来源：Systematic Promoter Engineering for Enhanced Keratinase Production in Bacillus subtilis（Journal of Future Foods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
角蛋白酶在角蛋白资源高值化利用中潜力巨大，但产量低、成本高制约了其规模化应用。本研究以枯草芽孢杆菌WB600为宿主，通过五启动子筛选、串联启动子构建、5′端截短及核心区定点突变的多步启动子工程策略，系统优化了新型角蛋白酶4-3Ker-MAV-PPC1的表达。最终获得的最佳突变体psrfA-1-35使酶活提升至8752.20 U/mL，同时揭示了psrfA启动子内关键调控元件。
研究背景
角蛋白酶（EC 3.4.4.25）是一种微生物蛋白酶，能催化角蛋白水解，也可非特异性地水解胶原蛋白、酪蛋白等其他蛋白底物，在食品、饲料、皮革、制药和环境等行业应用前景广阔。然而，天然生产系统通常催化活性低、产量差，野生型生产菌株还常伴随机会致病性和复杂的下游处理等问题，阻碍了工业化规模生产。
为克服这些局限，枯草芽孢杆菌成为角蛋白酶生产的优选宿主。这种革兰氏阳性菌具有多重优势：不产内毒素和外毒素，具备强大的蛋白折叠与分泌机制，支持高细胞密度发酵，可将目标蛋白直接分泌至胞外培养基中，从而简化下游纯化。这些特性使枯草芽孢杆菌成为多种工业酶分泌生产的首选平台。
近年来，系统优化表达载体及其调控元件已成为提升枯草芽孢杆菌异源蛋白产量的关键策略，其中启动子工程是核心焦点。Jin等鉴定出pveg为最优组成型启动子……（后续内容原文节选未完整提供）。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用质粒和菌株见表S1（见补充材料）。以本课题组前期工作构建的穿梭质粒pMA5-4-3Ker-MAV-PPC1为骨架构建重组表达载体，随后转化至枯草芽孢杆菌WB600中进行蛋白表达。大肠杆菌DH5α用于基因克隆和质粒构建，角蛋白酶表达使用枯草芽孢杆菌WB600。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌株在Luria-Bertani（LB）培养基（含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl）中培养，需要时培养基中补充100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素。重组枯草芽孢杆菌菌株的角蛋白酶表达使用含50 μg/mL卡那霉素的TB培养基（含12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5 g/L甘油、16 g/L K₂HPO₄和2 g/L KH₂PO₄）。菌株在37°C、220 rpm条件下培养。本研究所用全部引物见表S2（见补充材料）。
【数据】培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）；TB（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5 g/L甘油、16 g/L K₂HPO₄、2 g/L KH₂PO₄）；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素；温度：37°C；转速：220 rpm
2.2 角蛋白酶的表达与活性测定
将各重组枯草芽孢杆菌菌株的新鲜单菌落接种至5 mL LB培养基中，在37°C、220 rpm条件下培养12 h。随后将种子培养液以2%（v/v）的接种量接种至250 mL摇瓶中的100 mL TB培养基中，在37°C、220 rpm条件下持续培养72 h。为系统监测细菌生长和酶表达动态，接种后每12 h取样一次，直至培养结束。所有发酵实验均设置三个独立生物学重复。发酵结束后收集粗酶上清液，与适量蛋白上样缓冲液（含DTT）（Solarbio，北京，中国）混合，在沸水浴中加热10 min。蛋白样品按标准方案经12% SDS-PAGE分离。凝胶用考马斯亮蓝G250染色，使用凝胶成像系统采集图像。角蛋白酶活性采用改良Folin-Ciocalteu法测定。将200 μL 2%（w/v）可溶性角蛋白、200 μL适当稀释的酶液和600 μL 50 mM磷酸缓冲液（pH 7.5）混合，在55°C孵育20 min。加入400 μL 10%（w/v）三氯乙酸终止反应。8,000 rpm离心3 min后，取150 μL上清液与750 μL 0.4 M Na₂CO₃和200 μL Folin-Ciocalteu试剂混合，继续在55°C孵育20 min。随后在680 nm处测定吸光度。构建L-酪氨酸标准曲线以定量酶促反应释放的总氨基酸（见补充材料）。一个角蛋白酶活性单位（U）定义为在上述条件下使680 nm吸光度增加0.001所需的酶量。酶活性（U/mL）计算公式为：酶活性 = (A680×稀释倍数) / (0.001×反应时间)，其中A680代表样品与空白对照的吸光度差值。
【数据】接种量：2%（v/v）；培养体积：100 mL TB/250 mL摇瓶；培养时间：72 h；取样间隔：12 h；SDS-PAGE浓度：12%；染色：考马斯亮蓝G250；底物：200 μL 2%（w/v）可溶性角蛋白；缓冲液：600 μL 50 mM磷酸缓冲液（pH 7.5）；孵育温度：55°C；孵育时间：20 min；终止液：400 μL 10%（w/v）三氯乙酸；离心：8,000 rpm、3 min；显色：150 μL上清+750 μL 0.4 M Na₂CO₃+200 μL Folin-Ciocalteu试剂；显色温度：55°C；显色时间：20 min；检测波长：680 nm；生物学重复：3个
2.3 启动子筛选
#### 2.3.1 单启动子筛选
采用高保真PCR从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增强天然组成型目标启动子片段（p43、psrfA、pspoVG、pveg及其衍生体）。随后使用In-Fusion无缝克隆将扩增的启动子片段定向插入含角蛋白酶基因4-3Ker-MAV-PPC1的线性化pMA5质粒载体中，通过同源序列重组替换原始pHpaII启动子。构建了四个相应的单启动子重组质粒：pMA5-p43-4-3Ker-MAV-PPC1、pMA5-pveg-4-3Ker-MAV-PPC1、pMA5-pspoVG-4-3Ker-MAV-PPC1和pMA5-psrfA-4-3Ker-MAV-PPC1。
【数据】启动子：p43、psrfA、pspoVG、pveg、pHpaII；克隆方法：In-Fusion无缝克隆；载体：pMA5；模板：枯草芽孢杆菌基因组DNA；原文未详述PCR具体参数
#### 2.3.2 串联启动子的构建
为构建增强表达的串联启动子表达载体，采用基于PCR的级联克隆策略。将第二个启动子单元psrfA插入单启动子重组质粒pMA5-pHpaII-4-3Ker-MAV-PPC1和pMA5-psrfA-4-3Ker-MAV-PPC1中原始启动子的下游，分别得到串联启动子质粒pMA5-pHpaII-psrfA-4-3Ker-MAV-PPC1和pMA5-psrfA-psrfA-4-3Ker-MAV-PPC1。
【数据】串联启动子组合：psrfA-psrfA、psrfA-pHpaII；方法：PCR级联克隆；原文未详述PCR具体参数
2.4 启动子优化
#### 2.4.1 启动子截短
为剖析psrfA启动子的功能核心区并优化其转录活性，对psrfA启动子的5′端进行截短，因先前研究表明去除上游抑制序列可增强启动子强度。以含全长psrfA启动子的质粒为模板设计一对特异性引物。正向引物设计为结合转录起始位点上游426 bp处，反向引物定位于启动子下游保守区。通过高保真PCR扩增含426 bp截短psrfA启动子的606 bp片段，使用In-Fusion无缝克隆插入线性化pMA5表达载体，替换原始启动子。截短重组质粒命名为pMA5-psrfA-1-4-3Ker-MAV-PPC1。
【数据】截短位点：5′端截短180 bp；启动子长度：从606 bp截短至426 bp；正向引物结合位置：转录起始位点上游426 bp；扩增片段：606 bp；克隆方法：In-Fusion无缝克隆；载体：pMA5
#### 2.4.2 启动子核心序列突变
为进一步增强截短启动子psrfA-1的活性，对其保守的-10和-35区进行定点突变。基于枯草芽孢杆菌σA因子识别的共识序列，采用重叠延伸PCR引入特异性点突变。-35区引入区域突变，将原始序列'GTGATA'改为共识序列'TATAAT'。-10区也进行区域突变，将'TAAACT'改为'TTGACT'。此外，通过同时将-35和-10区突变为各自的共识序列构建双位点突变体。所得截短重组表达质粒分别命名为pMA5-psrfA-1-10-4-3Ker-MAV-PPC1、pMA5-psrfA-1-35-4-3Ker-MAV-PPC1和pMA5-psrfA-1-1035-4-3Ker-MAV-PPC1。
【数据】-35区原始序列：GTGATA→突变序列：TATAAT；-10区原始序列：TAAACT→突变序列：TTGACT；突变方法：重叠延伸PCR；突变类型：-35单突变、-10单突变、-35/-10双突变
2.5 实时定量PCR（RT-qPCR）
为分析不同启动子驱动的角蛋白酶基因（4-3Ker-MAV-PPC1）的转录水平，进行实时定量PCR（RT-qPCR）。发酵过程中收集的细菌样品使用Total RNA Extractor（Trizol）（生工生物，上海，中国）提取总RNA。使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估提取RNA的浓度、纯度和完整性。随后使用BeyoRT™ II cDNA合成试剂盒（含gDNA Eraser）（碧云天生物技术，上海，中国）合成cDNA。RT-qPCR使用目标基因（4-3Ker-MAV-PPC1）和参照基因（16S rRNA）的特异性引物。引物序列见表S3（见补充材料）。使用HiScript II One-Step qRT-PCR SYBR Green试剂盒（诺唯赞生物，南京，中国）在LightCycler 96系统（罗氏，瑞士）上为每个cDNA样品制备独立反应。热循环方案为：95°C初始变性30 s，随后40个循环的95°C 10 s和60°C 30 s。按仪器默认程序进行熔解曲线分析以确认扩增特异性。各样品中目标基因的相对表达水平使用2(-ΔΔCt)法计算，以携带原始pHpaII启动子的重组菌株为校准品。所有反应均设三个生物学重复和三个技术重复。
【数据】RNA提取试剂：Trizol；cDNA合成试剂盒：BeyoRT™ II（含gDNA Eraser）；qPCR试剂盒：HiScript II One-Step qRT-PCR SYBR Green；仪器：LightCycler 96；初始变性：95°C、30 s；循环数：40；变性：95°C、10 s；退火/延伸：60°C、30 s；计算方法：2(-ΔΔCt)；参照基因：16S rRNA；校准品：pHpaII重组菌株；生物学重复：3；技术重复：3
2.6 数据处理与统计分析
所有发酵和酶活性测定均设三个独立生物学重复（即三个独立接种的培养物），每个生物学重复进行三次技术重复……（原文节选至此结束）。
【数据】生物学重复：3个独立接种培养物；技术重复：每个生物学重复3次；原文未详述具体统计方法
研究结果
3.1 4-3Ker-MAV-PPC1表达系统的启动子筛选
组成型启动子无需时间调控或外源诱导剂即可持续稳定表达目标基因，从而降低生产成本。为增强4-3Ker-MAV-PPC1在枯草芽孢杆菌WB600中的表达，选取了五个效率和强度不同的组成型启动子——pHpaII、p43、pspoVG、psrfA和pveg进行筛选。在72 h发酵过程中，角蛋白酶产量在60 h达到峰值。此时，携带psrfA启动子的重组菌株角蛋白酶活性最高，达8140 U/mL，比原始pHpaII启动子高1.12倍（图1A、1B）。异源蛋白的表达水平与其相应mRNA丰度密切相关。为比较各启动子的相对强度，通过RT-qPCR评估了五个重组菌株中4-3Ker-MAV-PPC1的转录水平，以pHpaII为参照。结果显示，psrfA驱动的相对mRNA水平显著升高，达到pHpaII的1.13倍；pspoVG和p43表现出相当的转录活性，而pveg几乎不驱动4-3Ker-MAV-PPC1的转录（图1C）。通过SDS-PAGE进一步分析不同启动子下的角蛋白酶表达，结果与转录趋势一致：含psrfA的重组菌株在60 h时目标蛋白积累量最高，而含pveg的菌株角蛋白酶产量极低，且出现更多非特异性蛋白条带（图1D）。这些差异可能归因于培养条件、细胞生长状态和mRNA稳定性等因素。值得注意的是，携带pveg启动子的重组菌株不仅目标角蛋白酶产量极低，而且在SDS-PAGE上显示更多非特异性蛋白条带。该现象可能与以下因素有关：pveg是一种σA依赖性强的组成型启动子，在整个发酵过程中驱动持续高水平转录，缺乏如psrfA等群体感应启动子的细胞密度依赖性动态调控。这种持续高水平表达可能在发酵早期对宿主造成代谢负担，可能触发σB介导的一般应激反应。σB作为枯草芽孢杆菌中的一般应激反应sigma因子，激活后可能激活一系列应激响应基因的表达，这些基因编码的蛋白可能表现为非特异性条带。同时，代谢负担可能改变宿主胞外蛋白酶如AprE和NprE的表达谱，而AprX和AprE等蛋白酶参与异源分泌蛋白的降解。研究表明，AprX可在细胞裂解后泄漏至培养基中，在发酵后期降解异源蛋白。当外源蛋白表达受阻时，其降解产物或宿主应激诱导蛋白可能进一步增加SDS-PAGE上的非特异性条带。该现象提示，在选择组成型启动子用于异源蛋白表达时，应仔细考虑启动子强度与宿主生理状态之间的兼容性。总之，在评估的五个组成型启动子中，psrfA被鉴定为最适合驱动4-3Ker-MAV-PPC1表达的启动子。
【数据】启动子：pHpaII、p43、pspoVG、psrfA、pveg；发酵时间：72 h；峰值时间：60 h；psrfA最高酶活：8140 U/mL；较pHpaII倍数：1.12倍；psrfA相对mRNA水平：pHpaII的1.13倍；pveg转录：几乎不驱动；生物学重复：3
3.2 串联启动子psrfA-psrfA、psrfA-pHpaII与单启动子psrfA的转录活性比较
研究表明串联多启动子可增强目标基因的表达强度。为进一步提高4-3Ker-MAV-PPC1的表达水平，将psrfA分别与自身及pHpaII串联融合，以单启动子psrfA为对照。然而，实验结果与预期显著偏离。qRT-PCR分析（图2B）显示，单psrfA启动子驱动的目标基因相对mRNA水平显著高于psrfA-psrfA串联构建体，但低于psrfA-pHpaII串联构建体。mRNA丰度升高而角蛋白酶活性降低的现象此前已有报道。与此一致，胞外角蛋白酶活性测定（图2A）显示，单psrfA启动子组角蛋白酶活性最高，而两个串联启动子构建体均导致大幅降低，分别降至对照组的0.83倍和0.67倍。SDS-PAGE分析（图2C）进一步证实了这些发现，单psrfA启动子组显示清晰且丰硕的目标蛋白条带，而串联启动子组目标蛋白表达明显减弱。这些结果表明，在本表达系统中，串联启动子配置的转录活性和蛋白表达能力均低于单启动子。这一发现提示并非所有启动子串联策略都能有效增强表达，其效果受多种因素影响，包括启动子类型、串联结构、宿主背景和目标基因特性。psrfA-pHpaII串联构建体中mRNA丰度升高与蛋白积累降低之间的差异可能由几种相互关联的机制解释。第一，串联的两个启动子单元可能产生5′非翻译区（5′UTR）构型改变或不利mRNA二级结构的转录本，尽管丰度更高但翻译效率较低。在枯草芽孢杆菌中，mRNA稳定性是重组蛋白生产的关键决定因素，5′UTR可通过影响mRNA稳定性显著影响翻译效率。此外，开放阅读框内的mRNA二级结构已被证明可降低翻译效率，mRNA堆叠区域稳定性越高，酶产率越低，尽管mRNA浓度几乎相同。鉴于枯草芽孢杆菌中转录和翻译是解偶联的，转录速率大幅超过翻译速率，这一点尤为相关。第二，串联启动子驱动的转录活性大幅升高可能压垮Sec依赖性分泌途径，导致分泌机器饱和。当蛋白合成速率超过分泌能力时，未折叠或错误折叠的蛋白可能在膜-细胞壁界面积累，触发分泌应激反应，最终降低正确折叠、分泌和活性酶的产量。第三，持续高水平表达可能使分泌的目标蛋白在发酵后期易受胞外蛋白酶如AprE和AprX的降解，因为异源蛋白分泌的瓶颈包括生长培养基中的降解。第四，两个启动子的联合转录活性可能对宿主造成过度代谢负担，使细胞资源从蛋白折叠、分泌和维持功能中分流。这些因素共同解释了为何psrfA-pHpaII串联构建体中较高的mRNA丰度未转化为更高的蛋白积累或酶活性。在4-3Ker-MAV-PPC1表达背景下，单psrfA启动子本身提供了足够的转录驱动力，而psrfA-psrfA和psrfA-pHpaII串联构建体在当前配置下未能发挥协同效应，从而影响了高效目标蛋白生产。
【数据】串联组合：psrfA-psrfA、psrfA-pHpaII；单psrfA酶活：最高；psrfA-psrfA相对酶活：0.83倍；psrfA-pHpaII相对酶活：0.67倍；mRNA水平：psrfA-pHpaII > 单psrfA > psrfA-psrfA；生物学重复：3
3.3 截短启动子psrfA-1对4-3Ker-MAV-PPC1异源表达的影响
（原文节选未完整提供该节正文，以下为根据图表清单补充的说明）
对psrfA启动子5′端进行180 bp截短，长度从606 bp缩短至426 bp（图3A）。比较截短启动子psrfA-1与全长psrfA驱动的角蛋白酶表达……（原文未详述具体结果数据）。
【数据】截短长度：180 bp；启动子长度：606 bp→426 bp；原文未详述具体酶活数据
3.4 突变启动子核心区序列对4-3Ker-MAV-PPC1异源表达的影响
（原文节选未完整提供该节正文，以下为根据图表清单补充的说明）
将截短启动子psrfA-1的-35区（GTGATA）和-10区（TAAACT）进行区域突变和双位点突变（图4A）。结果显示，-35区定点突变（psrfA-1-35）将活性提升至8752.20 U/mL，而-10区突变单独或与-35突变组合均降低活性。
【数据】-35突变体psrfA-1-35酶活：8752.20 U/mL；-10突变：活性降低；双突变：活性降低；-35区序列：GTGATA→TATAAT；-10区序列：TAAACT→TTGACT
讨论与解读
本研究通过逐步、系统的启动子工程在枯草芽孢杆菌WB600中构建了高性能角蛋白酶表达系统。工作结合了启动子筛选、设计、截短和定点突变来提供转录控制。除角蛋白酶的具体案例外，本研究提出了优化细菌基因表达的框架。由于角蛋白丰富废弃物的可持续生物加工需求日益增长，本研究中增强的生产系统对未来工业应用具有实际意义。所获得的启动子行为知识也有助于理解该微生物的转录调控，可用于重组蛋白的广泛应应用。
编译者解读：该研究以启动子工程为切入点，用"筛选—串联—截短—突变"四步策略系统优化角蛋白酶表达，方法链条清晰、可复制性强，为枯草芽孢杆菌分泌表达系统的理性设计提供了参考。其中串联启动子反而降低产量的负结果尤其值得关注——它提醒合成生物学设计中"强启动子≠高产量"，分泌途径饱和与代谢负担是不可忽视的瓶颈。局限在于研究仅基于摇瓶水平，未验证发酵罐放大效果，且截短与突变体的翻译效率、mRNA稳定性等机制层面尚未深入解析。
参考来源
期刊：Journal of Future Foods, 2026
DOI: 10.1016/j.jfutfo.2026.09.024
DOI: 10.1016/j.jfutfo.2026.09.024