来源：Rational design of high-productivity perfusion processes for CHO Cells: From growth inhibitory strategies to model-driven optimization（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
灌流培养能实现连续生产和极高细胞密度，但持续快速增殖的细胞难以进入高比产率状态，且细胞放血造成产物损失。本研究系统比较了低细胞比灌流率（CSPR）、丁酸钠和温和低温三种生长抑制策略对CHO细胞生长、代谢、产率和质量的影响，结合基因组尺度代谢通量采样揭示了低CSPR与丁酸钠趋同上调能量代谢的机制，并据此建立含参数不确定性的生长动力学模型，指导设计出两种高产能灌流工艺——持续模式和高强度模式，后者使比产率和日体积滴度分别提升最高108.94%和190.36%。
研究背景
过去十年，生物药全球需求持续攀升，对更高效生物工艺的需求日益迫切。补料分批培养仍是CHO细胞生产的工业标准，但连续制造正成为生物制药的关键趋势。灌流培养作为连续制造的核心环节，将上游细胞培养与连续下游操作直接衔接，可稳定长期运行、支持极高细胞密度、减少设施占地，并对多种药物模态具有灵活性。
然而灌流工艺面临一个特殊难题。补料分批中，培养环境变化自然引导细胞进入静止期——生长减慢但比产率（q p ）升高。灌流中，持续培养基更新维持细胞快速增殖。为维持目标细胞密度需进行细胞放血，但这导致产物损失，并使细胞无法进入高产能状态。因此，灌流开发的核心挑战是：在实现高细胞密度的同时，最小化产物损失并提高q p 。为此，生长抑制策略被引入灌流工艺。这些策略在补料分批中广泛用于提高产率，但在灌流中的实际实施与比较效果尚缺乏充分探索。同时，工艺开发常依赖昂贵的试错方法。
研究方法
2.1 细胞系、培养基与细胞培养
本研究使用的细胞系为产CD20单克隆抗体的CHO-DG44衍生株（Ran et al., 2025）。细胞在自研灌流培养基中培养，该培养基由基础培养基和浓缩培养基组成。半灌流实验在50 mL摇管（TPP Techno Plastic Products AG，瑞士）中进行，工作体积20 mL。培养期间，摇管置于Kuhner Shaker培养箱中，振幅50 mm（Adolf Kuhner，瑞士），300 rpm，80%湿度，5% CO₂。默认温度37°C，按需调整。半灌流从第2天开始，每日进行培养基交换。
灌流培养在3 L搅拌罐反应器（STR）（Applikon，荷兰）中进行，工作体积1.4 L。以0.9 ± 0.1 × 10⁶ cells·mL⁻¹ 的细胞密度接种。使用配备F2-RF02PES滤器（Repligen，美国）的ATF2系统（Repligen，美国）进行细胞截留。温度根据各实验要求设定。搅拌初始为250 rpm，随细胞密度上升逐步提高至最高550 rpm。通过通入CO₂维持pH 7.0 ± 0.2，通过L型1 mm喷嘴通入O₂维持溶氧40%。每日表观生长率（μ app ）由活细胞计数计算，随后按公式1调整放血率（B），使其与表观比生长率匹配，以将培养维持在所需设定点。根据目标CSPR或灌流率（D）及调整后的B，设定新鲜培养基进料速率和收获流速，确保反应器体积守恒。放血率计算如下：
(1) B = μ app
其中μ app （day⁻¹）为由活细胞计数确定的表观比生长率，B为放血率（day⁻¹）。
【数据】细胞系：产CD20单抗的CHO-DG44衍生株；摇管工作体积：20 mL；摇床参数：300 rpm、50 mm振幅、80%湿度、5% CO₂；默认温度：37°C；半灌流起始：第2天；STR工作体积：1.4 L；接种密度：0.9 ± 0.1 × 10⁶ cells·mL⁻¹；搅拌：250→550 rpm；pH：7.0 ± 0.2；溶氧：40%
2.2 离线分析
活细胞密度（VCD）和活率通过自动化CountStar细胞计数仪（CountStar，中国）以台盼蓝排斥法测定。葡萄糖、乳酸和氨浓度及LDH活性使用商品化试剂盒（南京建成，中国）测定。产物滴度通过Poros A柱（Thermo Scientific，美国）上的蛋白A亲和色谱测定。氨基酸水平通过反相HPLC分析，使用ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 × 150 mm，3.5 μm；Agilent，美国），在Agilent 1260 HPLC系统上运行。
【数据】VCD/活率检测：CountStar细胞计数仪、台盼蓝排斥法；代谢物检测：南京建成试剂盒；滴度检测：Poros A柱蛋白A亲和色谱；氨基酸检测：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 × 150 mm，3.5 μm）、Agilent 1260 HPLC
2.3 细胞比速率计算
消耗/生产比速率可通过以下公式计算：
(2) q Ci = 1/X v ∙ dC i,R /dt + B ∙ C i,R + (D − B) ∙ C i,H − D ∙ C i,f
其中X v 为活细胞密度（VCD），D为灌流率（day⁻¹），B为放血率（day⁻¹），C i,R （mM）代表反应器中的代谢物水平，q Ci （mmol·(10⁹ cells·day)⁻¹）为代谢物的细胞比速率，C i,f （mM）为补料培养基中的代谢物水平，C i,H （mM）为收获流中的代谢物水平。我们在估算真实比生长率时考虑了细胞裂解。μ app 经比死亡速率（k d ）校正后得到总生长率（μ）：
(3) μ = μ app + k d
其中k d 为比死亡速率，基于LDH活性测定（Zhang et al., 2025）。μ、μ app 和k d 以相同时间单位（day⁻¹）报告。
【数据】公式参数：X v 为VCD；D为灌流率（day⁻¹）；B为放血率（day⁻¹）；C i,R 为反应器代谢物水平（mM）；q Ci 单位为mmol·(10⁹ cells·day)⁻¹；k d 基于LDH活性测定；时间单位：day⁻¹
2.4 基于约束的通量分析
本研究利用先前建立的CHO-DG44基因组尺度代谢模型（GEM）（iCHOv1_DG44）（Calmels et al., 2019）分析胞内通量变化。细胞比速率（葡萄糖、乳酸、氨、氨基酸、mAb、O₂）用于约束模型边界。为适应实验变异并缓解由此产生的解空间不可行性，测得的营养物摄取和分泌速率扩展±20%，作为具有上下限的约束边界实施。代谢通量解空间采用广泛使用的人工中心命中运行（ACHR）蒙特卡洛采样（Hong et al., 2020; Schellenberger and Palsson, 2009; Yusufi et al., 2017）进行均匀采样，纳入实验测得的摄取和分泌通量约束。共进行10,000次迭代，以10,000个随机分布点采样解空间。采样通量分布的均值作为报告通量用于代谢变化讨论。该采样均值代表在施加的实验约束下可行通量空间的中心趋势，而非任何单一优化目标的唯一预测。详细步骤见补充材料。
【数据】模型：iCHOv1_DG44 GEM；约束扩展：±20%；采样方法：ACHR蒙特卡洛；迭代次数：10,000次；采样点数：10,000个
2.5 产品质量属性分析
使用rProtein A磁珠（天梯人和，中国）从上游样品中纯化抗体。电荷变异体分布通过强阳离子交换色谱分析，使用MabPac SCX-10柱（Thermo Scientific，美国），在Agilent 1260 HPLC系统（Agilent，美国）上运行。尺寸排阻色谱在TSKgel G3000SWXL柱（TOSOH，日本）上使用同一Agilent HPLC系统进行，以测定聚集水平。抗体片段化在Agilent 7100 CE系统（Agilent，美国）上单独分析，使用SDS-MW分析试剂盒（Beckman Coulter，美国）进行样品制备。糖基化谱分析中，N-聚糖用PNGase（NEB，美国）释放，用2-AB标记试剂盒（Agilent，美国）标记，在Glycan BEH Amide柱（Waters，美国）上使用Waters H-Class Bio UPLC系统（Waters，美国）分离。
【数据】纯化：rProtein A磁珠；电荷变异体：MabPac SCX-10柱、Agilent 1260 HPLC；聚集体：TSKgel G3000SWXL柱；片段化：Agilent 7100 CE、SDS-MW试剂盒；糖基化：PNGase释放、2-AB标记、Glycan BEH Amide柱、Waters H-Class Bio UPLC
2.6 统计学
所有数据使用GraphPad Prism v10（美国）处理，统计分析采用双尾Student's t检验。p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001和****p < 0.0001视为不同程度统计学显著性指标。误差棒代表均值 ± SD。
【数据】软件：GraphPad Prism v10；统计方法：双尾Student's t检验；显著性阈值：p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001、****p < 0.0001；误差棒：均值 ± SD
研究结果
3.1 梯度实验——不同生长抑制策略对细胞生长和产物表达的影响
为评估针对特定CHO细胞系的生长抑制策略，采用逐步实验方法。初步筛选在半灌流模式的摇管中进行，评估不同丁酸钠浓度（0、0.5、1和2 mM）和温度（37、34和31°C）。在此形式下尝试测量细胞比灌流率（CSPR）时发现，低CSPR条件下需要浓缩补料培养基以维持相似的营养供应。这种必要性产生了明显的渗透压波动，在摇管中引入高渗胁迫，损害了CSPR评估的可靠性（数据未显示）。尽管STR和摇管系统在流体剪切和氧合等因素上存在固有差异，但先前研究表明它们在低密度、低剪切培养中具有可比性（Moritz K. F. Wolf et al., 2019a,b; Zhang et al., 2025）。因此，为避免每日培养基交换相关的渗透压尖峰，CSPR比较（50、25、21和17 pL·cell⁻¹·day⁻¹）在STR中进行，其中调整浓缩补料比例以维持总氨基酸高于约40 mM、葡萄糖高于约30 mM。相应实验条件汇总于表1。
如图1a–c所示，一旦培养达到目标稳态VCD（约20 × 10⁶ cells·mL⁻¹），每日根据细胞计数调整放血率以维持恒定VCD，同时施加所选生长抑制策略进行系统评估。图1d–f呈现各实验系列中测得的比生长率（μ），图1g–i显示相应的比产率（q p ）。q p 的完整时间进程见Figure S1。
将CSPR从25降至17 pL·cell⁻¹·day⁻¹逐步降低μ，在最低速率时达到约0.06 day⁻¹。q p 呈钟形响应，在21 pL·cell⁻¹·day⁻¹时相对对照最大增加80.33%，随后随CSPR进一步降至17 pL·cell⁻¹·day⁻¹而下降。丁酸钠在0.5–2 mM范围内以剂量依赖性方式抑制μ。在2 mM时，细胞生长完全停滞，并观察到细胞死亡迹象。q p 在1 mM时达到最大，相对对照增加263.32%，而2 mM未进一步提升q p 。温和低温下，将温度降至34°C显著降低μ，但相对37°C对照使q p 增加34.15%。进一步降至31°C几乎停止细胞增殖，并导致q p 下降而非增加。总之，三种策略均可在特定操作窗口内实现所需的"生长抑制伴随产率增强"，但其有效范围和效率差异显著。
【数据】丁酸钠浓度：0、0.5、1、2 mM；温度：37、34、31°C；CSPR：50、25、21、17 pL·cell⁻¹·day⁻¹；目标稳态VCD：约20 × 10⁶ cells·mL⁻¹；最低CSPR下μ：约0.06 day⁻¹；q p 最大增幅：21 pL·cell⁻¹·day⁻¹时+80.33%；1 mM丁酸钠q p 增幅：+263.32%；34°C时q p 增幅：+34.15%；2 mM丁酸钠：生长完全停滞伴细胞死亡；31°C：增殖几乎停止、q p 下降
3.2 搅拌罐反应器中温和生长抑制策略的比较
灌流过程中，维持工艺稳定性通常不允许完全生长抑制。因此，为在STR中进一步比较不同策略，我们选择了不完全抑制生长的条件。选取生长抑制强度相似的条件：CSPR 25 pL·cell⁻¹·day⁻¹（CSPR）、0.5 mM丁酸钠（Buty）和34°C（Temp）。相应实验条件汇总于表2。
如图2所示，所有实验组在8天稳态期间维持稳定细胞密度（图2a）。关于细胞生长（图2b），抑制后Temp和Buty组的μ在1天内迅速降至约0.2 day⁻¹并保持稳定。相比之下，CSPR组的μ逐渐下降，约5天后达到相似水平。三组的μ最终均稳定在约0.2 day⁻¹，相对对照下降约35%。就q p 而言（图2c），Temp和Buty组显示初始快速增加。Temp组在2天后稳定在约30 pg·cell⁻¹·day⁻¹，而Buty组持续上升，第3天达到40 pg·cell⁻¹·day⁻¹，最终稳定在约42 pg·cell⁻¹·day⁻¹。CSPR组q p 上升较慢，前3天从21增至26 pg·cell⁻¹·day⁻¹，随后加速增加至第6天40 pg·cell⁻¹·day⁻¹，之后趋于平稳。总体而言，三种策略均相对对照提高了比产率。Buty和CSPR组q p 显著改善，相对Ctrl增加约100%。相比之下，Temp组增强较温和，约30%。累积产物滴度见图2d。8天内，Buty组达到最高滴度，约6.5 g/L。尽管CSPR组最终达到更高q p ，但其初始增加较慢且细胞密度略低，导致累积滴度与Temp组相似。可以预期，随培养时间延长，CSPR组将在总产物输出上逐渐超过Temp组。
除生长和产物形成的显著变化外，细胞代谢也发生实质性改变。图2e和2f分别显示比葡萄糖消耗率（q Glucose ）和比乳酸生产速率（q Lactate ）。q Glucose 在CSPR和Buty组显著增加，但在Temp组略有下降。相反，q Lactate 在CSPR和丁酸钠条件下降低，但在温和低温下略有增加，尽管由于标准差较大这些变化未达统计学显著性。核心葡萄糖-乳酸通量的这些相反变化表明，不同生长抑制策略下细胞代谢网络发生系统性重构，这可能促成了观察到的q p 和整体产率差异。
【数据】稳态期：8天；三组μ稳定值：约0.2 day⁻¹；μ相对对照降幅：约35%；Temp组q p 稳定值：约30 pg·cell⁻¹·day⁻¹（2天后）；Buty组q p 稳定值：约42 pg·cell⁻¹·day⁻¹（第3天40 pg·cell⁻¹·day⁻¹）；CSPR组q p ：21→26 pg·cell⁻¹·day⁻¹（前3天）→40 pg·cell⁻¹·day⁻¹（第6天）；Buty/CSPR组q p 相对Ctrl增幅：约100%；Temp组q p 增幅：约30%；Buty组8天累积滴度：约6.5 g/L
为剖析不同生长抑制策略下的细胞代谢响应，我们进行了基于GEM的代谢通量采样分析，并比较相对对照的通量变化（图3）。总体而言，CSPR和Buty组引发相似的代谢编程：两者均显著增加糖酵解和TCA循环通量，与实验观察到的比q Glucose 上升和q Lactate 下降一致。磷酸戊糖途径（PPP）通量也大幅升高，与NADPH生成增加一致（图4c）。相反，Temp组产生相反趋势，糖酵解、TCA循环和PPP相关通量适度下降。值得注意的是，谷氨酸脱氢酶（GDHm）通量在所有干预下均增加，CSPR和Buty组增幅更大。
就能量代谢而言，NADH生成（图4a）在CSPR和Buty组相对对照增加，这可能主要归因于TCA相关NADH生成反应（如ICDHym、r0384和MDHm）通量升高，以及来自糖酵解的PDHm通量贡献性上升。Temp条件下NADH生成略有下降。与这些NADH变化相呼应，总ATP合成通量在CSPR和Buty组显著升高，但在Temp下降低（图4b）。这种ATP变化可能主要由氧化磷酸化通量（ATPS4m_cho）改变驱动；尽管丙酮酸激酶（PYK）通量略有增加，但其对总ATP的贡献较小。一致地，细胞氧摄取率（q O2 ）在CSPR和Buty组上升，在Temp组下降。对稳态最后三天采样的通量分布进行主成分分析（PCA）（图4d）。前两个主成分（PCs）共同解释总方差的94.85%（PC1：74.14%，PC2：20.71%）。
【数据】CSPR/Buty组：糖酵解和TCA通量显著增加；PPP通量升高；Temp组：糖酵解、TCA、PPP通量适度下降；GDHm通量：所有干预下均增加（CSPR/Buty增幅更大）；NADH生成：CSPR/Buty增加、Temp略降；ATP合成：CSPR/Buty显著升高、Temp降低；q O2 ：CSPR/Buty上升、Temp下降；PCA方差解释率：PC1 74.14%、PC2 20.71%、合计94.85%
（注：原文结果部分在此处截断，后续内容如产品质量属性比较、模型预测与验证等未在节选中提供，故无法翻译。）
讨论与解读
为提高CHO细胞灌流工艺产率，生长抑制策略常被用于将细胞从增殖型转向高生产表型。该方法利用CHO细胞的代谢可塑性——在受控胁迫或抑制下，细胞可从生长导向代谢重定向至生产聚焦状态（Nöbel et al., 2024）。低CSPR和温和低温已有报道用于此目的（Gagnon et al., 2018; Liang et al., 2023），而丁酸钠在灌流中的应用据我们所知尚未被系统探索。尽管所有生长抑制策略均抑制细胞生长，但其底层机制不同。例如，温和低温主要减缓代谢率和细胞周期进程（Baik et al., 2006），而丁酸钠可诱导组蛋白超乙酰化并改变基因表达（Jiang and Sharfstein, 2008）。因此，不同干预可能引发不同生理结果，选择合适策略对成功工艺强化至关重要。本研究系统比较了三种生长抑制策略——低CSPR、丁酸钠和温和低温——在细胞生长、代谢、产率和关键质量属性方面的表现。在适度抑制下，q p 通常随μ下降而上升。然而，过度抑制降低q p ，表明不同策略间操作窗口存在差异。
编译者解读：该研究的方法学价值在于将代谢通量采样与生长动力学建模串联，把"选策略"从经验试错升级为可计算的设计流程。低CSPR与丁酸钠趋同上调能量代谢这一发现，为组合策略提供了机制依据。但需注意，模型预测精度依赖参数不确定性范围设定，且研究仅在单一CHO细胞系中验证；产物质量在强化条件下的长期漂移、以及放大到工业规模时ATF系统与通量约束的匹配性，仍是走向实际生产前需回答的问题。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.008
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.008