来源：Rational design of IsPETase variant toward efficient poly(ethylene terephthalate) ambient degradation（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）废弃物的环境积累构成严峻生态威胁。现有高性能PET降解酶多为嗜热酶，需在65 °C以上高温操作，能耗巨大。本研究基于前期工程化的常温IsPETase^S121P/D186A^（PA），通过盐桥构建与疏水工程等理性设计手段，获得组合变体PADFL（IsPETase^S121P/D186A/N246D/Y87F/N233L^），其PET降解效率较PA提升8.37倍，较野生型IsPETase提升56.52倍。分子动力学模拟揭示了增强的PET结合亲和力、氢键网络及降低的酰化能垒。该变体为温和温度下高效PET降解提供了有前景的候选酶。
研究背景
全球塑料消费持续攀升，塑料污染已成为紧迫的全球性问题。据估计，到2040年将有约7.1亿吨不可回收塑料废物进入水生和陆地生态系统，给生态系统带来严重且日益加重的负担。在各类塑料中，PET的碳足迹最高，每千克PET薄膜产生高达4.5千克CO₂，其回收具有重要的资源与环境意义。
生物降解是PET回收的有前景策略，目前已通过多种工程化嗜热PET酶实现。这些过程中，操作温度通常较高（>65 °C，接近PET的玻璃化转变温度），以实现最佳性能——高温下PET链迁移率增加、酶可及性提高。然而，嗜热策略需要大量能量输入，这对大规模PET回收而言是额外的考量因素。因此，开发在更温和、节能温度下具有高活性的PET水解酶，可能为节能型集中式PET废物处理提供潜在路径。
IsPETase是来自Ideonella sakaiensis 201-F6的广泛研究的PET降解酶，因其在常温条件下即可降解PET而受到广泛关注。本研究基于前期工程化的常温IsPETase^S121P/D186A^，通过理性设计提升其在相对低温下的PET降解活性。
研究方法
2.1 材料
低结晶度PET（lcPET，结晶度7.8%）购自Goodfellow有限公司（中国上海）。TPA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（BHET）和单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（MHET）由Meryer（上海）化学技术有限公司提供。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）由广州赛国生物科技有限公司提供。氨苄青霉素（Amp）由Gen-view Scientific公司提供。高亲和力Ni-NTA树脂由GenScript公司提供，BCA蛋白检测试剂盒购自Solarbio（北京）科技有限公司。所有化学品均按收到状态使用。
【数据】lcPET结晶度：7.8%；试剂来源：Goodfellow、阿拉丁、Meryer、Solarbio等；所有化学品按收到状态使用
2.2 质粒与菌株
PA变体在前期工作中构建（Yin et al., 2024），克隆至pET22b载体，带6×His标签用于蛋白纯化。引物由Genewiz（中国苏州）合成（表S1）。变体使用Fast Mutagenesis System（TransGen，北京，中国）以PA质粒为模板构建。所得基因克隆至pET22b载体，该载体携带C端六聚组氨酸标签编码序列用于蛋白纯化。大肠杆菌DH5α电感受态细胞按标准电穿孔方案转化，随后所有质粒经测序验证（Genewiz，苏州，中国）。
【数据】载体：pET22b；标签：6×His（C端）；突变方法：Fast Mutagenesis System；感受态细胞：E. coli DH5α；验证方式：测序
2.3 蛋白合成与纯化
大肠杆菌BL21 (DE3)购自TransGen Biotech（北京，中国）。载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，在含Amp的LB琼脂平板上过夜培养。所有细胞在LB培养基中、37 °C、220 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.8–1.0，然后用1 mM IPTG诱导基因表达，培养物在16 °C继续孵育24 h。随后通过离心（8000g，10 min，4 °C）收集细胞，重悬于缓冲液A（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5），高压匀浆破碎。离心（10,000g，30 min，4 °C）去除细胞碎片后，上清液加载至Ni-NTA Sepharose树脂（GE Healthcare）。结合蛋白用含20 mM咪唑的缓冲液A洗涤，用含300 mM咪唑的缓冲液A洗脱，然后在缓冲液B（50 mM Na₂HPO₄-HCl，pH 7.0）中浓缩至10 mg mL⁻¹。所有纯化步骤在4 °C进行。蛋白纯度通过SDS-PAGE评估，浓度使用BCA蛋白检测试剂盒（Solarbio，北京）测定（Yin et al., 2022; Zhou et al., 2024）。
【数据】菌株：E. coli BL21 (DE3)；培养基：LB；温度：37 °C（培养）、16 °C（诱导表达）；转速：220 rpm；OD₆₀₀：0.8–1.0；IPTG浓度：1 mM；诱导时间：24 h；离心条件：8000g/10 min/4 °C、10,000g/30 min/4 °C；缓冲液A：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5；洗涤咪唑：20 mM；洗脱咪唑：300 mM；缓冲液B：50 mM Na₂HPO₄-HCl、pH 7.0；浓缩浓度：10 mg mL⁻¹；纯化温度：4 °C
2.4 PET水解活性分析
使用lcPET薄膜分析PET水解酶的水解性能。PET薄膜（Ø = 6 mm）浸泡在300 μL甘氨酸-NaOH（pH 7–11，200 mM）缓冲液中，含500 nM酶，温度34–50 °C。从PET释放的主要可溶性单体（BHET、MHET和TPA）通过HPLC（Agilent Technologies 1200 Series）定量，配备ZORBAX Eclipse Plus C18反相柱（分析型，4.6 × 250 mm，5-µm），柱温30 °C。流动相由缓冲液A（0.1%甲酸水溶液）和缓冲液B（乙腈）组成，流速0.8 mL min⁻¹，20 min内从95%到30%缓冲液A梯度洗脱（Joo et al., 2018）。TPA、MHET和BHET在240 nm检测，保留时间分别为12.2、12.7和13.0 min（Yin et al., 2022; Zhou et al., 2025）。为确保准确性和可靠性，所有测试一式三份进行。
【数据】底物：lcPET薄膜（Ø = 6 mm）；缓冲液：甘氨酸-NaOH（200 mM，pH 7–11）；酶浓度：500 nM；温度：34–50 °C；HPLC柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 × 250 mm，5-µm）；柱温：30 °C；流动相：0.1%甲酸水溶液/乙腈；流速：0.8 mL min⁻¹；梯度：95%→30%缓冲液A/20 min；检测波长：240 nm；保留时间：TPA 12.2 min、MHET 12.7 min、BHET 13.0 min；重复次数：一式三份
2.5 消费后PET废物的解聚
消费后PET蛋糕容器（结晶度10.4%）和PET窗帘（结晶度29.8%）切割至约0.5 cm × 0.5 cm大小。然后将PET样品（10 g/L）浸泡在10 mL甘氨酸-NaOH（200 mM，pH = 9.5）缓冲液中，含500 nM PET水解酶，温度45 °C。每12 h取300 μL样品检测PET降解产物，采用与前述相同的PET降解产物检测方法。
【数据】底物：PET蛋糕容器（结晶度10.4%）、PET窗帘（结晶度29.8%）；尺寸：约0.5 cm × 0.5 cm；底物浓度：10 g/L；缓冲液体积：10 mL；缓冲液：甘氨酸-NaOH（200 mM，pH = 9.5）；酶浓度：500 nM；温度：45 °C；取样间隔：每12 h；取样体积：300 μL
2.6 熔解温度测定
熔解温度使用基于荧光的热稳定性测定法确定。蛋白与SYPRO Orange染料（Molecular Probes, Life Technologies, USA）的混合物转移至薄壁96孔PCR板，然后在实时PCR系统（Applied Biosystems QuantStudio 5, Thermo Fisher Scientific Inc.）中进行温度循环，从25 °C加热至100 °C，速率1.4 °C/min。
【数据】染料：SYPRO Orange；仪器：Applied Biosystems QuantStudio 5；温度范围：25–100 °C；加热速率：1.4 °C/min；板型：薄壁96孔PCR板
2.7 材料表征
PET样品的表面形貌使用Hitachi Regulus 8100场发射扫描电子显微镜（SEM）和Hitachi S4800场发射SEM观察。PET的结晶度使用差示扫描量热法（DSC）Q2000系统测量。2 mg PET样品在0 °C平衡1 min，以10 °C min⁻¹加热至300 °C，在300 °C保持1 min，然后以10 °C min⁻¹冷却至0 °C，所有测量在氮气气氛下进行。结晶度使用以下公式计算：
(1) X_c-DSC% = (ΔH_m - ΔH_c) / ΔH_m⁰ × 100%
其中ΔH_m为样品的熔融焓值（J·g⁻¹），ΔH_c为样品的冷结晶焓（J·g⁻¹），ΔH_m⁰为100%结晶PET的熔融焓（140.1 J·g⁻¹）。
【数据】SEM仪器：Hitachi Regulus 8100、Hitachi S4800；DSC仪器：Q2000；样品量：2 mg；平衡条件：0 °C/1 min；加热速率：10 °C min⁻¹；加热终点：300 °C；保持时间：1 min；冷却速率：10 °C min⁻¹；冷却终点：0 °C；气氛：氮气；ΔH_m⁰：140.1 J·g⁻¹
2.8 酶动力学研究
由于PET是不溶性底物，传统Michaelis-Menten（MM）方程不适用。因此，采用逆向MM方程计算酶动力学参数并研究酶-底物亲和力（Kari et al., 2017）。反应体系含200 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.5）、8 mg无定形PET薄膜和不同浓度的PET水解酶（50 nM、150 nM、300 nM、600 nM、900 nM、1200 nM和1500 nM），包括PADFL和PA，在各自最优条件下反应。具体而言，PADFL反应温度设为45 °C，亲本PA为40 °C。反应进行3 h、6 h、9 h、12 h和24 h以计算初始反应速率。反应后，产物浓度使用前述HPLC方法测定。逆向MM方程定义为：
(12) v = inv_V_max × E₀ / (K_m + E₀)
其中inv_V_max为最大速率，K_m和酶浓度（E）以摩尔单位表示，下标"0"标识初始（或总）值。逆向最大速率定义为（Kari et al., 2017）：
(23) inv_V_max = k_cat × kin_Γ_max × mass_S₀
其中k_cat为反应正向路径中最慢的一级速率常数；kin_Γ_max为攻击位点密度；mass_S₀为底物载量（g/L），在不溶性底物实验中通常已知。
【数据】缓冲液：200 mM甘氨酸-NaOH（pH 9.5）；底物：8 mg无定形PET薄膜；酶浓度梯度：50、150、300、600、900、1200、1500 nM；PADFL反应温度：45 °C；PA反应温度：40 °C；反应时间点：3、6、9、12、24 h；检测方法：HPLC
2.9 分子动力学模拟
关于理性设计，我们构建了4PET（MHET四聚体）作为模型底物，并通过分子对接获得酶/4PET复合物结构。酶突变体通过突变PA（PDB ID: 8J17）获得，然后通过DSDP程序（Huang et al., 2023）将4PET结构对接至结合口袋（SHD三联体周围1.0 nm边距），选择结合亲和力最高的结合构象。4PET的拓扑结构由Sobtop 1.0(dev3.2)程序（sobereva.com/soft/Sobtop）生成，使用RESP2(0.5)电荷（Schauperl et al., 2020）。然后使用Gromacs 2024.1软件（Abraham et al., 2015）和Amber ff14SB力场（Maier et al., 2015）进行MD模拟。各系统分别居中于边距1.2 nm的盒子中，填充TIP3P水（Jorgensen et al., 1983）。然后向系统中插入0.15 M Na⁺和Cl⁻离子以实现电荷中和。每个系统随后在能量最小化阶段用2000步最速下降法最小化，然后在恒压恒温（NPT）下以2 fs时间步长进行100 ns生产阶段。非键相互作用使用1.0 nm截断值，平滑...
【数据】模型底物：4PET（MHET四聚体）；酶结构：PA（PDB ID: 8J17）；对接程序：DSDP；结合口袋边距：1.0 nm；拓扑生成：Sobtop 1.0(dev3.2)；电荷模型：RESP2(0.5)；MD软件：Gromacs 2024.1；力场：Amber ff14SB；水模型：TIP3P；盒子边距：1.2 nm；离子浓度：0.15 M Na⁺/Cl⁻；能量最小化：2000步最速下降；生产阶段：100 ns；时间步长：2 fs；系综：NPT；非键截断：1.0 nm
研究结果
3.1 PA的理性设计以增强催化活性
首先，我们将底物建模为四个重复PET单元（4PET），并通过分子对接分析酶-底物结合构象（图1a）。PA/4PET复合物结构揭示，结合裂口末端的Arg280残基表现出显著的空间位阻，影响酶-底物结合并限制PET水解活性，与先前报道的发现一致（Joo et al., 2018）。鉴于正电荷Arg280与相邻Asn246残基之间的接触（图S1），以及柔性Arg280侧链已被报道可通过与N246D形成盐桥稳定为单一构象，从而增强热稳定性（Son et al., 2020），我们引入N246D突变构建表面盐桥，该策略已在我们前期工作的另一突变体中得到验证（Yin et al., 2022）。MD模拟也可视化了R280-D246盐桥（图S2），稳定了酶结构。此外，N246D突变体（PAD）的PET水解活性较PA提高1.51倍（图1b），作为工程改造的起点。
【数据】底物模型：4PET；关键残基：Arg280、Asn246；突变：N246D；PAD活性提升：1.51倍（vs PA）
接下来，在获得改进的PAD变体后，我们应用了整合MD模拟、结合能计算和理性设计的工程流程，旨在增强催化活性以促进高效PET水解（图2a）。对PAD/4PET进行MD模拟后，我们计算了结合裂口残基的能量贡献以识别潜在功能残基（图2b和图S3）。我们靶向底物结合裂口内的关键残基（与底物距离<3 Å），选择性引入疏水突变以改善疏水性PET底物与PAD的结合亲和力。在4PET底物周围3 Å范围内的21个残基中，11个残基的结合能<−2 kcal/mol，被鉴定为可能影响酶-底物相互作用的关键残基。然后将极性残基（Y87、S93、N233、G235、S238、N241、N244）突变为疏水性A/L/F以增强PAD对PET的可及性。值得注意的是，重组蛋白表达纯化后进行PET水解活性测试，通过结合裂口的疏水修饰鉴定出Y87F和N233L为有益变体，其PET水解活性分别较PAD提高1.77倍和1.13倍（图2c）。同时，PAD-N233L（PADL）的T_m值提高2.6 °C（图S4），表明对PET水解酶稳定性有益。尽管本研究的主要目标是在温和温度条件下增强PET水解活性而非热稳定性，但T_m的增加与疏水取代引入的底物结合裂口局部相互作用增强一致，可视为该设计的有益副产物。因此，基于结合能的裂口残基工程优化了酶对疏水性底物的适应性并增强了水解效率。
【数据】靶向残基：底物周围3 Å内21个残基；关键残基：11个（结合能<−2 kcal/mol）；突变残基：Y87、S93、N233、G235、S238、N241、N244→A/L/F；有益变体：Y87F（1.77倍）、N233L（1.13倍）；PADL的T_m提升：2.6 °C
3.2 组合变体的构建与表征
为进一步增强单突变体的水解活性，我们组合了阳性突变，最终获得了IsPETase的组合变体（图3a，表S2）。通过组合阳性突变体Y87F和N233L（图2c），我们获得了PA的N246D/Y87F/N233L变体（PADFL），活性显著提高，较PA表现出8.37倍PET水解活性和5.3 °C的T_m值提升。此外，与野生型IsPETase相比，PADFL的PET水解活性提高了56.52倍。然后我们将有益变体与先前报道的PET水解酶及变体在不同温度下进行比较（图3c）。与IsPETase、PA、DuraPETase（Cui et al., 2021）、TfCUT2（Herrero Acero et al., 2011）、LCC（Sulaiman et al., 2012）、FAST-PETase（Lu et al., 2022）、HotPETase（Bell et al., 2022）和BhrPETase（Xi et al., 2021）相比，变体PADFL表现出优越的PET水解性能，其PET水解活性高于FAST-PETase（Lu et al., 2022）。同时，另一变体PA-N246D/Y87F（PADF）在40 °C具有有效的PET水解活性，显示出在中等pH和温和温度下的潜在PET降解能力。
【数据】组合变体：PADFL（N246D/Y87F/N233L）；PADFL活性提升：8.37倍（vs PA）、56.52倍（vs 野生型IsPETase）；T_m提升：5.3 °C（vs PA）；比较对象：DuraPETase、TfCUT2、LCC、FAST-PETase、HotPETase、BhrPETase；PADF活性温度：40 °C
为确定有益变体的最优反应条件，我们比较了有益变体在30至50 °C范围内的PET水解活性。有趣的是，PADFL在45 °C表现出最高的PET降解活性，这可能归因于N233L引入的增强稳健性（图3b）。同时，PADFL似乎在45 °C达到催化活性与热稳定性的最佳平衡，导致降解效率显著增加。这与酶表观最适温度（T_opt）的偏移一致。酶活性-温度曲线通常先升后降，活性随温度升高而增加，直至热变性开始超过反应速率的增益。改善酶的结构稳定性通常使该最适温度上移，因为酶在展开前能承受更高温度。类似模式——即更热稳定的变体在热稳定性与催化活性达到最佳平衡后表现出不成比例的大活性增益——也已在TurboPETase相对于其他工程化PET水解酶中报道（Cui et al., 2024）。
【数据】温度范围：30–50 °C；PADFL最适温度：45 °C；T_opt偏移：与N233L增强稳健性相关
3.3 高活性变体的酶动力学
Michaelis-Menten模型通常用于反映酶活性（k_cat）、底物结合亲和力（K_m）和催化特异性（k_cat/K_m）。然而，对于不溶性PET固体，经典Michaelis-Menten模型应改造为逆向Michaelis-Menten模型以评估动力学参数（图S5、S6，表1）（Kari et al., 2017）。PADFL表现出较高的K_m为826.65 nM，而PA为311.83 nM，表明底物亲和力相对降低。这与Sabatier原理一致（Kari et al., 2018），即最优催化发生在中等酶-底物相互作用强度下，足以稳定底物和过渡态而不提高反应能垒。同时，根据逆向Michaelis-Menten模型中inv_V_max的定义（eq. 3），inv_V_max反映催化周转率（k_cat）和定位底物表面攻击位点的能力（kin_Γ_max）。PADFL的inv_V_max/mass_S₀为215.94 μM h⁻¹ mg⁻¹，显著高于PA（92.75 μM h⁻¹ mg⁻¹），表明该变体既具有更快的周转，又能更有效地识别和结合底物表面的可攻击位点，从而增强整体催化效率。
【数据】K_m：PADFL 826.65 nM、PA 311.83 nM；inv_V_max/mass_S₀：PADFL 215.94 μM h⁻¹ mg⁻¹、PA 92.75 μM h⁻¹ mg⁻¹
3.4 PADFL增强催化活性的分子机制
为阐明PADFL增强催化性能和热稳定性的机制，我们使用MD模拟分析分子基础。首先，对apo PA和PADFL进行40 ns MD模拟，研究均方根涨落（RMSF），揭示PADFL中含活性位点Asp206的环区（Glu204～Pro210）柔性显著增强（图4a），这可能增加PET结合裂口的柔性，从而对PET底物催化有利。沿PET结合裂口增强的柔性可能提高多样攻击构象的概率，这在不同表面结构上形成催化 competent复合物中可能起关键作用（Cui et al., 2024）。同时，PADFL中Arg280的RMSF显著降低可归因于Arg280与Asp246之间构建的盐桥（图4b）...
【数据】MD模拟时长：40 ns；关键区域：Glu204～Pro210环区（含Asp206）；关键残基：Arg280、Asp246；盐桥：R280-D246
讨论与解读
本研究采用理性设计工程化IsPETase变体PA。通过残基能量分解识别关键残基并结合疏水突变，提升了其PET降解性能。所得变体PADFL（IsPETase^S121P/D186A/N246D/Y87F/N233L^）在45 °C下PET水解活性较亲本酶提高8.37倍，较野生型IsPETase提高56.5倍，凸显其作为温和温度条件下PET降解候选酶的潜力。MD模拟揭示，与PA相比，PADFL具有增强的氢键网络、缩短的质子转移距离和降低的反应能垒，从而保持更有效的PET降解效率。虽然此前的PET水解酶工程靶向整体刚性、环构象和结合口袋重排（Han et al., 2026; Liu et al., 2024b; Liu et al., 2022; Zheng et al., 2023），本工作聚焦于底物结合裂口的疏水修饰，直接靶向控制底物相互作用的局部相互作用。总体而言，我们的结果证实优化后的PADFL在温和反应条件下表现出可观活性，为未来开发适用于常温应用的PET水解酶提供了有前景的起点，尽管还需在真实环境条件下进一步评估以确定其实际适用性。
编译者解读：该研究展示了基于能量计算的理性设计在PET水解酶改造中的高效性——仅通过盐桥构建与少数疏水位点突变，即实现8.37倍活性提升。PADFL在45 °C的优异表现填补了常温PET酶与嗜热酶之间的性能空白，有望降低PET生物回收的能耗成本。然而，该变体对高结晶度消费后PET的实际降解效率、长期操作稳定性及规模化生产成本仍需验证。未来可结合机器学习辅助的多位点组合策略进一步突破活性-稳定性权衡瓶颈。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135499
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135499