y15提高25%）；菌株Y18 IAN滴度：16.65 mg/L；菌株Y21 IAN滴度：62.29 mg/L（较Y17提高81.6%）；菌株Y33 IAN滴度：85.41 mg/L（较Y21提高37%）；L-色氨酸积累：10.31 mg/L；CYP79B2/CYP71A13拷贝数：约3–4个；检测方法：HPLC、LC-MS
增强细胞色素P450酶催化活性以提高IAN滴度
为增强生物合成途径中细胞色素P450酶的催化效率，我们首先尝试改善胞内NADPH水平以确保辅因子充足供应。NADPH主要通过磷酸戊糖途径的氧化分支产生，其中ZWF1（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）和GND1（6-磷酸葡糖酸脱氢酶）催化两个关键的NADPH生成脱氢步骤（图3A）。POS5编码NADH激酶，促进NAD(H)向NADP(H)的转化，从而增强NADPH再生（图3A）。我们将ZWF1和GND1整合至菌株Y33，生成菌株Y41。发酵结果表明Y41中IAN产量略有增加，达到96.20 mg/L（图3B）。当POS5进一步整合至Y41时，所得菌株Y42产生92.96 mg/L IAN，与对照菌株相比无显著改善（图3B）。接下来，我们旨在通过改善电子传递效率进一步增强细胞色素P450催化效率。细胞色素b5（CYB5）是一种含血红素的电子传递蛋白，已被报道通过促进电子从NADPH-CPR向P450的传递及稳定生产性P450–CPR相互作用，增强多种微粒体细胞色素P450酶的催化效率 [44]。因此，我们共表达来自拟南芥的AtCYB5以改善CYP79B2和CYP71A13的活性。如预期，菌株Y43产生105.30 mg/L IAN，较对照菌株提高13.3%（图3B），表明增强电子传递有助于改善P450催化性能。由于细胞色素P450酶锚定于内质网（ER）膜，我们假设增加ER表面积可为P450酶提供更多锚定空间，从而改善其催化性能。为验证此假设，我们过表达脂质生物合成转录激活因子INO2并敲除脂质生物合成转录抑制因子OPI1，分别生成菌株Y51和Y52。如图3C所示，菌株Y51中INO2过表达导致IAN产量略有下降，为95.02 mg/L。然而，菌株Y52中OPI1敲除成功将IAN产量提高至125.19 mg/L（图3C），较菌株Y43提高19%。此外，有报道称来自拟南芥的支架蛋白AtMSBP1可调节细胞色素P450酶在ER的定位，从而缩短P450酶之间的空间距离并可能增强其催化效率 [45]。基于此，我们将AtMSBP1引入菌株Y52生成菌株Y53。然而，Y53中IAN滴度未显示显著改善，为112.63 mg/L（图3C），表明该策略对IAN生物合成无明显效果。此外，我们观察到途径中间体无积累，表明前体L-色氨酸供应不足是目前IAN生物合成途径的限速步骤。
【数据】菌株Y41 IAN滴度：96.20 mg/L；菌株Y42 IAN滴度：92.96 mg/L；菌株Y43 IAN滴度：105.30 mg/L（较对照提高13.3%）；菌株Y51 IAN滴度：95.02 mg/L；菌株Y52 IAN滴度：125.19 mg/L（较Y43提高19%）；菌株Y53 IAN滴度：112.63 mg/L；NADPH相关基因：ZWF1、GND1、POS5；电子传递蛋白：AtCYB5；ER工程：INO2过表达、OPI1敲除、AtMSBP1
提升L-色氨酸可利用性以提高IAN产量
为进一步提高IAN产量，有必要加强前体L-色氨酸的供应。为克服酿酒酵母中L-色氨酸生物合成途径的反馈抑制，我们将编码抗反馈邻氨基苯甲酸合酶组分I的大肠杆菌基因trpE^fbr整合至菌株Y52基因组，获得菌株Y61。此外，我们尝试……（原文节选至此，后续内容未详述。）
【数据】菌株：Y61（由Y52构建）；整合基因：trpE^fbr（大肠杆菌）；其余：原文未详述
讨论与解读
尽管大肠杆菌已被广泛工程化用于高水平L-色氨酸生产，并作为吲哚衍生物生物合成的常用宿主，但酿酒酵母在重建含多个细胞色素P450酶的植物来源途径方面具有独特优势。作为真核宿主，酵母具备内质网膜系统、天然蛋白折叠机制和胞内氧化还原环境，与膜结合型植物P450酶及其相关还原酶天然兼容。这些特征极大促进了功能性表达和电子传递，而这在细菌宿主中仍是主要挑战。相比之下，酿酒酵母相对较低的L-色氨酸生产能力可通过代谢工程弥补。本研究中，莽草酸途径的增强、抗反馈邻氨基苯甲酸合酶的引入以及Ehrlich途径的减弱大幅提高了前体可利用性，实现了IAN及其下游衍生物的从头生产。这些结果凸显了前体供应与异源酶兼容性之间的权衡，并证明酿酒酵母是构建复杂P450依赖型吲哚生物合成途径的合适底盘。尽管本研究中实现的IAN滴度（189.02 mg/L）低于酿酒酵母中生产的相对简单芳香族化合物（如对香豆酸[47]）的报道值，但直接比较……（原文节选至此，后续内容未详述。）
编译者解读：该研究以酿酒酵母为底盘，通过模块化策略逐步打通了从葡萄糖到IAN及下游I3A、I3CA、DIM的合成途径。最值得关注的是其绕开植物复杂硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统、以人工途径合成DIM的思路——这为高价值天然产物的"最小化重建"提供了范例。不过，P450氧化步骤仍是限速瓶颈，上游中间体积累和DIM发酵不稳定性提示催化效率与过程稳定性有待突破。当前TRL 3的概念验证距离工业化仍有距离，后续需在P450表达、电子传递和底物转化效率上持续发力。
参考来源
期刊：Trends in Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.09.006
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.09.006