来源：SaMYC2 acts as a key transcriptional activator of terpenoid biosynthesis and is subject to feedback regulation by SaGNAT01 in Santalum album L.（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
檀香（Santalum album L.）心材精油以萜类化合物为主要成分，经济价值极高，但其萜类生物合成的转录调控机制长期不明。本研究鉴定了一个核定位MYC类转录因子SaMYC2，通过DAP-seq、EMSA和双荧光素酶报告实验证实其直接结合并激活关键倍半萜合成基因SaSSy和SaCYP736A167的启动子。研究进一步揭示了一条此前未知的自我调控反馈回路：SaMYC2激活泛素样蛋白SaGNAT01的表达，而SaGNAT01蛋白又与SaMYC2互作，温和削弱后者的转录激活能力，但不影响SaMYC2蛋白稳定性。在番茄中异源过表达SaMYC2可改变果实挥发性谱并提升多种萜类含量。
研究背景
MYC转录因子属于bHLH超家族IIIe亚支，C端含bHLH结构域——由两个两亲性α螺旋和连接环组成，可介导MYC2、MYC3、MYC4等成员间的同源或异源二聚化。N端则带有转录激活结构域（TAD），能结合MED25蛋白亚基的10氨基酸片段启动转录。MYC还拥有一个茉莉酸-ZIM互作结构域（JID），这使其区别于其他bHLH蛋白，并赋予其与JAZ蛋白JAS结构域互作的能力。MYC家族基因已在多种被子植物中鉴定，包括拟南芥、牡丹、橡胶树，甚至地钱。其中MYC2是研究最为深入的成员，在茉莉酸信号通路中居核心地位，该通路依赖泛素化-蛋白酶体途径：当细胞内JA缺失或浓度较低时，负调控因子JAZ与MYC2互作，抑制JA响应基因的表达。
檀香是名贵经济树种，心材精油主要由萜类化合物构成，然而其萜类生物合成的转录调控机制研究仍十分薄弱。本研究旨在鉴定檀香中调控萜类生物合成的关键MYC转录因子，并解析其调控网络与反馈机制。
研究方法
2.1 MYC家族基因的全基因组鉴定
檀香基因组数据取自GWHCBIR00000000数据集，可在https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh获取。从Pfam蛋白家族数据库中检索bHLH-MYC_N（PF14215）和HLH（PF00010）的结构域序列，采用E值阈值1 × 10⁻⁵。檀香中候选MYC转录因子首先通过隐马尔可夫模型（HMMER）进行预测，靶向含有这些结构域的序列。随后，这些候选序列在Pfam数据库的HMMER scan网络服务器中验证bHLH-MYC_N和HLH结构域的存在。
【数据】数据库：GWHCBIR00000000（https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh）；结构域：bHLH-MYC_N（PF14215）、HLH（PF00010）；E值阈值：1 × 10⁻⁵；工具：HMMER、Pfam HMMER scan
2.2 保守基序与基因结构分析
檀香MYC蛋白序列中的保守基序使用在线程序MEME（版本4.11.2）分析。分析中最大基序数设为10，其余参数保持默认值。檀香MYC基因的内含子-外显子结构来源于檀香注释基因组数据。蛋白质的理论等电点和分子量通过ExPASy服务器测定。最终使用TBtools展示结果。
【数据】软件：MEME 4.11.2；最大基序数：10；其他参数：默认值；工具：ExPASy、TBtools
2.3 共线性分析与系统发育树构建
使用OrthoFinder进行基因复制、共线性及同线性分析，并用TBtools可视化同线性关系。同义（Ks）和非同义（Ka）替换率使用KaKs Calculator 2.0计算。采用FastTree中的最大似然法为檀香、拟南芥和水稻的MYC蛋白以及泛素化相关蛋白构建无根邻接（NJ）系统发育树。分析在广义时间可逆模型下进行，所得树通过Shimodaira–Hasegawa检验验证。
【数据】工具：OrthoFinder、TBtools、KaKs Calculator 2.0、FastTree；模型：Generalized Time-Reversible；检验方法：Shimodaira–Hasegawa test
2.4 亚细胞定位
使用基因特异性引物扩增SaMYC2和SaGNAT01的编码序列（CDS），去除终止密码子。SaMYC2扩增片段以阅读框方式插入pSAT6-EYFP-N1载体中黄色荧光蛋白（YFP）编码序列的上游。将pSAT6-EYFP-N1-SaMYC2构建体与核标记蛋白mCherry共转化至拟南芥叶肉原生质体中。在22 °C光照条件下孵育12 h后，使用Zeiss LSM 510共聚焦显微镜检测YFP荧光。对于SaGNAT01，将片段以阅读框方式融合至pBWA(V)H2STMVΩ载体中绿色荧光蛋白（GFP）的N端。随后将质粒导入根癌农杆菌GV3101菌株。转化后的农杆菌细胞浸润至本氏烟草叶片中。浸润植株置于28 °C温室中维持两天，之后使用Leica TCS SP8 STED ONE共聚焦显微镜检测荧光信号。
【数据】温度：22 °C（原生质体孵育）、28 °C（烟草温室）；时间：12 h（原生质体）、2天（烟草）；菌株：农杆菌GV3101；载体：pSAT6-EYFP-N1、pBWA(V)H2STMVΩ；显微镜：Zeiss LSM 510、Leica TCS SP8 STED ONE
2.5 SaMYC2的DAP-Seq
DAP-Seq按标准方案进行。从十年生檀香叶片提取的基因组DNA经富集、片段化后制备Illumina测序文库。SaMYC2蛋白与片段化基因组DNA互作。结合的DNA片段随后在Illumina HiSeq™ 4000平台上测序。干净的DAP-Seq读长使用Bowtie2（版本2.2.5）比对至檀香基因组。低比对质量读长被过滤，唯一比对至基因组单一位置的读长用于后续生物信息学分析。从转录起始位点（TSS）到转录终止位点（TES）区间及上下游2k区间的所有读长使用deepTools（版本3.2.0）定量。各组内生物学重复间的峰经过滤，仅保留两个重复中均存在的峰用于后续分析。富集峰区域用MACS2（版本2.1.2）鉴定，峰相关基因用ChIPseeker注释。保守基序检测使用MEME Suite，KEGG通路富集分析使用KOBAS 2.0数据库。所有DAP-Seq流程及后续数据分析由广州Gene Denovo生物技术有限公司完成，设两个独立生物学重复。质粒构建所用引物列于补充数据1。
【数据】测序平台：Illumina HiSeq™ 4000；比对工具：Bowtie2 v2.2.5；定量工具：deepTools v3.2.0；峰鉴定：MACS2 v2.1.2；注释：ChIPseeker；基序检测：MEME Suite；KEGG：KOBAS 2.0；植物材料：十年生檀香叶片；生物学重复：2个
2.6 酵母双杂交实验
SaMYC2的CDS根据其保守结构域进行截短修饰，随后插入PGBKT7（BD）载体。该构建体经验证无自激活活性。同时，SaGNAT01的全长CDS克隆至PGADT7（AD）载体。两个重组质粒共导入Y2H Gold酵母细胞。为评估蛋白-蛋白互作，转化子在多种选择培养基上筛选：SD/-Leu-Trp（DDO）、SD/-Leu-Trp-His添加5 mM 3-AT（TDO）以及SD/-Leu-Trp-His-Ade（QDO）。阳性对照使用携带pGBKT7–53（P53-BD）和pGADT7-T（T-AD）的共转化子，阴性对照使用pGBKT7-lam（Lam-BD）和pGADT7-T（T-AD）建立。载体构建所用引物列于补充数据1。
【数据】菌株：Y2H Gold酵母；载体：PGBKT7（BD）、PGADT7（AD）；筛选培养基：DDO、TDO（5 mM 3-AT）、QDO；阳性对照：P53-BD + T-AD；阴性对照：Lam-BD + T-AD
2.7 双分子荧光互补（BiFC）实验
为进行BiFC实验，通过将SaMYC2和SaGNAT01的全长CDS分别克隆至pSm35s载体，构建pSm35s-MYC2-cYFP和pSm35s-nYFP-SaGNAT01质粒。这些质粒随后转化至根癌农杆菌GV3101菌株。转化后的农杆菌浸润至本氏烟草叶片。浸润的本氏烟草植株在28°C温室中生长两天。随后使用共聚焦显微镜（Leica TCS SP8 STED ONE，Wetzlar，德国）观察荧光信号。阴性对照包括两组组合：pSm35s-cYFP与pSm35s-nYFP-SaGNAT01，以及pSm35s-MYC2-cYFP与pSm35s-nYFP，还包括pSm35s空质粒（pSm35s-cYFP + pSm35s-nYFP）。载体构建所用引物详见补充数据1。
【数据】载体：pSm35s-MYC2-cYFP、pSm35s-nYFP-SaGNAT01；菌株：农杆菌GV3101；温度：28°C；时间：2天；显微镜：Leica TCS SP8 STED ONE；阴性对照：3组组合
2.8 GST pull-down实验
GST pull-down实验中，将1000 μg诱饵蛋白SaGNAT01-GST加入一个离心管，同时将1000 μg GST标签蛋白加入另一管作为对照。用IP稀释缓冲液将体积补至1 mL，室温轻柔混匀2 h。随后加入0.5 mL预冷IP洗涤缓冲液，洗涤三次。然后向每管加入1000 μg SaMYC2-His蛋白，用IP稀释缓冲液调整体积至1 mL。样品在4°C轻柔混匀16 h，随后每次用0.5 mL预冷IP洗涤缓冲液洗涤三次。从珠子上洗脱的蛋白通过免疫印迹分析，使用抗GST（1:10,000，CUSABIO，货号CSB-MA000304，美国）或抗His（1:5000，CUSABIO，货号CSB-MA000159，美国）抗体。
【数据】蛋白用量：SaGNAT01-GST 1000 μg、GST 1000 μg、SaMYC2-His 1000 μg；缓冲液体积：IP稀释缓冲液至1 mL、IP洗涤缓冲液0.5 mL×3次；温度/时间：室温2 h、4°C 16 h；抗体稀释比：anti-GST 1:10,000、anti-His 1:5000
2.9 Co-IP实验
将SaMYC2和SaGNAT01的全长CDS克隆至pBWA(V)Hs-TMVΩ载体，构建35S:SaMYC2-MYC和35S:SaGNAT01-GFP质粒。等量的这些质粒随后转入烟草原生质体。蛋白使用IP裂解缓冲液（25 mM Tris•HCl pH 7.4，150 mM NaCl，……）提取。
【数据】载体：pBWA(V)Hs-TMVΩ；构建体：35S:SaMYC2-MYC、35S:SaGNAT01-GFP；裂解缓冲液：25 mM Tris•HCl pH 7.4、150 mM NaCl；材料：烟草原生质体
研究结果
3.1 檀香SaMYC家族基因的鉴定与系统发育分析
通过本地BLASTP和HMMER分析，在檀香基因组中鉴定出共11个含bHLH和MYC结构域的转录因子。这11个MYC蛋白的氨基酸长度范围为415至716个残基（平均570.45 aa），预测等电点（pI）跨度为4.90–8.45（平均6.47）。其分子量（MW）介于46.36至77.66 kDa之间（平均62.99 kDa）。亚细胞定位预测确认所有11个MYC蛋白均定位于细胞核。为阐明进化关系，使用檀香（11个）、拟南芥（14个）和水稻（7个）的MYC蛋白序列构建了无根邻接（NJ）系统发育树。基于序列相似性和树拓扑结构的系统发育分类将檀香MYC转录因子分为五个不同亚组。第2组为最大分支，含三个转录因子，其余亚组各含两个成员。
【数据】鉴定转录因子数：11个；氨基酸长度范围：415–716 aa（平均570.45 aa）；pI范围：4.90–8.45（平均6.47）；分子量范围：46.36–77.66 kDa（平均62.99 kDa）；系统发育分组：5个亚组；最大亚组：第2组（3个成员）；物种：檀香11个、拟南芥14个、水稻7个
3.2 SaMYC基因的基序与结构分析
为评估遗传多样性，我们研究了11个SaMYC基因间的保守基序。MEME程序共鉴定出10个保守基序。所有11个MYC基因均以相似序列含有保守基序1、4、6和7。其中9个MYC基因包含保守基序5，SaMYC8和SaMYC10例外。此外，保守基序9为SaMYC2所独有，提示其功能分化可能与此独特性有关。为研究檀香MYC基因的功能与进化角色，我们分析了其结构多样性。分析揭示了MYC基因间不同的外显子-内含子结构：6个基因仅含单个外显子而无内含子，3个基因含8个外显子和7个内含子。值得注意的是，SaMYC09具有6个外显子和6个内含子，SaMYC06呈现7个外显子和6个内含子的独特构型。
【数据】保守基序总数：10个；共有基序：1、4、6、7（全部11个基因）；基序5：9个基因含（SaMYC8、SaMYC10除外）；基序9：SaMYC2独有；外显子-内含子结构：6个基因单外显子无内含子、3个基因8外显子7内含子、SaMYC09为6外显子6内含子、SaMYC06为7外显子6内含子
3.3 SaMYC家族基因的共线性分析
进行共线性分析以研究檀香中鉴定的MYC基因的进化关系。鉴定出5对直系同源基因对（SaMYC1/SaMYC4、SaMYC2/SaMYC7、SaMYC3/SaMYC6、SaMYC5/SaMYC8、SaMYC9/SaMYC11），均为片段重复的产物。这些重复对的Ka/Ks比值范围为0.13至0.31，表明这些片段重复事件受到强纯化选择。此外，在檀香、拟南芥和水稻间进行了跨物种直系同源分析，揭示与拟南芥有15对直系同源基因对，与水稻有1对。进一步比较檀香与拟南芥的MYC基因，初步揭示了檀香中MYC家族的谱系特异性收缩。
【数据】片段重复基因对：5对（SaMYC1/SaMYC4、SaMYC2/SaMYC7、SaMYC3/SaMYC6、SaMYC5/SaMYC8、SaMYC9/SaMYC11）；Ka/Ks比值范围：0.13–0.31；跨物种直系同源：与拟南芥15对、与水稻1对
3.4 SaMYC2的特征、组织表达与亚细胞定位
作为MYC家族的核心转录因子，MYC2在植物次生代谢调控中扮演主开关角色。因此，选择SaMYC2研究其是否参与檀香精油的生物合成。将SaMYC2与来自26个植物物种的28个bHLH蛋白进行系统发育分析，揭示其与拟南芥AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4进化关系最近。此外，SaMYC2与茶树CsMYC2、长春花CrMYC2和黄花蒿AaMYC2表现出密切同源性（图1A）。结构建模和序列比对表明，SaMYC2的C端含有一个典型的bHLH结构域，由两个两亲性α螺旋通过一个环区连接组成（图1B）。组织特异性表达谱显示SaMYC2转录本在根、茎、叶和愈伤组织中均有较高水平，暗示其在檀香生理中具有广泛功能（图1C）。进化分析表明SaMYC2与拟南芥AtMYC2密切相关。随后我们将檀香SaMYC2基因转化至拟南芥AtMYC2基因的T-DNA插入突变体。在1/2 MS培养基上，野生型（Col）、jin1–8和35S:SaMYC2-jin1–8植株间根长无显著差异（数据未展示）。然而，当培养基中添加100 μM MeJA时，野生型（Col）拟南芥植株根长显著缩短。相比之下，突变体jin1–8的根生长未受显著抑制，表现出对MeJA不敏感的的表型。35S:SaMYC2-jin1–8转基因植株表现出对MeJA敏感的表型，其根生长受到显著抑制，长度明显缩短（图1D、E）。这表明SaMYC2能够互补AtMYC2突变体jin1–8的部分表型，进一步证实SaMYC2是AtMYC2的同源基因且可能功能相似。亚细胞定位实验确认SaMYC2-YFP融合蛋白定位于细胞核，与核标记mCherry共定位（图1F），与其预测的转录调控功能一致。
【数据】系统发育分析：28个bHLH蛋白来自26个植物物种；最近缘：AtMYC2、AtMYC3、AtMYC4；MeJA浓度：100 μM；培养基：1/2 MS；突变体：jin1–8；转基因株系：35S:SaMYC2-jin1–8；表型：野生型根长显著缩短、突变体不敏感、转基因株系敏感且根长明显缩短
3.5 SaMYC2的全基因组DAP-Seq分析
为在全基因组范围内鉴定SaMYC2在檀香中的潜在直接靶标，进行了DAP-Seq分析。该分析在重复1和重复2中分别鉴定出35,291和44,141个峰，其中28,234个重叠峰被鉴定（图2A）。峰分布分析显示21.01%的峰位于启动子区域（起始密码子ATG上游≤2 kb），3.08%位于第一外显子，4.74%位于其他外显子区域，12%位于第一内含子，27.53%位于其他内含子，21.72%位于远端基因间区（图2B）。峰相关基因的通路富集分析揭示SaMYC2调控广泛的生物学过程，包括核质运输、N-聚糖生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，尤其富集于次生代谢物生物合成如萜类骨架、泛醌和其他萜类-醌、单萜、倍半萜和三萜（图2C）。值得注意的是，SaMYC2参与泛素介导的蛋白水解，提示其可能与檀香中泛素化相关蛋白存在互作（图2C）。使用MEME套件进行的保守基序分析鉴定出两个SaMYC2结合的共有序列。主要基序为富含AC的元件（E值：4.1e-003），包含先前表征的G-box（CACGTG）及其变体如CAGGTG和CACGCG（图2D）。第二个基序鉴定为富含TC的元件，具有TCCTCC基序（图2D），表明SaMYC2与拟南芥MYC转录因子相比具有相似但不同的DNA结合特性。
【数据】重复1峰数：35,291；重复2峰数：44,141；重叠峰：28,234；峰分布：启动子21.01%、第一外显子3.08%、其他外显子4.74%、第一内含子12%、其他内含子27.53%、远端基因间区21.72%；主要基序：AC-rich元件（E值4.1e-003，含G-box CACGTG及变体CAGGTG、CACGCG）；第二基序：TC-rich元件（TCCTCC）
3.6 SaMYC2直接结合SaSSy和SaCYP736A167的启动子并正向激活其表达
鉴于在SaCYP736A167启动子区域鉴定到一个明显的峰（图S5A），我们进一步分析了所有关键倍半萜生物合成基因的克隆启动子，包括SaCYP736A167和SaSSy。尽管在SaSSy启动子中未检测到显著峰，但两个启动子均含有SaMYC2识别顺式作用元件（CAE）或其变体。因此我们研究了SaMYC2是否直接调控SaSSy和SaCYP736A167的表达。首先，使用含CAGGTG基序的46-bp SaSSy启动子片段进行电泳迁移率变动实验（EMSA）（图3A），结果显示SaMYC2结合至含CAGGTG基序的SaSSy启动子标记片段，而对该基序的突变序列未观察到结合亲和力。与此一致，过量未标记探针（冷探针）与标记探针竞争结合SaMYC2，减弱了迁移条带（图3A），这证明了特异性……
【数据】启动子片段长度：46 bp；核心基序：CAGGTG；EMSA结果：SaMYC2结合含CAGGTG的SaSSy启动子片段、突变序列无结合、冷探针竞争减弱迁移条带
讨论与解读
MYC作为bHLH超家族转录因子的关键成员，在调控多种生物学过程中的基因重编程方面至关重要。本研究对檀香MYC家族的系统鉴定与表征，为深入理解MYC参与檀香特定生物学过程的机制提供了重要基础。共线性分析显示，檀香SaMYC与水稻仅有1对直系同源基因对，而与拟南芥有15对，表明檀香SaMYC与拟南芥AtMYC进化关系更近。初步观察还发现，与拟南芥相比，檀香中MYC家族存在谱系特异性收缩，这一变化可能与檀香的环境适应及独特代谢物生物合成相关。作为MYC家族的关键组分，MYC2作为主调控因子整合植物激素和光敏色素信号，指导全基因组转录重编程。本研究数据显示SaMYC2在根、茎、叶和愈伤组织等多种组织中高表达，DAP-seq结果也表明SaMYC2参与檀香广泛的生物学过程。
本研究最核心的发现是揭示了一条此前未知的自我调控反馈回路：SaMYC2直接结合并激活倍半萜合成关键基因SaSSy和SaCYP736A167的启动子，促进萜类生物合成；同时，SaMYC2转录激活泛素样蛋白SaGNAT01的表达，而SaGNAT01蛋白又与SaMYC2发生互作，削弱SaMYC2对靶基因启动子的转录激活活性，但不影响SaMYC2蛋白的稳定性。这种"激活-反馈抑制"机制为萜类生物合成的精细调控提供了新的分子框架。
编译者解读：该研究在合成生物学层面具有双重价值。一方面，SaMYC2作为萜类合成的正向调控枢纽，可直接用于檀香或异源宿主中萜类产量的代谢工程改造——番茄异源过表达实验已初步验证了这一策略的可行性。另一方面，SaGNAT01介导的负反馈回路揭示了一个工程化改造中常被忽视的问题：单纯过表达正向转录因子可能触发内源反馈抑制，削弱预期效果。未来在构建高产萜类底盘细胞时，可考虑同步敲除或弱化SaGNAT01类反馈因子，以解除刹车、释放SaMYC2的全部激活潜力。该研究的局限在于反馈调控的定量贡献尚未明确，SaGNAT01对萜类最终产量的影响幅度有待进一步量化。
参考来源
期刊：Industrial Crops and Products, 2026
DOI：10.1016/j.indcrop.2026.124451
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124451