基于碱基替换理性设计的适配体实现艾司氯胺酮纳摩尔级电化学检测

📅 2026-09-29 📰 Sensors and Actuators B: Chemical 2026-12-15 📂 研究进展 👁 23

来源：Nanomolar electrochemical detection of esketamine enabled by a rationally designed aptamer via base substitution（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：参考文献格式化

导读

艾司氯胺酮（ESKET）的临床监测需要高灵敏、高特异的识别元件。本研究以ESKET分子结构为起点，理性设计初始适配体序列，再通过碱基替换策略系统优化获得Apt-7。圆二色谱与等温滴定量热实验证实Apt-7与ESKET结合显著增强，解离常数达1 µM。基于Apt-7构建的电化学适配体传感器在未稀释胎牛血清中检出限为30 nM，并展现出对常用麻醉药物的高选择性。

研究背景

适配体是能以高特异性结合靶标分子的单链DNA或RNA寡核苷酸。凭借这种特异性以及易于工程化的特点，适配体成为构建高性能生物传感器的理想识别元件。电化学适配体（E-AB）传感器将适配体的特异性识别能力与电化学检测的高灵敏度相结合。此类传感器通常将靶标特异性适配体的一端固定在电极表面，另一端标记氧化还原报告基团。该方法最早由Fan等人于2003年提出，用于通过适配体构象变化检测ATP。Plaxco及其同事在该领域开展了大量工作，建立了多种基于E-AB传感器的分析方法，包括双频方法和动力学差分方法，并近期对在人体内实时检测药物、代谢物和生物标志物的临床可行方案进行了批判性综述。其工作原理是：靶标结合诱导表面束缚适配体发生构象变化，从而改变氧化还原报告基团与电极之间的电子转移速率。测量这一信号变化即可对靶标进行定性或定量分析。

研究方法

2.1 适配体的理性设计与验证

为获得对ESKET具有高亲和力的DNA适配体，本研究采用了基于分子结构的理性设计策略。首先，分析ESKET的分子结构特征——如羰基、甲氨基、氯原子和芳香环——以通过计算识别潜在的相互作用模式，包括氢键和π-π堆积。基于此分析，设计了一条初始适配体序列。该序列包含全部四种DNA碱基（A、T、G和C），长度为32 nt，具有适中的构象稳定性和合适的自由能。随后以该初始序列为模板进行系统的碱基替换优化。替换原则是保持序列长度不变，同时搜索与靶标分子互补性更优的构象。为评估每次替换的效果，使用Discovery Studio软件进行分子对接以预测结合模式，并使用AutoDock软件进行交叉验证。这一设计与模拟的迭代循环重复进行，直至鉴定出预测结合良好的候选适配体。最后，为验证理性设计结果，通过CD光谱分析适配体的构象，并通过ITC测定其解离常数，从而选择最优适配体用于构建电化学传感器。

▲ Rational design strategy and base substitution process of esketamine binding aptamers. (a) Screening principle of basic aptamer chain. (b) Possible chemical mechanism and energy change of aptamer binding to esketamine. (c) The base substitution process and the conformational change caused by the bin

【数据】序列长度：32 nt；碱基组成：A、T、G、C四种碱基；对接软件：Discovery Studio、AutoDock；其他：原文未详述

2.2 E-AB传感器的构建

电极预处理步骤及相应结果见Figure S1。在传感器制备之前，将二硫键修饰的适配体还原至少一小时以确保其可用性。适配体处理和储存的详细方案见支持信息。具体而言，将1.0 μL亚甲蓝标记的适配体溶液（100 μM）与9.0 μL三(2-羧乙基)膦溶液（100 mM）混合，在室温下孵育1 h以将二硫键充分还原为硫醇。随后，取一份该溶液用磷酸盐缓冲液（PBS）组装缓冲液稀释至最终适配体浓度为200 nM。将清洗后的电极浸入制备好的适配体溶液中，在室温避光条件下修饰1 h。适配体固定后，将电极在3.0 mM巯基己醇（MCH）溶液中避光孵育1 h以形成混合自组装单层。然后用电去离子水轻轻冲洗电极表面30 s以去除未结合的MCH，在高纯氮气流下干燥，避光密封保存，最后在20 mM Tris缓冲液中过夜平衡。

【数据】适配体溶液体积：1.0 μL；适配体浓度：100 μM；TCEP体积：9.0 μL；TCEP浓度：100 mM；还原时间：1 h；还原温度：室温；稀释后适配体浓度：200 nM；电极修饰时间：1 h；修饰温度：室温；修饰条件：避光；MCH浓度：3.0 mM；MCH孵育时间：1 h；MCH孵育条件：避光；冲洗时间：30 s；平衡缓冲液：20 mM Tris；平衡时间：过夜

2.3 分析方法的建立

方波伏安法（SWV）对电极界面的电子转移动力学响应灵敏，因此被用于E-AB传感器的测量。通过优化SWV参数可精确调节传感器的灵敏度。制备了一系列浓度分别为0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50和100 μM的ESKET溶液以获得结合响应曲线。该实验旨在系统表征传感器在宽浓度范围内的性能，为后续定量分析提供可靠数据。检出限（LOD）通过对Hill拟合的剂量-响应曲线进行几何测定。具体而言，在对数浓度域中，将拟合曲线拐点处的切线外推至与低浓度响应基线相交，该交点对应的分析物浓度定义为LOD。信号变化（S，%）使用以下公式计算：信号增益 S = (I − I₀) / I₀ × 100%。为进一步验证所开发适配体的可行性和实用性，使用各候选适配体构建的传感器在不同溶液中检测ESKET。剂量-响应曲线使用Hill方程拟合以提取ESKET的关键传感器参数（Table S6）。在该方程中，(n)代表Hill系数，(S)表示信号增益，r_min和r_max分别对应归一化信号的最小值和最大值。S = r_min + (r_max − r_min) × [target]^n / (k_d^n + [target]^n)。有关试剂、材料、SWV和循环伏安参数、CD光谱及ITC步骤的详细信息见支持信息。

▲ (a-d) Signal gain Dependency on SWV frequency. (e-h) SWV scan with or without esketamine at 15 Hz (optimal frequency, 5 μM). (i-l) The Signal response of E-AB sensors in 10 mM PBS buffer. (m-p) SWV responses at various esketamine concentrations.

【数据】ESKET浓度系列：0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50、100 μM；LOD测定方法：Hill拟合曲线拐点切线外推法；信号计算公式：S = (I − I₀) / I₀ × 100%；拟合方程：Hill方程

研究结果

3.1 基础链的理性设计与筛选

为获得能特异性识别ESKET的DNA适配体，首先基于ESKET的化学官能团和核酸碱基的性质确定了设计规格。随后理性设计了一组候选初始适配体序列（Table S1），并对其进行了模拟和分析（如结构能量和构象）。初始32核苷酸序列的选择基于适配体文库设计和结构需求的考虑。众所周知，几乎所有已知的参与适配体结合的功能基序都可以在不超过30个核苷酸的核酸序列中形成，这表明显著超过此长度的序列可能含有不直接参与靶标识别的冗余核苷酸。反之，寡核苷酸文库的随机区域长度应至少为25个核苷酸以确保足够的结构多样性。此外，适配体截短研究的实验证据表明，将适配体从30个核苷酸减少到25个核苷酸可导致结合亲和力的急剧丧失——例如，在ATP结合适配体的情况下降低超过700倍。基于这些考虑，采用32-nt支架作为碱基替换优化的理性起点。

一般来说，具有茎环结构的适配体更可能在靶标结合时发生构象变化。同时，适配体的二级结构能量应适中；能量过低即过于稳定的构象，如果与靶标的结合能不超过其内在结构稳定性，可能导致构象切换不足。如图1a所示，尽管最初提出的候选适配体表现出平衡的碱基组成并保留了理论结合位点，但其设计缺乏来自已建立适配体结构数据库（包含二级结构特征和相关能量信息）的约束。因此，这些仅基于一级分子考虑推导出的序列在形成有效靶标结合所需的稳定茎环构象方面可靠性有限。

为开发特异性识别ESKET的适配体，我们采用了碱基替换策略。该方法旨在调节适配体的二级结构能量和构象特性，同时保持亲本Apt-2的序列长度不变。基于ESKET优先与G相互作用的早期发现，我们的策略分两个阶段进行。首先，将Apt-2中选择性的T残基替换为G和腺嘌呤，得到Apt-6，其亲和力增强。这一现象初步归因于高效π-π堆积相互作用（涉及ESKET的刚性平面骨架和鸟嘌呤碱基）与仲胺和酮官能团同鸟嘌呤碱基极性边缘之间形成的特定氢键之间的协同作用。随后，将Apt-6中的部分腺嘌呤残基替换为G以生成Apt-7，其亲和力进一步提高。为验证G在相互作用中的重要性，我们将Apt-7中的G碱基替换为T和腺嘌呤，产生Apt-10，其亲和力和结合能显著降低。如图1c所示，对接模拟表明ESKET与Apt-2、Apt-6和Apt-7的结合能约为–6.5 kcal/mol，而与Apt-10（G含量较低）的结合能为–5.4 kcal/mol。该结果表明增加G含量可稳定适配体-靶标复合物。计算得到的适配体结构能量为：Apt-2，–2.19 kcal/mol；Apt-6，–1.57 kcal/mol；Apt-7，–2.25 kcal/mol；Apt-10，–1.81 kcal/mol。该替换策略的效果随后通过CD光谱和ITC实验得到验证。

【数据】初始序列长度：32 nt；Apt-2与ESKET结合能：约–6.5 kcal/mol；Apt-6与ESKET结合能：约–6.5 kcal/mol；Apt-7与ESKET结合能：约–6.5 kcal/mol；Apt-10与ESKET结合能：–5.4 kcal/mol；Apt-2结构能量：–2.19 kcal/mol；Apt-6结构能量：–1.57 kcal/mol；Apt-7结构能量：–2.25 kcal/mol；Apt-10结构能量：–1.81 kcal/mol

3.2 碱基替换优化与分子对接模拟

为开发特异性识别ESKET的适配体，我们采用了碱基替换策略。该方法旨在调节适配体的二级结构能量和构象特性，同时保持亲本Apt-2的序列长度不变。基于ESKET优先与G相互作用的早期发现，我们的策略分两个阶段进行。首先，将Apt-2中选择性的T残基替换为G和腺嘌呤，得到Apt-6，其亲和力增强。随后，将Apt-6中的部分腺嘌呤残基替换为G以生成Apt-7，其亲和力进一步提高。为验证G在相互作用中的重要性，我们将Apt-7中的G碱基替换为T和腺嘌呤，产生Apt-10，其亲和力和结合能显著降低。如图1c所示，对接模拟表明ESKET与Apt-2、Apt-6和Apt-7的结合能约为–6.5 kcal/mol，而与Apt-10（G含量较低）的结合能为–5.4 kcal/mol。该结果表明增加G含量可稳定适配体-靶标复合物。计算得到的适配体结构能量为：Apt-2，–2.19 kcal/mol；Apt-6，–1.57 kcal/mol；Apt-7，–2.25 kcal/mol；Apt-10，–1.81 kcal/mol。鉴于分子对接和其他计算预测的固有局限性——这些预测基于简化模型，不能完全捕捉复杂的溶液环境、构象熵或结合动力学——我们采用CD光谱和ITC实验对结合特性进行补充实验验证。

【数据】Apt-2与ESKET结合能：约–6.5 kcal/mol；Apt-6与ESKET结合能：约–6.5 kcal/mol；Apt-7与ESKET结合能：约–6.5 kcal/mol；Apt-10与ESKET结合能：–5.4 kcal/mol；Apt-2结构能量：–2.19 kcal/mol；Apt-6结构能量：–1.57 kcal/mol；Apt-7结构能量：–2.25 kcal/mol；Apt-10结构能量：–1.81 kcal/mol

3.3 艾司氯胺酮与适配体的圆二色光谱

为验证分子对接结果，我们首先使用CD光谱进行实验。如图2a-d所示，G含量逐渐增高的适配体（Apt-2、Apt-6和Apt-7）在加入ESKET后表现出明显的光谱变化。具体而言，260–280 nm附近的正Cotton峰出现明显的蓝移并伴随椭圆率变化；这种蓝移效应在Apt-7中最为显著。这种位移通常归因于碱基堆积增强或螺旋结构的周期性调整，表明ESKET结合诱导适配体骨架收缩或重排，导致构象更加有序和稳定。值得注意的是，比较Apt-2、Apt-6和Apt-7的光谱响应可以看出一个总体趋势：ESKET诱导的特征CD谱带变化随G含量增加而更加明显，其中Apt-7表现出最显著的光谱响应。尽管不同适配体的绝对椭圆率值不能单独用作构象重排幅度的定量指标，因为它们的序列和内在CD特征不同，但每个适配体相对于其自身初始光谱的变化揭示了其对ESKET响应与G含量相关的趋势。这一观察表明G碱基可能在介导有效的ESKET结合和驱动显著构象响应中发挥重要作用。我们推测G可能通过其独特的氢键位点和平面几何结构为ESKET提供特定的结合口袋——例如通过G-四链体结构域——或增强碱基堆积相互作用，从而使整体结构对配体结合更加敏感。相反，Apt-10的CD结果进一步支持了这一解释。Apt-10设计为G含量降低、T含量增加。其对ESKET的光谱响应与富含G的适配体有根本性不同：蓝移可忽略不计，光谱形状遵循不同的轨迹。这表明替换G碱基会显著改变适配体对ESKET的响应模式。

▲ (a-d) ESKET-适配体复合物的CD光谱；(e-h) 适配体与ESKET结合的ITC热谱图。

【数据】CD特征峰位置：260–280 nm；Apt-7蓝移效应：最显著；Apt-10蓝移：可忽略不计；其他：原文未详述

3.4 E-AB传感器的信号响应与检测性能

方波伏安法（SWV）被用于E-AB传感器的测量。通过优化SWV参数可精确调节传感器的灵敏度。制备了一系列浓度分别为0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50和100 μM的ESKET溶液以获得结合响应曲线。如图3a-d所示，信号增益与SWV频率存在依赖关系。图3e-h展示了在15 Hz（最佳频率，5 μM）下有无艾司氯胺酮时的SWV扫描结果。图3i-l显示了E-AB传感器在10 mM PBS缓冲液中的信号响应。图3m-p展示了不同艾司氯胺酮浓度下的SWV响应。

▲ 所开发的 ESKET E-AB 传感器用于不同溶液环境的检测。Apt-7 E-AB 传感器在 10 mM PBS 缓冲液（a 和 d）、人工尿液（b 和 e

▲ The performance of APT-7 E-AB sensor in different solution environments. Recovery of Esket (a-c), signal reproducibility (d-f) and selectivity of the sensor (g-i). Mixture is a solution containing esketamine and all other substances.

构建的传感器在未稀释胎牛血清中对ESKET的检出限为30 nM，具有高选择性，处于临床监测的治疗浓度范围内。Apt-7 E-AB传感器在10 mM PBS缓冲液（图4a和4d）、人工尿液（图4b和4e）和未稀释胎牛血清（图4c和4f）中均表现出良好的分析性能。图5展示了Apt-7 E-AB传感器在不同溶液环境中的性能：Esket的回收率（图5a-c）、信号重现性（图5d-f）和传感器的选择性（图5g-i）。混合物为含有艾司氯胺酮及所有其他物质的溶液。其在全血中的初步应用揭示了复杂基质带来的挑战——这也是其他分析技术如液相色谱-质谱联用（LC-MS）和免疫分析直接应用于全血时常见的局限性——指出了未来工作需要改进的方面。

【数据】SWV最佳频率：15 Hz；ESKET浓度：5 μM（SWV扫描）；缓冲液：10 mM PBS；胎牛血清中检出限：30 nM；解离常数：1 µM；ESKET浓度系列：0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50、100 μM

Nanomolar electrochemical detection of esketamine enabled by — ▲ 论文配图

讨论与解读

本研究通过理性分子设计和碱基替换策略成功开发了一种用于艾司氯胺酮灵敏检测的电化学适配体传感器。基于结构信息设计确定了初始适配体候选物Apt-2，随后进行系统的碱基替换优化，获得了结合亲和力显著增强的Apt-7。CD光谱和ITC证实了其对艾司氯胺酮的强结合能力，解离常数为1 µM。使用Apt-7制备的传感器在磷酸盐缓冲液、人工尿液和胎牛血清中表现出良好的分析性能，检出限达30 nM，同时对常用麻醉药物保持高选择性。Apt-7信号增益的增强不仅归因于其改善的结合亲和力，还归因于其高效的目标诱导构象切换和良好的探针固定特性。这项工作不仅为艾司氯胺酮的检测提供了可靠工具，也为面向传感应用的适配体理性设计提供了有效策略。

编译者解读： 该研究的亮点在于将适配体发现从"盲筛"推向"设计"——以靶标化学结构为起点、以碱基替换为手段、以计算模拟为导航，再用CD和ITC做实验闭环。30 nM的血清检出限已触及临床治疗药物监测的实用门槛，但全血基质中的表现仍是短板。对合成生物学而言，这种"结构驱动+碱基编辑"的适配体优化范式可迁移至其他小分子靶标，关键在于建立可靠的构象-亲和力预测模型。

参考来源

期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026

DOI: 10.1016/j.snb.2026.140818

延伸阅读：更多代谢通路设计、多基因组装等合成生物学工具，可访问 DNA Lab Space。