来源：Promiscuous fungal peroxygenase from Chaetomium globosum by directed evolution（iScience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
真菌非特异性过加氧酶（UPO）能在温和条件下选择性活化C–H键，但多数天然UPO异源表达量低、稳定性差，难以实际应用。本研究以球毛壳菌来源的短型UPO（CglUPO）为起点，通过多轮定向进化获得高活性、高稳定性的分泌变体AckBar。该变体在毕赤酵母中产量达约90 mg/L，T₅₀约60°C，可催化乙苯、苯乙烯、四氢萘、异佛尔酮、蒎烯和柠檬烯等多种底物的选择性氧化，并意外展现出抗马氏规则的Wacker-Tsuji氧化活性。分子动力学模拟揭示F154L和M210V突变通过重塑血红素通道改变了酶的性能。
研究背景
真菌非特异性过加氧酶（UPOs，EC 1.11.2.1）是一类多样且高效的C–H氧官能化酶。它们能在温和条件下将氧原子选择性插入有机分子，为传统化学催化剂提供了有吸引力的替代方案，契合精细化学品、大宗化学品、药物及其代谢物合成等领域对可持续高效工艺日益增长的需求。近年来，工业界对兼具高选择性（化学、对映和区域选择性）、稳定性以及能在异源宿主中快速表达和改造的新型UPO需求不断增加。
2017年，研究者从普遍存在的纤维素分解内生子囊菌——球毛壳菌（Chaetomium globosum）中发现了一种新的UPO，命名为CglUPO。该酶与已知UPO序列空间差异显著。CglUPO在UPO家族中展现出独特的反应性和选择性，对多种底物具有高活性，包括甾体（如睾酮）、白藜芦醇类似物、异佛尔酮、降异戊二烯、长链不饱和脂肪酸、植物水解产物，甚至短链末端烯烃脂肪酸等化合物。然而，CglUPO稳定性低、异源表达差，一直阻碍其实际应用。
研究方法
关键资源表
本研究所用酵母和细菌菌株（含来源和基因型）均列于关键资源表中。
细菌和病毒菌株：S. cerevisiae BJ5465（ATCC 208289；LGCPromochem，西班牙），基因型：MATa ura3-52 trp1 leu2Δ1 his3Δ200 pep4:HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL；P. pastoris BG11（BioGrammatics PS 10011/ATUM，美国），基因型：aox1-Δ1；E. coli XL2-Blue（Agilent Technologies，美国），基因型：recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]。
化学品、多肽和重组蛋白：DL-2-苯基丙醛（ThermoScientific，西班牙，130861000）；(S)-顺式-马鞭草醇（ThermoScientific，347330050）；(1S)-顺式-马鞭草酮（ThermoScientific，203630500）；(−)-香芹醇（异构体混合物，ThermoScientific，B20636）；苯乙酮（ThermoScientific，102410025）；苯乙醛（ThermoScientific，A14263）；苯乙烯（Merck Life Science，美国，S4972）；氧化苯乙烯（Merck Life Science，S5006）；4-氯苯乙烯（Merck Life Science，C71203）；乙苯（Merck Life Science，E12508）；四氢萘（Merck Life Science，429325）；1-苯乙醇（Merck Life Science，P13800）；Purpald（4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑，Merck Life Science，162892）；(S)-(−)-柠檬烯（Merck Life Science，218367）；(R)-(+)-柠檬烯（Merck Life Science，183164）；(+)-柠檬烯氧化物（异构体混合物，Merck Life Science，218324）；(S)-(+)-香芹酮（Merck Life Science，435759）；(S)-(−)-紫苏醇（Merck Life Science，218391）；桃金娘烯醇（Merck Life Science，W343900）；异佛尔酮（Merck Life Science，I3509）；3-氯过氧苯甲酸（Merck Life Science，273031）；α-甲基苯乙烯（Merck Life Science，M80903）；α-四氢萘酮（Merck Life Science，T19003）；α-四氢萘酚（Merck Life Science，122408）；2-(4-氯苯基)环氧乙烷（Merck Life Science，534757）；4-羟基异佛尔酮（Enamine Ltd，乌克兰，EN300-68596）；(4-氯苯基)乙醛（BLD Pharm，中国，BD28705）；(S)-(−)-柠檬烯氧化物（Ambeed Inc，美国，A1372474）；α-蒎烯氧化物（TCI Europe，瑞士，P1362）；DMP（2,6-二甲氧基苯酚，TCI Europe，D0639）；NBD（5-硝基-1,3-苯并二氧杂环戊烯，TCI Europe，M0848）；藜芦醇（Merck Life Science，D133000）；H₂O₂（30% w/w，Merck Life Science，H1009）；NotI（New England Biolabs，美国，R0189）；BglII（New England Biolabs，R0144）；PmeI（New England Biolabs，R0560）；BamHI（New England Biolabs，R0136）；XhoI（New England Biolabs，R0146）；Gibson Assembly Master Mix（New England Biolabs，E2611）；iProof高保真DNA聚合酶（Bio-Rad，美国，1725301）；酵母转化试剂盒（Merck Life Science，YEAST1）；NucleoSpin质粒试剂盒（Macherey-Nagel，德国，740588.50）；PCR Clean-up试剂盒（Macherey-Nagel，740609.50）；Zymoprep酵母质粒小提试剂盒（Zymo Research，美国，D2004）。
寡核苷酸：引物（见克隆部分）购自Integrated DNA Technologies（美国）。
重组DNA：pJRoC30（California Institute of Technology，美国）；pBSY5Z（Bisy，奥地利）。
沉积数据：DNA序列见补充信息；GC/MS数据见补充信息。
软件和算法：Prism 10（GraphPad，美国）；AlphaFold 2（开源）；Dali服务器（http://ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/dali/）；PROPKA 3.1（Schrodinger）；AMBER (ff03.r1)（https://ambermd.org）；BIOVIA Discovery Studio Visualizer（https://www.3ds.com/products/biovia/discovery-studio/visualization）；NAMD 3.0（https://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/）；Zenodo MD沉积（https://doi.org/10.5281/zenodo.19047657）。
【数据】菌株：S. cerevisiae BJ5465（ATCC 208289）、P. pastoris BG11（PS 10011）、E. coli XL2-Blue（200150）；培养基：原文未详述；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
实验模型和研究参与者详情
本研究所用所有酵母和细菌物种（包括来源和基因型）均列于关键资源表中。
【数据】菌株：S. cerevisiae BJ5465、P. pastoris BG11、E. coli XL2-Blue；培养基：原文未详述；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
方法详情
培养基和表达
合成完全（SC）缺陷型最小培养基：微孔板和摇瓶用SC最小培养基含6.7 g/L过滤除菌的酵母氮源基础、1.92 g/L过滤除菌的酵母合成缺陷型培养基补充剂（不含尿嘧啶）、2 g/L过滤除菌的五水棉子糖和25 mg/L过滤除菌的氯霉素。SC缺陷型平板含6.7 g/L过滤除菌的酵母氮源基础、1.92 g/L过滤除菌的酵母合成缺陷型培养基补充剂（不含尿嘧啶）、20 g/L高压灭菌的细菌琼脂、2 g/L过滤除菌的葡萄糖和25 mg/L过滤除菌的氯霉素。
S. cerevisiae表达培养基：无菌表达培养基含20 g/L细菌蛋白胨、10 g/L酵母提取物、67 mM KH₂PO₄ pH 6.0缓冲液、2.2%过滤除菌的半乳糖、2.2 mM过滤除菌的MgSO₄、3.16%乙醇和25 mg/L过滤除菌的氯霉素。YP培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L细菌蛋白胨。YPD溶液含10 g/L酵母提取物、20 g/L细菌蛋白胨、2 g/L无菌葡萄糖、25 mg/L氯霉素。Luria-Bertani（LB）培养基含5 g/L酵母提取物、10 g/L细菌蛋白胨、10 g/L NaCl（博来霉素筛选时为5 g NaCl）、100 mg/L氨苄青霉素或25 mg/L博来霉素。
P. pastoris生物反应器表达培养基：基础盐培养基（BMG）初始体积12 L，含26.7 mL/L 85%磷酸、0.93 g/L CaSO₄·2H₂O、14.9 g/L MgSO₄·7H₂O、18.2 g/L K₂SO₄、4.13 g/L KOH、40 g/L甘油。PTM1微量盐溶液经过滤除菌，含以下成分：6 g/L CuSO₄·5H₂O、0.08 g/L NaI、3 g/L MnSO₄·H₂O、0.2 g/L Na₂MoO₄、0.02 g/L H₃BO₃、0.5 g/L CoCl₂、20 g/L ZnCl₂、65 g/L FeSO₄·7H₂O、0.2 g/L生物素、5 mL/L硫酸。
【数据】培养基：SC最小培养基含6.7 g/L YNB、1.92 g/L补充剂、2 g/L棉子糖、25 mg/L氯霉素；SC平板含20 g/L琼脂、2 g/L葡萄糖；表达培养基含20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、67 mM KH₂PO₄ pH 6.0、2.2%半乳糖、2.2 mM MgSO₄、3.16%乙醇；BMG含26.7 mL/L磷酸、0.93 g/L CaSO₄·2H₂O、14.9 g/L MgSO₄·7H₂O、18.2 g/L K₂SO₄、4.13 g/L KOH、40 g/L甘油；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：pH 6.0
CglUPO在S. cerevisiae中的克隆
编码主要CglUPO的基因（GenBank登录号：CHGG_00319，NCBI参考序列：XM_001219539.1）来自球毛壳菌（Mycobank编号：172545，菌株CBS 148.51），用于合成多个融合基因，分别连接来自Marasmius rotula、Chaetomium globosum、Agrocybe aegerita野生型和进化分泌前导序列（PaDa-I）以及Caldariomyces fumago过加氧酶的信号肽。CglUPO融合基因使用BamHI和XhoI限制酶克隆到pJRoC30表达穿梭载体的GAL1启动子控制下。线性化载体上样于制备型琼脂糖凝胶，用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up试剂盒纯化。纯化DNA用配备NanoQuant板的Infinite M200板读数仪（TECAN，瑞士）定量。相应基因（各200 ng）与线性化质粒（100 ng）混合，使用酵母转化试剂盒转化到S. cerevisiae中，通过IVOE促进体内基因重组和克隆。
【数据】基因：CglUPO（GenBank CHGG_00319，NCBI XM_001219539.1）；菌株：CBS 148.51；质粒：pJRoC30（100 ng）；DNA用量：基因200 ng；限制酶：BamHI、XhoI；温度：原文未详述；时间：原文未详述；数值：原文未详述
CglUPO及变体的实验室进化
PCR产生的每个DNA片段用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up试剂盒凝胶纯化，用配备NanoQuant板的Infinite M200板读数仪（TECAN，瑞士）定量。然后，200 ng突变体文库（或基因片段）与100 ng线性化质粒混合，如上所述转化到S. cerevisiae中。酵母转化子在30°C孵育72小时，然后进行下述高通量筛选方案。每轮定向进化突变体文库构建的详细步骤如下。
第一轮：CglUPOSac基因在MnCl₂存在下用Taq DNA聚合酶进行epPCR。诱变PCR反应终体积50 μL，含3% DMSO、90 nM RMLN正义引物（5′-CCTCTATACTTTAACGTCAAGG）和RMLC反义引物（5′-GGGAGGGCGTGAATGTAAGC）、0.3 mM dNTPs（各0.075 mM）、0.015 mM MnCl₂、0.1 ng/μL模板、1.5 mM MgCl₂和0.05 U/μL Taq DNA聚合酶。PCR反应在梯度热循环仪（Mycycler，BioRad，美国）上进行，参数如下：95°C 2分钟（1个循环）；94°C 45秒，50°C 30秒，72°C 90秒（30个循环）；72°C 10分钟（1个循环）。随后，PCR产物纯化并如上所述转化到酵母中。约1,000个克隆用下述DMP高通量筛选方法筛选活性/分泌。
第二轮：本轮定向进化分为两种策略：i）全基因epPCR和ii）第210位点的定点饱和突变（SSM）。对于第一种策略……
【数据】DNA用量：突变体文库200 ng、线性化质粒100 ng；温度：30°C（孵育）、95°C 2 min、94°C 45 s、50°C 30 s、72°C 90 s、72°C 10 min（PCR）；时间：72 h（孵育）、30个循环（PCR）；数值：PCR体积50 μL、DMSO 3%、引物90 nM、dNTPs 0.3 mM、MnCl₂ 0.015 mM、模板0.1 ng/μL、MgCl₂ 1.5 mM、Taq 0.05 U/μL、筛选克隆数约1,000
研究结果
定向进化
先前一篇报道描述了通过基于Golden Gate克隆的模块化 shuffling 系统在S. cerevisiae和P. pastoris中功能性表达包括CglUPO在内的几种UPO。虽然该研究证明CglUPO的异源表达是可能的，但我们发现其在S. cerevisiae中的分泌水平极低（约0.6 mg/L），不幸的是这阻碍了任何进一步改造。在本研究中，我们首先测试了来自不同过加氧酶物种（Marasmius rotula、Caldariomyces fumago、Agrocybe aegerita——天然和进化前导序列——以及C. globosum）的多种信号肽，将其融合到成熟CglUPO上，并在不同培养条件下评估，以促进蛋白酶缺陷型S. cerevisiae菌株中的蛋白分泌。最佳结果来自天然CglUPO信号肽，使酶在96孔板微量发酵（用于定向进化中的高通量筛选[HTS]）中总活性水平达到约3 U/L。这一微小但可检测的活性使该融合体（CglUPOSac）可作为定向进化 campaign 的出发亲本，通过迭代轮次的随机诱变、饱和诱变和体内DNA重组增强其在S. cerevisiae中的分泌（图1）。
由于天然真菌来源的野生型酶（CglUPOwt）稳定性差，HTS分析设置为通过2,6-二甲氧基苯酚（DMP）氧化为coerulignone来同时监测总活性和热稳定性（分析变异系数约15%）。值得注意的是，我们观察到仅将CglUPO的表达系统从其天然宿主C. globosum切换到S. cerevisiae，T₅₀（孵育10分钟后酶保留50%残余活性的温度）就出现了4°C的重要动力学热稳定性提升——从52°C升至56°C。这一效应可能归因于酵母的（超）糖基化，这对稳定性可能有益（见表1生化表征）。
第一轮随机诱变产生了两个功能表达显著改善的突变体：变体9G3，携带M210V突变；变体11G4，携带M210T和K229E两个突变（图1）。鉴于这两个突变体中均存在M210 T/V替换，我们在第210位点构建了定点饱和突变文库，获得了4B10变体，由于包含M210R突变，总活性提高了16倍。同时，以9G3和11G4为亲本进行了新一轮随机诱变结合体内DNA shuffling，产生了AckBar突变体（在9G3基础上插入F154L突变）和3H9突变体（引入D35N替换），总活性分别提高10倍和9倍，分泌水平达到约6 mg/L。在进化的最后一步，我们试图在不同变体间寻找突变的最佳组合，但所得突变体均未改善前几代达到的表达水平。
此时，我们决定用三种模型化合物（乙苯、苯乙烯和1,2,3,4-四氢萘[THN]）对不同突变体的过加氧酶活性和选择性进行初步分析（表S1）。虽然大多数变体以相似的对映选择性催化这些分子的双电子氧化（单过加氧反应），但AckBar突变体对THN表现出戏剧性的对映选择性反转，将其转化为相应的苄醇(S)-1,2,3,4-四氢萘-1-醇，对映体过量（ee）为86%。这与亲本UPO形成强烈对比，后者根据酶是由C. globosum（原始野生型宿主，CglUPOwt）还是S. cerevisiae（CglUPOSac）表达，显示(R) ee值为20%或26%。该实验的另一个意外结果是观察到苯乙烯的抗马氏规则Wacker-Tsuji氧化生成苯乙醛，这是一个长期追求的合成反应，最近在其他UPO和细胞色素P450单加氧酶中有报道，但此前未在CglUPO中描述过。
鉴于这些结果以及AckBar突变体的两个突变均位于血红素通道（见STAR Methods），我们决定在更大规模上生产AckBar突变体，以研究其生化特征和反应模式。
【数据】菌株：S. cerevisiae（分泌水平约0.6 mg/L）、CglUPOSac（总活性约3 U/L）；突变体：9G3（M210V）、11G4（M210T/K229E）、4B10（M210R，活性提高16倍）、AckBar（F154L，活性提高10倍，分泌约6 mg/L）、3H9（D35N，活性提高9倍）；温度：T₅₀从52°C升至56°C（切换表达系统）；时间：10 min（T₅₀测定）；数值：分析变异系数约15%、THN的ee 86% (S)、CglUPOwt的ee 20% (R)、CglUPOSac的ee 26% (R)
毕赤酵母补料分批生物反应器生产和生化表征
S. cerevisiae是定向UPO进化的首选宿主，因为有多种附加型载体可用，且存在成熟的突变体文库构建和筛选方案；而P. pastoris（Komagataella phaffii）通常用于过量生产进化变体，构成了所谓的UPO研究串联酵母表达系统。因此，亲本CglUPO和AckBar突变体被克隆到P. pastoris中，在30-L补料分批生物反应器中发酵，AckBar产量达到约90 mg/L（相当于培养上清液中数克UPO），是同一宿主中亲本酶（CglUPOPic）的三倍，且未进行任何工艺工程优化。
两种重组UPO均被纯化，并评估了其主要生化性质。SDS-PAGE获得的最小UPO糖型分子量为37,000 Da，估计糖基化程度约24%（表1；图S1）。通过测定T₅₀评估动力学热稳定性，获得约60°C的值，处于迄今报道的酵母表达最稳定重组UPO的范围之内（表1；图S2）。与在4°C储存数天内即完全失活的CglUPOwt不同，AckBar突变体保持近100%的储存稳定性达数月，成为蛋白质工程和未来工业应用的合适起点。重组酶在pH 5.0至9.0范围内有活性（表1；图S3）。在动力学参数方面，观察到AckBar的DMP催化效率显著增加（表1；图S4），这是筛选所用底物的副作用，尽管同时出现了底物抑制的增加。藜芦醇的氧化基本不变，两种变体的催化效率相对相似。
【数据】菌株：P. pastoris（Komagataella phaffii）；产量：AckBar约90 mg/L（亲本的3倍）；分子量：37,000 Da（SDS-PAGE）；糖基化：约24%；T₅₀：约60°C；pH范围：5.0–9.0；储存稳定性：4°C数月近100%（AckBar）、数天完全失活（CglUPOwt）；数值：生物反应器30 L
末端烯烃的抗马氏规则Wacker-Tsuji氧化
在完成亲本CglUPOPic和AckBar的生产、纯化和表征后，对一系列工业相关化合物的氧化进行了研究。我们从过加氧酶的典型模型底物苯乙烯（1）开始，观察到主要产物为预期的氧化苯乙烯（1a）（表2，条目1和2）。与S. cerevisiae表达的酶一样，使用0.1 μM低酶载量时观察到高总转化数（>5,000 TTN）和中等对映选择性[ee (S) 52%]。末端烯烃的抗马氏规则化学选择性Wacker-Tsuji氧化非常理想，因为这些反应可在温和条件下直接获得醛。有趣的是，亲本CglUPOPic和AckBar均形成苯乙醛（1b），即抗马氏规则Wacker-Tsuji氧化产物，TTN约800，但化学选择性适中（醛:环氧化物比例约0.15）。测试了另外两种苯乙烯类底物，4-氯苯乙烯（2）（条目3和4）和α-甲基苯乙烯（3）（条目5和6），两种变体均实现了普遍更高的醛/环氧化物比例。特别是，2被氧化为醛（2b），TTN > 2,500，化学选择性显著更高，CglUPOPic和AckBar分别为0.51和0.79。
【数据】底物：苯乙烯（1）、4-氯苯乙烯（2）、α-甲基苯乙烯（3）；酶载量：0.1 μM；TTN：苯乙烯>5,000、苯乙醛约800、4-氯苯乙烯醛>2,500；ee：苯乙烯氧化物(S) 52%；化学选择性（醛:环氧化物）：苯乙烯约0.15、4-氯苯乙烯0.51（CglUPOPic）和0.79（AckBar）；温度：原文未详述；时间：原文未详述
讨论与解读
本研究是使CglUPO——一种因其独特活性谱而备受关注的酶——变得更易获得和可进化的重要一步。通过定向进化，我们设计了一个重组分泌变体（AckBar），它对多种小有机底物具有高活性，且比同源生产的酶显著更稳定。催化烯烃抗马氏规则选择性Wacker氧化的能力使该酶成为朝此活性进化的优秀起点（工作正在进行中）。该反应具有重要的工业相关性，我们基于串联酵母表达系统（S. cerevisiae用于实验室进化，P. pastoris用于放大生产）的平台为应对这一挑战提供了直接途径。
值得注意的是，在本研究描述的进化过程中，尽管整个融合基因经历了随机诱变和重组，信号肽中未引入任何突变。但这并不表明分泌前导序列不适合朝此目标改造。实际上，在AckBar朝抗马氏规则氧化进化的过程中，研究人员有意在前导序列中引入突变，以将表达水平提升至当前极限以上，与筛选分析的灵敏度相匹配。另一个有前景的提高功能表达的策略是……
编译者解读
本研究展示了定向进化在解决UPO异源表达瓶颈中的核心价值：通过切换表达宿主获得4°C热稳定性提升、经多轮诱变将分泌量从0.6 mg/L提升至90 mg/L，说明宿主适配与突变累积可协同突破天然酶的应用限制。AckBar对THN的对映选择性反转（从(R)-20%到(S)-86%）和抗马氏规则Wacker氧化活性的出现，提示血红素通道残基F154L和M210V是调控底物取向与区域选择性的关键开关。局限在于醛/环氧化物化学选择性仍偏低（最高0.79），且信号肽未参与进化，未来可针对分泌前导序列和通道远端残基进一步改造，以提升抗马氏规则氧化的专一性。
参考来源
期刊：iScience, 2026
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117534
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117534