来源：Sodium alginate–modified laser-induced graphene microalgal biosensor for sensitive monitoring of PS-II-inhibiting herbicides（Analytica Chimica Acta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
除草剂在水环境中的持久残留对生态系统构成持续威胁。本研究开发了一种海藻酸钠修饰的激光诱导石墨烯（LIG）微藻生物传感器，将完整的微拟球藻（Nannochloropsis sp.）和普通小球藻（Chlorella sp.）细胞包埋于海藻酸钠水凝胶中，固定于导电LIG电极表面，实现对光合系统II（PS-II）抑制型除草剂的光电化学监测。该平台对灭草隆的检测限低至60.86 nM，对扑灭津为178.32 nM，并在湖水与农业径流实际水样中表现出可靠的检测性能。
研究背景
全球农业生产力需求的持续攀升，推动了扑灭津、灭草隆和敌草隆等PS-II靶向除草剂的广泛使用。这些化合物通过地表径流和淋溶从陆地向水生生态系统迁移，在水体和沉积物中的降解半衰期从数周到一年以上不等。其毒性机制在于结合光合生物类囊体膜中的D1蛋白，阻断电子传递，抑制ATP和NADPH的生成。微藻作为水生生态系统的初级生产者，对PS-II抑制型除草剂高度敏感，其光合效率或生长的任何扰动都可能损害初级生产力并沿食物链产生生物放大效应。小球藻和微拟球藻因此被视为评估水环境中PS-II抑制型除草剂的敏感生物指示物。当前监测手段多依赖色谱等分析技术，难以反映污染物的生物毒性效应。本研究以全细胞微藻作为生物识别元件，结合激光诱导石墨烯电极与海藻酸钠水凝胶固定化策略，构建了一种兼具生物相关性与电化学灵敏度的传感平台。
研究方法
2.1 化学品与仪器
海藻酸钠（药用二级标准品，认证参考物质）用作生物相容性固定化基质，将微藻菌株包埋于电极表面，在保持生物活性的同时确保结构稳定性。灭草隆（认证参考物质）、敌草隆（分析标准品）和扑灭津（分析标准品）用作模型PS-II抑制型除草剂，用于传感器评估和分析研究。所有化学品均购自Merck在线商店，按接收状态使用，未经进一步纯化。电极制造使用CO₂激光雕刻系统（VLS 3.60，30 W，10.6 μm CO₂激光源，Universal Laser Systems，美国亚利桑那州）。所有电化学测量均使用便携式恒电位仪在非光照条件下进行，以评估所开发生物电极平台的本征电化学行为。光照仅在光电化学计时安培法（CA）实验期间使用校准LED光源施加，以研究光诱导光电流产生和光合活性。表面润湿性和亲水性通过光学张力计（Biolin Scientific Theta Lite，瑞典）进行静态接触角测量评估，遵循标准表面表征规范。所制造电极的电导率使用电导率测量仪（Ossila四探针系统，英国）测量。光照和黑暗条件下的光响应行为使用校准LED太阳模拟器（MiniSol型号LSH-7320，美国）评估，以确保受控且可重复的辐照。太阳模拟器提供约400–800 nm的宽带模拟太阳光照，最大输出强度为110 mW/cm²，用于所有涉及光暗循环实验的光电化学测量。电极表面及固定化微藻层的形貌表征使用扫描电子显微镜（SEM，Thermo Fisher Scientific，美国）进行。
【数据】激光系统：CO₂激光器，30 W，10.6 μm；太阳模拟器波长范围：400–800 nm；最大输出强度：110 mW/cm²；接触角测量仪：Biolin Scientific Theta Lite；电导率仪：Ossila四探针系统；SEM：Thermo Fisher Scientific
2.2 微藻培养与制备
小球藻（Chlorella sp.）和微拟球藻（Nannochloropsis sp.）菌株在受控实验室条件下培养，以确保在生物传感器集成前健康稳定的生长，如图1所示。小球藻在Tris-乙酸-磷酸（TAP）培养基中生长，微拟球藻在Bold基础培养基（BBM）中培养。培养基pH维持在8–9，以支持微藻最佳生长。对于两种菌株，将10%的接种物从先前维护的储备培养物转移至新鲜无菌培养基中以启动继代培养。培养物在适当光照和环境生长条件下维持一周，以允许足够的生物量发展和生理稳定。培养期结束后，活跃生长的微藻悬浮液直接用于后续固定化和传感应用。对于储存，微藻培养物可在4°C下维持长达一个月，活性损失极小。对于长期保存，培养物经离心、去除上清液后，所得生物量沉淀物储存于−80°C，可保存约6–12个月。在室温条件下，培养悬浮液保持稳定约一周，之后活性和光合活性显著下降。
【数据】小球藻培养基：TAP；微拟球藻培养基：BBM；pH：8–9；接种量：10%；培养时间：一周；储存温度：4°C（最多1个月）；长期保存温度：−80°C（6–12个月）；室温稳定性：约一周
2.3 电极制造
电化学传感器平台采用激光诱导石墨烯（LIG）在125 μm厚的聚酰胺薄膜上制造。设计包括一个直径为4 mm的圆形工作电极，连接至延伸至2 mm宽接触垫的导电迹线，用于外部电气连接。活性电极长度为30 mm，生物传感器总长度为35 mm。对电极和参比电极对称排列，电极间距均匀为2 mm，实现可靠的小型化生物传感性能，如图2(b)所示。整体光电化学配置如图2(a)所示。对于生物功能化，首先将一定体积的微藻悬浮液滴铸到LIG工作电极表面，使细胞沉降并粘附。溶剂部分蒸发后，将一滴海藻酸钠溶液施加在细胞层上，如图2(c)所示。随后通过将电极浸入含氯化钙的固定化缓冲液中使海藻酸盐基质交联，形成稳定的海藻酸钙水凝胶，将微藻细胞牢固封装在LIG表面。除提供机械固定化外，多孔水凝胶网络还创建了生物相容性微环境，有助于维持微藻活力并最大限度减少重复测量期间的细胞脱落。水合海藻酸钙基质促进分析物扩散和离子传输，同时降低界面电阻，从而促进固定化微藻与导电LIG表面之间更高效的电子转移[23],[24],[25]。此外，水凝胶层通过保持均匀的细胞分布和保护生物界面在传感器操作期间免受机械破坏来改善信号稳定性[26],[27]。修饰后的LIG电极随后用作功能性生物传感界面，以微拟球藻和小球藻作为传感微藻系统，检测灭草隆、敌草隆和扑灭津。
【数据】聚酰胺薄膜厚度：125 μm；工作电极直径：4 mm；接触垫宽度：2 mm；活性电极长度：30 mm；生物传感器总长度：35 mm；电极间距：2 mm；交联剂：氯化钙
2.4 激光参数优化
LIG基生物传感器电极采用系统变化的激光参数制造，功率水平范围为30 W CO₂激光源的11%至13%，扫描速度范围为最大速度1200 mm/s的4%至5%。对所得电极进行电导率和表面润湿性评估，以确定最佳制造条件。高电导率是促进快速电子转移和最小化生物传感平台内界面电阻所必需的[28],[29]，而亲水性表面对于实现高效微藻固定化和生物电极界面处与传感介质的有效相互作用至关重要，包括稳定的生物识别层附着和增强的分析物可及性[30],[31],[32]。因此，最佳激光参数集基于在电导率和表面亲水性之间实现最有利的平衡来选择，确保可靠且可重复的生物传感性能。如表1总结和图3所示，LIG电极的电化学和表面特性受激光功率和扫描速度的强烈影响。在评估的条件中，以30 W的13%功率和1200 mm/s的4%速度制造的电极显示出最高的电导率93.81 S/m、最低的电阻率1.06 × 10⁻² Ωm和最小的薄层电阻88.81 Ω/sq，表明优异的石墨化程度和电荷传输性能。此外，该参数集产生的接触角为47.67°，证实表面具有足够的亲水性，有利于微藻固定化和与传感介质的有效相互作用。基于电性能和表面润湿性之间的最佳平衡，选择13–4参数组合用于后续生物传感器制造和电化学研究。
【数据】激光功率范围：11–13%（30 W CO₂激光源）；扫描速度范围：4–5%（最大1200 mm/s）；最优参数：13%功率、4%速度；电导率：93.81 S/m；电阻率：1.06 × 10⁻² Ωm；薄层电阻：88.81 Ω/sq；接触角：47.67°
2.5 微结构与组成分析
修饰后LIG基生物电极在微藻固定化后的表面形貌使用扫描电子显微镜（SEM）检查，以评估微结构特征和生物-电极界面形成。如图4(a和b)所示，固定化于LIG表面的小球藻……
【数据】表征方法：SEM；放大倍数：10 μm和2 μm
研究结果
3.1 除草剂检测的浓度依赖性分析性能
微藻修饰LIG生物电极的分析性能基于在藻类生长培养基（pH 8–9）中除草剂浓度线性范围（100 nM至10 μM）内的浓度依赖性电流抑制进行评估。如图7所示，检测灵敏度随藻种和所测除草剂的不同而显著变化。插图展示了稳态电流对除草剂浓度的相应校准曲线，误差棒代表三次独立测量的标准差（n = 3），表明传感响应具有良好的重现性。灭草隆的最低检测限在微拟球藻作为传感生物组分时观察到，检测限（LOD）为60.86 nM，定量限（LOQ）为202.89 nM；而小球藻产生较高的检测阈值，LOD为214.28 nM，LOQ为714.28 nM，表明灵敏度降低。类似地，在扑灭津暴露下，微拟球藻固定化系统实现了LOD为178.32 nM和LOQ为594.40 nM，而小球藻固定化系统显示略高的限值，LOD为187.50 nM，LOQ为625 nM。在敌草隆的情况下，两种藻类平台均获得相对较高的检测限，微拟球藻的LOD为225 nM，小球藻的LOD为900 nM，反映出较弱的电流抑制。灭草隆和扑灭津所达到的低纳摩尔检测限凸显了所开发平台的高分析灵敏度，并证明了其检测痕量PS-II抑制型除草剂的能力。总体而言，微拟球藻的灵敏度趋势为灭草隆 < 扑灭津 < 敌草隆，而小球藻观察到略微不同的趋势，即扑灭津 < 灭草隆 < 敌草隆，这与它们与PS-II的差异性抑制相互作用一致。这些关键参数的总结进一步汇编于表3中。微拟球藻观察到的优异分析性能归因于增强的生物-电极界面耦合和更高效的电荷转移动力学，导致除草剂暴露时产生明显的信号抑制。该浓度依赖性检测评估旨在验证生物传感平台对环境相关除草剂监测的定量灵敏度和实际适用性。重要的是，这些结果与基于SEM的微结构分析一致，其中LIG基质内改善的细胞整合和独特的元素特征支持更有效的界面相互作用。总体而言，电化学发现证实了系统的结构-功能一致性，差分脉冲伏安法（DPV）测量进一步验证了这一点，揭示了在所研究范围内明确的峰电流调制、改善的信号分辨率和浓度依赖性响应特征。
【数据】浓度线性范围：100 nM–10 μM；培养基pH：8–9；重复次数：n = 3；灭草隆（微拟球藻）：LOD 60.86 nM，LOQ 202.89 nM；灭草隆（小球藻）：LOD 214.28 nM，LOQ 714.28 nM；扑灭津（微拟球藻）：LOD 178.32 nM，LOQ 594.40 nM；扑灭津（小球藻）：LOD 187.50 nM，LOQ 625 nM；敌草隆（微拟球藻）：LOD 225 nM；敌草隆（小球藻）：LOD 900 nM；灵敏度趋势（微拟球藻）：灭草隆 < 扑灭津 < 敌草隆；灵敏度趋势（小球藻）：扑灭津 < 灭草隆 < 敌草隆
3.2 基于DPV的PS-II抑制定量
差分脉冲伏安法（DPV）用于进一步阐明LIG基藻类生物传感平台对PS-II抑制型除草剂的电分析行为。DPV测量在非光照条件下进行，允许在无光诱导电流产生贡献的情况下评估除草剂暴露的电化学影响。如图8(a–f)所示，与对照PBS相比，暴露于灭草隆、扑灭津和敌草隆时观察到峰电流响应的明显调制，证实了除草剂诱导的破坏。微拟球藻固定化系统比小球藻固定化平台显示出更明显的峰电流衰减和更尖锐的伏安特征，表明增强的界面电子转移效率和更强的信号转导。除草剂存在下峰电流强度的降低归因于PS-II介导的电荷分离受到抑制，从而限制了光生电子用于界面氧化还原过程的可利用性。值得注意的是，峰抑制幅度遵循灭草隆 < 扑灭津 < 敌草隆的趋势，与浓度依赖性分析和相应的检测限一致。从图8(a–f)提取的峰电流响应的相应直方图呈现于图8(g)中，用于简化的比较可视化。对照与除草剂处理响应之间的清晰分离，连同浓度依赖性峰电流衰减，证明了所开发平台对PS-II抑制的高灵敏度，并进一步支持微藻-LIG界面处高效的电荷转移相互作用。DPV固有的改善信号分辨率和降低的电容背景进一步证实了所开发生物传感器的灵敏度。这些伏安发现强化了通过SEM分析建立的结构-功能相关性，并确认了该平台对PS-II靶向化合物进行快速毒性筛查和电化学监测的稳健性。
【数据】测量条件：非光照；除草剂：灭草隆、扑灭津、敌草隆；对照：PBS；峰抑制趋势：灭草隆 < 扑灭津 < 敌草隆
3.3 干扰物存在下的传感器选择性评估
循环伏安法（CV）用于评估所开发LIG基藻类生物传感平台在常见环境物种（包括尿素、磷酸盐、亚硝酸盐和氨）存在下对PS-II抑制型除草剂的选择性和抗干扰性能。测量在非光照条件下进行，电位窗口为−1.0至+1.0 V，扫描速率为50 mV/s。如图9所示，灭草隆(a, b)、扑灭津(c, d)和敌草隆(e, f)记录的伏安响应在两种藻类传感介质中均保持明显的除草剂诱导电流调制。插图直方图代表对应于不同干扰物种的提取氧化电流响应，误差棒表示三次独立测量的标准差（n = 3），从而确认传感平台的重现性。对于大多数干扰物种，相对于仅除草剂条件，仅观察到峰形状和电流幅度的微小偏差。然而，在微拟球藻固定化介质（左侧面板）中的氨的情况下，记录了电流响应的明显增加，表明可能与非氨相关的界面相互作用有关的额外电化学贡献。尽管存在这种局部增强，特征性除草剂依赖性信号轮廓仍可区分，表明PS-II抑制继续主导传感机制。相比之下，小球藻固定化介质（右侧面板）在所有干扰条件下表现出相对稳定的伏安行为。总体而言，结果确认虽然某些物种（如氨）可以影响微拟球藻固定化介质中的电流幅度，但平台保持除草剂信号的清晰分析区分，支持其在化学复杂环境中的功能选择性和适用性。为了进一步评估所提出的生物传感平台在环境相关条件下的稳健性，使用马拉硫磷（一种广泛使用的有机磷农药）和Cd²⁺离子（代表经常与农业除草剂残留共存的毒性重金属污染物）进行了额外干扰研究。如图10所示，马拉硫磷或Cd²⁺的存在在微拟球藻和小球藻固定化传感系统中对灭草隆、扑灭津和敌草隆获得的伏安曲线仅产生微小改变。提取的氧化电流响应（插图）显示除草剂诱导的信号……
【数据】测量条件：非光照；电位窗口：−1.0至+1.0 V；扫描速率：50 mV/s；干扰物：尿素、磷酸盐、亚硝酸盐、氨、马拉硫磷、Cd²⁺；重复次数：n = 3
讨论与解读
本研究开发的海藻酸钠修饰LIG微藻生物传感器，将完整的微拟球藻和小球藻细胞包埋于生物相容性水凝胶基质中，实现了对PS-II抑制型除草剂的光电化学监测。海藻酸钠修饰增强了微藻固定化效果、结构稳定性和生物相容性，导电LIG基底则提供了高效的光电化学信号转导。该平台对灭草隆和扑灭津分别达到60.86 nM和178.32 nM的低纳摩尔检测限，在环境相关浓度范围内展现出高灵敏度。使用全细胞微藻赋予了对PS-II抑制剂的内在选择性，无需合成受体或酶修饰。平台在重复测量和独立制造批次间表现出优异的重复性和重现性。基于PS-II的传感机制使其特别适合PS-II抑制型除草剂的快速毒性筛查，而非混合样品中单个化合物的选择性鉴定。
编译者解读：该研究的方法学亮点在于用全细胞微藻替代纯化酶或抗体作为生物识别元件，降低了传感器构建成本并保留了PS-II抑制剂的广谱响应能力。海藻酸钠水凝胶的引入解决了微藻在电极表面固定不牢的工程难题。不过，全细胞传感固有的局限性也不容忽视——藻类活性受温度、光照历史和培养基组成影响，可能带来批次间变异；平台对同类除草剂缺乏种间选择性，更接近毒性筛查工具而非定量分析仪器。未来若能与微流控样品前处理或机器学习信号解卷积联用，有望在环境现场监测中释放更大潜力。
参考来源
期刊：Analytica Chimica Acta, 2026
DOI: 10.1016/j.aca.2026.345883
DOI: 10.1016/j.aca.2026.345883