来源：Efficient Ergothioneine Production in Saccharomyces cerevisiae through Synergistic Multilevel Metabolic Engineering and Adaptive Process Development（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（EGT）是一种珍贵的天然抗氧化剂，兼具生理功能与商业价值。但其微生物合成长期受制于前体供给不足、甲基供体循环效率低和胞内产物积累三大瓶颈。本研究在酿酒酵母中系统整合了关键酶工程、异源甲基供给途径、膜通透性调控与适应性发酵工艺，使工程菌株ST.1216在5 L生物反应器中EGT产量达到2.96 g/L，为目前酿酒酵母报道的最高水平。代谢组学分析进一步揭示了高产菌株中前体氨基酸与中心碳代谢物池的系统性提升。
研究背景
L-麦角硫因（EGT）是一种罕见的天然含硫氨基酸衍生物，其独特的硫酮-硫醇互变异构结构赋予其优异的抗氧化稳定性与生物活性。作为通过OCTN1转运蛋白被细胞摄取的必需膳食细胞保护剂，EGT能够清除自由基、螯合重金属、保护线粒体并缓解炎症，在食品、化妆品和医药领域应用广泛，被誉为"长寿维生素"。目前EGT可通过天然提取、化学合成、酶催化/生物转化和微生物发酵等方式获得，各方法在原料来源、反应条件、工艺复杂度和规模化潜力方面各有特点。其中，微生物发酵因环境友好、安全高效而成为主流生产策略。自然界中EGT的生物合成主要发生在真菌和某些细菌中，以L-组氨酸（L-His）为核心前体，需要含硫底物和甲基供体的协同参与。以真菌合成途径为代表，EGT生物合成通常由Egt1和Egt2两个关键酶催化。尽管前期研究已通过多拷贝过表达PoEgt1/PoEgt2结合系统代谢工程构建了高产菌株ST.12（EGT产量108.33 ± 0.96 mg/L），但代谢组学分析显示L-His和L-Cys在发酵早期仍被快速消耗，表明前体供给不足以支撑高效EGT合成。本研究旨在通过多层级代谢工程策略系统解决前体供给、甲基供体循环和产物外排等瓶颈问题。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表S2。质粒构建使用大肠杆菌Trans1-T1和Trans110，在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37 °C、200 rpm条件下培养，必要时添加氨苄青霉素（100 μg/mL）。出发菌株ST.12是本课题组前期研究构建的酿酒酵母BY4741（MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0）多层级工程衍生菌株。常规培养和产物生物合成在YPD培养基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）中于30 °C、220 rpm条件下进行。转化子在SD/-URA平板上筛选，在添加5-氟乳清酸（1 g/L）的YPD培养基上进行反向筛选。固体培养基通过添加2%（w/v）琼脂制备。摇瓶发酵时，将单菌落接种至5 mL YPD培养基中，于30 °C、220 rpm预培养至指数期。随后，将5%（v/v）种子培养液转接至含50 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，在相同条件下培养108 h用于EGT生产。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL；大肠杆菌培养温度：37°C；转速：200 rpm；酵母培养基：YPD（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）；酵母培养温度：30°C；转速：220 rpm；反向筛选剂：5-氟乳清酸1 g/L；琼脂浓度：2%（w/v）；种子接种量：5%（v/v）；摇瓶装液量：50 mL/500 mL；发酵时间：108 h
2.2 质粒构建与基因组编辑
本研究采用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组策略进行基因组编辑。特异性sgRNA序列使用在线平台CRISPR direct Tools（https://crispr.dbcls.jp/）设计。所有表达质粒和修复模板均在大肠杆菌中构建、扩增和验证，随后通过LiAc转化法导入酿酒酵母BY4741。阳性转化子采用基于URA3标记的两步筛选策略获得。针对不同的编辑靶点，在设计特异性修复模板的同时遵循统一的编辑工作流程。对于定点突变（如HIS1 T48S/N231I），合成含有目标核苷酸替换的单链寡核苷酸修复模板（表S3）。对于过表达菌株的构建，采用启动子替换策略。首先从NCBI数据库中筛选目标基因的启动子区域，以确定待替换的基因组序列。在此基础上，设计含有pTEF1启动子同源臂的双链DNA修复模板用于启动子替换。基因敲除通过完全删除目标开放阅读框实现。本研究构建的所有质粒列于表S4。用于修复模板合成的所有引物和寡核苷酸均由擎科生物（中国青岛）合成，其序列汇总于表S5。
【数据】编辑系统：CRISPR/Cas9介导同源重组；sgRNA设计平台：CRISPR direct Tools；转化方法：LiAc转化法；筛选标记：URA3；筛选策略：两步筛选；突变方式：单链寡核苷酸修复模板定点突变；过表达方式：pTEF1启动子替换；敲除方式：完全删除目标开放阅读框；引物合成公司：擎科生物（中国青岛）；原文未详述sgRNA具体序列及修复模板具体序列
2.3 5 L生物反应器补料分批发酵
种子培养通过将单菌落接种至含20 mL YPD培养基的试管中，于30 °C、220 rpm过夜培养启动。随后，以5%（v/v）的接种比例将种子培养液转接至两个含100 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中进行扩大培养，直至OD600达到3.0-4.0。补料分批发酵在5 L生物反应器中进行，初始工作体积为2 L。发酵使用YPD培养基，补料培养基组成为：400 g/L葡萄糖、12.5 g/L MgSO4·7H2O、80 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、20 mL/L微量元素溶液（3 g/L FeSO4·7H2O、4.5 g/L ZnSO4·7H2O、4.5 g/L CaCl2·2H2O、1 g/L MnCl2·4H2O、0.3 g/L CoCl2·6H2O、0.3 g/L CuSO4·5H2O、0.4 g/L NaMoO4·2H2O、1 g/L H3BO3、0.1 g/L KI、19 g/L Na2EDTA·2H2O）和10 mL/L维生素溶液（0.05 g/L d-生物素、1 g/L D-泛酸半钙盐、1 g/L 硫胺素-HCl、1 g/L 吡哆醇-HCl、1 g/L 烟酸、0.2 g/L 4-氨基苯甲酸、25 g/L 肌醇）。整个发酵过程中，关键参数自动控制以维持稳定条件：温度保持在28 ± 0.5 °C，pH通过自动添加2 M KOH或H2SO4维持在5.0 ± 0.2，溶解氧（DO）水平通过级联控制策略维持在20%-30%之间，即调节搅拌转速（500-1200 rpm）并以2 L/min的流速供应无菌空气。120 h的发酵过程使用BioStar过程控制软件实时监测和记录。
【数据】种子培养体积：20 mL YPD；种子培养温度：30°C；转速：220 rpm；扩大培养接种量：5%（v/v）；扩大培养体积：100 mL/500 mL摇瓶；扩大培养终点OD600：3.0-4.0；生物反应器体积：5 L；初始工作体积：2 L；补料培养基葡萄糖浓度：400 g/L；补料培养基MgSO4·7H2O：12.5 g/L；补料培养基(NH4)2SO4：80 g/L；补料培养基KH2PO4：14.4 g/L；微量元素溶液：20 mL/L；维生素溶液：10 mL/L；发酵温度：28 ± 0.5°C；pH：5.0 ± 0.2（2 M KOH或H2SO4调节）；溶解氧：20%-30%；搅拌转速：500-1200 rpm；空气流速：2 L/min；发酵时间：120 h
2.4 EGT提取与分析
发酵液经离心分离上清液和细胞沉淀。胞内EGT使用50%（v/v）乙醇在50 °C水浴中提取30 min。样品分析前通过0.22 μm膜过滤。EGT定量使用配备电喷雾电离（ESI）源的SCIEX QTRAP™ 4500 LC-MS/MS系统和Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱进行。色谱分离采用甲醇-水梯度洗脱，流速为0.7 mL/min。质谱检测以多反应监测（MRM）模式进行。EGT的前体离子为m/z 230，相应的产物离子为m/z 127和m/z 186.1。使用EGT标准品（J&K Scientific）建立0.2至50 mg/L的标准曲线（图S2），数据使用MultiQuant™ 3.0.2软件处理。
【数据】提取溶剂：50%（v/v）乙醇；提取温度：50°C；提取时间：30 min；过滤膜孔径：0.22 μm；检测系统：SCIEX QTRAP™ 4500 LC-MS/MS；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18；流速：0.7 mL/min；前体离子：m/z 230；产物离子：m/z 127和m/z 186.1；标准曲线范围：0.2-50 mg/L；数据处理软件：MultiQuant™ 3.0.2
2.5 qPCR基因表达水平分析
目标基因的转录水平通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析（图S3）。酵母细胞培养至中指数期，使用M5 EASYspin酵母RNA提取试剂盒（MF158-01, Mei5bio, 中国）提取总RNA。随后，使用PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser，RR047A, Takara, 日本）将500 ng总RNA逆转录为cDNA。所得cDNA作为模板，使用基因特异性引物（表S5）和qPCR Master Mix（A6001, Promega, 中国）在Applied Biosystems QuantStudio 5系统上进行qPCR扩增。每个样品进行三个技术重复。基因表达水平以参照基因ACT1归一化，目标基因的相对表达量使用2ˆ-ΔΔCt方法计算。
【数据】RNA提取试剂盒：M5 EASYspin Yeast RNA Extraction Kit（MF158-01, Mei5bio）；总RNA用量：500 ng；逆转录试剂盒：PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser（RR047A, Takara）；qPCR仪器：Applied Biosystems QuantStudio 5；qPCR预混液：qPCR Master Mix（A6001, Promega）；技术重复：3个；参照基因：ACT1；计算方法：2ˆ-ΔΔCt
2.6 代谢组学样品收集与制备
为监测发酵过程中代谢物的动态变化，在36 h、72 h和108 h收集样品。在每个时间点，快速取出1 mL培养液并立即用预冷的甲醇淬灭以终止细胞代谢。随后在4 °C、8000 × g条件下离心5 min收获细胞，所得沉淀储存于-80 °C直至进一步分析。代谢物提取使用75%沸腾乙醇，提取过程中加入13C标记的内标。沸腾5 min后，提取物通过旋转蒸发浓缩。取一份浓缩提取物进行化学衍生化。衍生化样品随后冷冻干燥，通过GC-MS进行分析，对关键代谢物（包括氨基酸和有机酸）进行定性鉴定和相对定量。
【数据】取样时间点：36 h、72 h、108 h；取样体积：1 mL；淬灭剂：预冷甲醇；离心条件：8000 × g、4°C、5 min；存储温度：-80°C；提取溶剂：75%沸腾乙醇；内标：13C标记内标；沸腾时间：5 min；浓缩方式：旋转蒸发；检测方法：GC-MS
2.7 代谢组学数据分析
为研究不同甜菜碱浓度对胞内代谢谱的剂量依赖效应，对代谢组学数据系统进行多变量统计分析。首先，使用Origin 2024进行无监督主成分分析（PCA），初步揭示不同处理组样品间的聚类模式和分布趋势。随后，将数据导入MetaboAnalyst平台进行归一化，再进行有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）以构建分类模型，从而增强组间代谢表型的区分度并促进关键差异代谢物的鉴定。PLS-DA模型以自动缩放作为数据预处理方法建立。
【数据】PCA软件：Origin 2024；归一化平台：MetaboAnalyst；分析方法：PLS-DA；数据预处理：自动缩放；原文未详述PLS-DA模型的具体性能参数
研究结果
3.1 基于增强前体供给的关键酶工程与组合优化
在前期工作中，通过多拷贝过表达PoEgt1/PoEgt2结合系统代谢工程构建了高产酿酒酵母菌株ST.12，EGT产量达到108.33 ± 0.96 mg/L。然而，尽管在菌株构建过程中对L-His和L-Cys生物合成途径进行了工程改造，代谢组学分析显示这两种氨基酸在发酵早期仍被快速消耗，表明其供给不足以支撑高效EGT生物合成。这一现象可能归因于以下因素：（i）内源生物合成途径的通量可能仍不足以满足EGT生产对前体的高需求；（ii）这些途径中的关键酶可能受到反馈抑制或催化效率有限；（iii）竞争性代谢途径可能消耗这些前体。为进一步提高EGT产量，对L-His和L-Cys的生物合成途径进行了进一步工程改造（图1A）。
对于L-His生物合成，HIS1编码ATP磷酸核糖基转移酶，是组氨酸生物合成途径中的关键限速酶，其活性受到L-His的反馈抑制。T48S和N231I残基位于该酶的调控结构域内，其中N231位于推定的变构L-His结合位点内，T48位于ATP/AMP结合环附近，暗示这些突变可能影响变构调控从而增强L-His通量。基于这些结构信息，对HIS1进行了定点突变。结果显示，单点突变T48S和N231I以及双突变T48S/N231I均增强了EGT产量，分别提高了26.16%、16.84%和22.92%（图1B）。这些突变可能通过改变酶的构象结构最终提高EGT产量。值得注意的是，双突变体的改善效果低于T48S单突变体。这可能反映了HIS1复杂的变构调控——不同调控区域的同时改变不一定产生加性效应，反而可能导致次优的酶调控或对组氨酸生物合成途径施加过度的代谢负担。然而，需要直接的生化验证才能确定这些突变对HIS1活性和反馈调控的影响。
对于L-Cys生物合成，过表达编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的SER3和SER33基因，无论单独还是组合过表达均促进了EGT积累，分别提高了22.57%、17.39%和10.35%（图1C）。SER3和SER33均催化3-磷酸-D-甘油酸转化为3-磷酸羟基丙酮酸，代表将L-丝氨酸（L-Ser）通量导向L-Cys生物合成的关键代谢节点。值得注意的是，单独过表达SER3基因的改善效果大于SER33基因，而它们的共表达未表现出协同效应。这表明该途径的代谢通量可能已接近其上限，或者同时过表达同工酶施加了额外的代谢负担，从而抵消了潜在收益。除了在L-Cys合成中的作用外，SER3基因过表达还有望增强L-Ser和L-甘氨酸（L-Gly）的供给，从而支持一碳池和SAM循环以维持EGT生物合成的甲基供体可用性。类似现象在高产菌株代谢工程中已有报道，例如Kobayashi等人在工程化谷胱甘肽过量生产菌株时观察到，适度增强关键节点比广泛过表达更有效。
基于这些发现，进一步整合了有效的突变和过表达策略。HIS1-T48S突变与SER3过表达的组合使EGT产量提高了39.87%，达到151.53 ± 0.40 mg/L（图1D）。总之，在前期构建的高产菌株ST.12基础上，本研究通过靶向代谢工程策略解决了发酵早期L-His和L-Cys供给不足的问题。结果表明，HIS1点突变（T48S和N231I）和SER3/SER33过表达可在不同程度上提高EGT产量。值得注意的是，HIS1-T48S突变与SER3过表达的组合使EGT产量提高了39.87%。这些发现验证了我们从代谢组学分析中得出的假设——内源前体供给不足是高效EGT生物合成的关键限制因素。同时也表明，在增强下游产物合成能力的同时，精确调控上游前体供给途径是克服代谢瓶颈的有效策略。
【数据】出发菌株ST.12 EGT产量：108.33 ± 0.96 mg/L；HIS1 T48S突变EGT提升：26.16%；HIS1 N231I突变EGT提升：16.84%；HIS1 T48S/N231I双突变EGT提升：22.92%；SER3过表达EGT提升：22.57%；SER33过表达EGT提升：17.39%；SER3+SER33共过表达EGT提升：10.35%；HIS1-T48S + SER3过表达组合EGT提升：39.87%；组合菌株EGT产量：151.53 ± 0.40 mg/L
3.2 重建甲基供体循环以增强SAM供给
除了前体L-Cys和L-His外，SAM作为EGT生物合成的必需甲基供体。随着前体供给增强和EGT产量增加，SAM可用性可能成为限制因素。为解决这一问题，采用组合策略通过减少SAM消耗和构建外源甲基补充途径来系统增强SAM供给。内源SAM容易被多胺生物合成等竞争途径消耗（图1E）。因此，首先敲除编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的SPE2基因以阻断SAM向多胺合成的通量，使EGT产量提高了8.66%（图1F）。
为进一步增强SAM供给，探索了更高效的生物合成策略。在酿酒酵母中，EGT生物合成所需的甲基供体主要来源于CH3-THF，而利用甜菜碱的天然途径缺失。因此，引入异源甜菜碱分解代谢途径，使工程菌株能够利用甜菜碱作为甲基供体进行L-Met生物合成，从而提高SAM产量和整体甲基供体可用性（图1E）。实验结果显示，将甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）引入酵母，结合补充0.5 g/L甜菜碱，使EGT产量提高了6.49%。此外，BHMT表达与SPE2敲除的组合使EGT产量提高了16.28%，达到173.03 ± 0.16 mg/L（图1F）。虽然本研究未直接定量胞内SAM和SAH水平以及SAM/SAH比值，但这些表型改善表明，减少竞争性SAM消耗同时引入替代甲基循环途径可能共同支持EGT生物合成的甲基供体可用性。类似策略在大肠杆菌中也有报道，增强SAM供给显著改善了产物形成。因此，靶向工程化甲基供体代谢是提高EGT产量的有前景的策略，尽管其对胞内SAM可用性的直接影响需要进一步的生化验证。
【数据】SPE2敲除EGT提升：8.66%；BHMT引入+0.5 g/L甜菜碱EGT提升：6.49%；BHMT表达+SPE2敲除组合EGT提升：16.28%；组合菌株EGT产量：173.03 ± 0.16 mg/L；甜菜碱补充浓度：0.5 g/L
3.3 调控膜通透性缓解产物的胞内积累
前期研究已通过代谢工程解决了前体供给限制以增强EGT生物合成。大部分EGT积累在胞内，导致反馈抑制和下游纯化成本增加。此外，过度的胞内积累可能通过改变资源分配、增加前体和辅因子需求或干扰转运过程对宿主细胞施加代谢负担。这一担忧得到了van der Hoek等人的支持，他们观察到外源添加EGT时酿酒酵母出现浓度依赖性的生长抑制。
讨论与解读
本研究在酿酒酵母中系统实施了多层级工程策略，以解决EGT生物合成的关键瓶颈，包括前体供给不足、甲基供体循环效率低和胞内产物积累。首先，通过HIS1点突变和SER3过表达增强了前体供给。其次，通过引入异源BHMT途径和敲除SPE2基因重建了甲基供体循环。最后，添加0.5% Tween 80促进产物外排，并结合发酵工艺优化，开发了高产菌株ST.1216及其适应性工艺。生物反应器验证证实，表达来自平菇的PoEgt1和PoEgt2的ST.1216在优化条件下EGT产量达到2955.25 ± 30.21 mg/L，为目前酿酒酵母报道的最高水平。基于代谢组学的机理分析揭示，高产菌株中前体氨基酸供给和中心碳代谢物池均得到系统性增强。本研究为EGT的工业生产提供了高效的微生物细胞工厂，并为复杂天然产物的生物合成建立了可推广的多层级工程框架。
编译者解读
该研究的方法论价值在于"分而治之"的工程逻辑——将EGT合成拆解为前体、甲基供体和产物外排三个可独立优化的模块，逐一突破后再整合。HIS1变构位点突变与SER3过表达的协同、BHMT异源途径的引入，均体现了精准调控优于粗暴过表达的策略取向。2.96 g/L的产量在酿酒酵母中确属领先，但需注意：胞内SAM/SAH水平未经直接定量，甲基供体增强的分子机制尚缺直接证据；Tween 80促进外排的普适性也有待在其他产物中验证。从产业化角度看，补料培养基中甜菜碱的添加成本与产物外排后的分离纯化工艺，将是决定该平台经济可行性的关键变量。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110083
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.110083