来源：Engineering Pseudomonas putida KT2440 for open-loop upcycling of mixed plastics（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全球塑料废物回收率不足10%，酶解-微生物转化联用为混合塑料增值提供了新路径。本研究在恶臭假单胞菌KT2440中整合四条代谢通路，构建出可同时利用乙二醇、对苯二甲酸、己二酸、1,4-丁二醇和L-乳酸的单一菌株ETAB。21天连续发酵实现稳态生长与底物完全耗尽，并筛得适应性突变。进一步改造后，该菌可从PET、PBAT与热塑性聚氨酯混合水解液中直接产出0.70 g/L的(R)-3-羟基丁酸。
研究背景
塑料年产量到2024年已达约430 Mt，回收比例却不足10%，大部分被填埋、焚烧或泄漏到环境中。向循环塑料经济转型，需要闭环与开环回收技术同步推进，生物技术正成为可行选项。酶解塑料为单体或小分子是最有前景的可持续回收策略之一，对含酯键的PET、PBAT、PLA，含氨酯键的PU以及含酰胺键的PA尤为有效。相反，C–C主链的非水解塑料（如聚烯烃、聚苯乙烯）的酶降解仍存争议，通常需要化学氧化与多酶催化组合。本研究以可水解塑料为目标，用单一工程菌共代谢五种单体，并通过连续发酵与反向工程迭代提升菌株性能，最终实现从真实混合塑料水解液到(R)-3HB的生物合成。
研究方法
本研究中构建的所有质粒均基于用于基因组修饰的自杀载体pEMG-RIS，质粒构建及遗传修饰流程参照Meng等人所述方法。所有寡核苷酸（见在线补充信息表S3）均外购合成，测序工作由Eurofins Genomics（德国埃伯斯贝格）完成。构建基因缺失质粒时，首先用引物HM0001和HM0002通过PCR将pEMG-RIS线性化，得到V_pEMG-RIS骨架。从基因组DNA扩增目标基因两侧各约500 bp的同源片段，通过Gibson Assembly与V_pEMG-RIS骨架组装，随后转化进大肠杆菌PIR2感受态细胞。引入点突变时，从相应突变株基因组扩增含目标突变的约1,000 bp片段，与V_pEMG-RIS骨架组装。正确的质粒构建体通过菌落PCR和Sanger测序验证。基因组修饰时，将携带编辑质粒的大肠杆菌PIR2、辅助菌株大肠杆菌HB101和靶标恶臭假单胞菌过夜培养。随后各取200 μL培养物混合并离心（3,400× g，1分钟）。去除上清后，细胞重悬于200 μL LB培养基，点样于预干燥的LB琼脂平板。液滴完全干燥后，平板于30 °C培养6~8小时。从接合斑点收集细胞，涡旋重悬于200 μL LB培养基，取约100 μL涂布于Cetrimide琼脂平板，30 °C过夜培养。单菌落转接至4 mL含20 mM鼠李糖的LB培养基，30 °C培养10~16小时。随后取少量培养物划线于含100 g/L蔗糖的LB琼脂，30 °C过夜培养。候选菌落经菌落PCR筛选，并在LB琼脂上重新分离以确保菌株纯度。最后，扩增编辑后的基因组区域并通过Sanger测序确认。
【数据】载体：pEMG-RIS；同源臂长度：约500 bp；点突变片段长度：约1,000 bp；离心条件：3,400× g、1分钟；接合培养温度：30°C；接合培养时间：6~8 h；鼠李糖浓度：20 mM；蔗糖浓度：100 g/L；LB培养体积：4 mL；培养时间：10~16 h
气体传递速率的在线测量：为在线监测500 mL Erlenmeyer摇瓶中的氧传递速率（OTR）、二氧化碳传递速率（CTR）和呼吸商（RQ），培养在Kuhner TOM摇床（Adolf Kühner AG，瑞士Birsfelden）中进行，装液量25 mL。96深孔板（2.5 mL）中的OTR测量在Kuhner microTOM摇床（Adolf Kühner AG）中进行，装液量0.4或1 mL。所有培养均在30 °C、300 rpm、50 mm轨道振幅条件下进行。
【数据】摇瓶体积：500 mL；装液量：25 mL；深孔板体积：2.5 mL；装液量：0.4或1 mL；温度：30°C；转速：300 rpm；振幅：50 mm
Growth Profiler培养：为评估恶臭假单胞菌ETAB菌株的遗传稳定性，培养在Growth Profiler（Enzyscreen B.V.，荷兰Heemstede）中进行。菌株在24半深孔微孔板（CR1424e；Enzyscreen）中培养，工作体积2 mL，30 °C、225 rpm、25 mm轨道振幅。生物量以仪器导出的green value进行监测。
【数据】微孔板：24半深孔板（CR1424e）；工作体积：2 mL；温度：30°C；转速：225 rpm；振幅：25 mm
连续发酵设置：连续发酵在1.3 L BioFlo 120搅拌罐生物反应器（Eppendorf AG，德国汉堡）中进行，工作体积0.5 L，使用DASware control软件6.6版操作。生物反应器配备在线监测传感器，包括InPro 6800系列O2传感器12 mm（Mettler-Toledo AG，瑞士）和pH探头（EasyFerm Plus PHI K8 160）（Hamilton，瑞士Bonaduz），以及Pt100温度传感器。pH通过自动添加1 M KOH维持在7.0 ± 0.05。尾气经冷凝器后，用BlueVary气体传感器在BlueVis软件（v4.65；BlueSens Gas Sensor GmbH，德国Herten）控制下连续分析O2和CO2浓度。搅拌由单个六叶Rushton涡轮（直径53 mm）提供。分批阶段，DO通过将搅拌转速在200至1,200 rpm之间变化控制在30%，通气速率恒定为0.5 vvm；连续阶段最大搅拌转速随后固定为600 rpm。连续阶段新鲜培养基通过外部Watson-Marlow 120U/DV蠕动泵（Watson-Marlow，Spirax Group plc，英国）以50 mL/h供给，使用PharMed BPT生物相容性蠕动泵管（内径0.8 mm，外径4.0 mm，壁厚1.6 mm；Saint-Gobain Life Sciences – Bioprocess Solutions，美国俄亥俄州Akron），对应稀释率0.1 h⁻¹，培养液体积通过位于液面的溢流出口维持。补料培养基中添加0.02%（v/v）Antifoam 204以抑制泡沫。当CDW在五个停留时间（相当于交换五个工作体积）内变化小于5%时，认为达到稳态。
【数据】反应器体积：1.3 L；工作体积：0.5 L；pH：7.0 ± 0.05；KOH浓度：1 M；DO：30%；搅拌转速：分批200–1,200 rpm、连续最大600 rpm；通气速率：0.5 vvm；补料速率：50 mL/h；稀释率：0.1 h⁻¹；泵管内径：0.8 mm；外径：4.0 mm；壁厚：1.6 mm；消泡剂：0.02%（v/v）Antifoam 204；稳态判定：五个停留时间、CDW变化<5%
转录组分析与基因组重测序：为分析连续发酵中ETAB菌株在medium 3和medium 1阶段稳态细胞间的转录组差异，取0.2 mL培养物快速离心（3,400× g，1分钟，4 °C），弃上清，沉淀立即重悬于0.5 mL RNAlater中稳定RNA，4 °C过夜保存。基因组重测序时，选取的分离株在LB培养基中过夜培养，取0.8 mL培养物用Monarch Spin gDNA Extraction Kit（New England BioLabs）提取基因组DNA。基于NanoDrop测量（Thermo Scientific）将DNA浓度归一化至50 ng/μL。所有转录组分析和基因组重测序样品由GENEWIZ（Azenta Life Sciences，德国莱比锡）进行下一代测序和生物信息学分析。上调和下调基因的详细信息见在线补充信息表S4和S5。
【数据】培养物取样量：0.2 mL；离心条件：3,400× g、1分钟、4 °C；RNAlater体积：0.5 mL；保存温度：4 °C；基因组DNA取样量：0.8 mL；DNA浓度：50 ng/μL
塑料的酶解及培养液制备：混合聚合物（PET、PBAT和TPU等质量）的酶解在50 mL反应器中进行并控制pH，方法参照Branson等人（2025）。PET薄膜购自Goodfellow GmbH。PBAT（BASF）单体摩尔比为TA:AA:BDO = 0.222:0.278:0.500，TPU（Soprema）摩尔比为脂肪酸多元醇:BDO:MDI = 1.4:1.0:2.1。简言之，1 g聚合物共混物悬浮于20 mL反应体积中（5% w/v底物载量），在60 °C下与PES-H1 FY（10 U/g）孵育72小时以断裂PET、PBAT和TPU中的酯键。随后温度降至30 °C，加入UMG-SP-2（10 U/g）后继续反应24小时以水解TPU中的氨酯键。反应通过乙腈沉淀酶终止。制备R-3HB生产培养基时，通过过夜吹气去除乙腈，所得水解液稀释三倍后作为碳源制备生产培养基，随后经0.22 μm滤膜过滤。
【数据】反应器体积：50 mL；聚合物共混物：1 g；反应体积：20 mL；底物载量：5%（w/v）；PES-H1 FY用量：10 U/g；酯键水解温度：60°C；时间：72 h；UMG-SP-2用量：10 U/g；氨酯键水解温度：30°C；时间：24 h；终止试剂：乙腈；水解液稀释倍数：3倍；过滤孔径：0.22 μm；PBAT摩尔比：TA:AA:BDO = 0.222:0.278:0.500；TPU摩尔比：脂肪酸多元醇:BDO:MDI = 1.4:1.0:2.1
研究结果
设计单一恶臭假单胞菌菌株共代谢EG、TA、AA和BDO：针对四种最常见可水解塑料来源单体——乙二醇（EG）、对苯二甲酸（TA）、己二酸（AA）和1,4-丁二醇（BDO）的微生物单独利用已有广泛研究（图1A）。恶臭假单胞菌天然携带EG和BDO分解代谢通路的基因。但EG同化需要通过对gclR阻遏物的删除来激活gcl操纵子（gcl:hyi:glxR:ttuD:pykF），且过表达glc操纵子（glcDEFG）已被证明可进一步促进生长。BDO可被野生型恶臭假单胞菌缓慢同化，但当PP_2046被组成型P 14g启动子替换后其利用得到改善。相比之下，恶臭假单胞菌缺乏TA和AA的转运系统，也缺乏将TA转化为原儿茶酸（PCA）和将AA转化为2,3-二脱氢己二酰-CoA所需的酶通路，因此必须引入异源通路。此前Ackermann等人将来自A. baylyi的dca操纵子（dcaAKIJP）连同额外基因组修饰引入恶臭假单胞菌，实现了高效的AA利用。包括Comamonas sp.、R. jostii、P. umsongensis和I. sakaiensis在内的多种细菌携带TA代谢所缺失的酶步骤。早期工程努力证实，来自R. jostii的tphK与来自Comamonas sp.的一个tph操纵子组合表现出优越性能。最近，在P. umsongensis中鉴定出一个紧凑的tph操纵子（iclR-tphA2A3BA1K），其中主要促进因子超家族（MFS）转运蛋白tphK与tphA2A3BA1基因共定位于单一转录单元，代表了TA代谢的高效配置。为开发能利用全部四种单体的单一恶臭假单胞菌菌株，我们假设可通过选择性组合上述修饰来实现。我们从Wierckx组获得的菌株KT2440ge ΔP paaF -paaYX::P 14g ΔpsrA（本研究中称为AB）出发，该菌株已携带来自A. baylyi的dca操纵子（图1B）及额外修饰，可实现AA利用。随后引入另外两个修饰。第一，为实现TA代谢，将来自P. umsongensis GO16的tph操纵子整合到PP_0340位点（图1B）。第二，删除gclR以激活EG同化（图1A）。通过整合这些修饰，构建了三个工程菌株EAB、TAB和ETAB（图1D）。随后评估这四个菌株在混合单体上的生长（图1C、D及在线补充信息图S1）。如预期，亲本AB菌株和EAB菌株因缺少tph操纵子而不消耗TA。删除gclR后，EAB消耗AA和BDO更快，这可能是因为EG同化的激活增加了生物量形成和整体细胞摄取能力。此外，EG分解代谢可能增加乙酰-CoA供应，从而支持三羧酸循环（TCA）活性并间接促进AA利用。因此，EAB中AA摄取的改善可能反映了间接生理效应。然而，24小时后EAB培养物出现显著细胞聚集，原因尚不清楚。此外，AB和EAB培养物的最终pH相对初始值下降，表明积累了未鉴定的酸性副产物。相比之下，TAB和ETAB均能高效共消耗全部四种单体，在17小时内实现完全耗尽，并达到相似的最终pH值（约7.8）。值得注意的是，ETAB相比TAB表现出更好的生长性能，最大OD600约高8%。这一改善可能归因于EG同化的激活。24小时残留单体浓度和最大OD600值汇总于图1D以便直接比较。总之，获得了一株命名为ETAB的工程恶臭假单胞菌菌株，在混合单体上表现出强劲生长。
【数据】菌株：KT2440ge ΔP paaF -paaYX::P 14g ΔpsrA（AB）、EAB、TAB、ETAB；tph操纵子整合位点：PP_0340；完全耗尽时间：17 h；最终pH：约7.8；ETAB最大OD600较TAB提高：约8%；24 h残留单体浓度：见原文图1D
ETAB菌株的生理表征：为进一步评估ETAB菌株在混合单体上的性能，我们首先评估了其单体偏好。ETAB菌株在五种单独单体EG、TA、AA、BDO和L-乳酸（LA）作为唯一碳源上培养（图2A）。通过在线监测氧传递速率（OTR）比较底物利用。OTR作为需氧代谢活动的实时替代指标，通过揭示底物氧化速率的差异来补充代谢物测量。结果表明存在明显的偏好顺序：LA利用最快，其次是TA、AA、BDO和EG。由于PET和PU是最广泛使用的可水解塑料之一，其对应单体被选用于后续实验。PET由TA和EG以50:50摩尔比组成，而PU的软段可含EG、AA和BDO，摩尔比为25:50:25（图2B）。随后在来自塑料（PET或PU软段）的单一单体上评估ETAB菌株，通过OTR和呼吸商（RQ）监测底物利用。OTR报告需氧代谢的整体强度，而RQ反映CO2与O2之比，因此有助于区分主导分解代谢底物的变化（图2D）。在PET单体上培养时，OTR曲线呈现单一峰，RQ模式与TA和EG代谢重叠一致，表明TA和EG同时共消耗。相比之下，在PU软段单体上培养导致三个紧密相邻的OTR峰。基于各单体的理论RQ值（图2C），实测RQ曲线提示顺序底物利用，AA利用延迟且不在初始阶段发生。这一模式不同于在单独单体上生长时观察到的偏好。这些结果表明，单体利用的层级在混合底物条件下可能发生改变。在线OTR和RQ测量用于比较ETAB在三种不同单体组成（基于PET和PU软段的不同比例，总单体浓度恒定为60 mM）上的性能，反映塑料废物的差异：medium 1：22.5 mM EG、15 mM TA、15 mM AA和7.5 mM BDO；medium 2：27 mM EG、24 mM TA、6 mM AA和3 mM BDO；medium 3：18 mM EG、6 mM TA、24 mM AA和12 mM BDO（图2B、E）。离线测量OD600和残留单体浓度作为参考（在线补充信息图S2）。随着PET单体比例降低，整体生长性能下降。值得注意的是，使用medium 3时，EG、TA和BDO在10小时内耗尽，而AA完全消耗需24小时，表明AA代谢受混合底物条件强烈影响。最大比生长速率（μmax）在medium 1、2和3中分别为0.51、0.50和0.41 h⁻¹，随PET单体含量降低而下降。所用单体组成产生的不同效应塑造了后续连续发酵实验的设计。为评估ETAB的遗传稳定性，该菌株在溶菌肉汤（LB）培养基中连续培养约300代，每100代取样。在LB琼脂平板上获得分离株，每个时间点随机选取六个菌落用混合单体评估。如图2F所示，所有代次的菌株表现出可比性能，表明在LB培养基中长期培养期间表型稳定。
【数据】单体：EG、TA、AA、BDO、LA；偏好顺序：LA > TA > AA > BDO > EG；PET摩尔比：TA:EG = 50:50；PU软段摩尔比：EG:AA:BDO = 25:50:25；总单体浓度：60 mM；medium 1：22.5 mM EG、15 mM TA、15 mM AA、7.5 mM BDO；medium 2：27 mM EG、24 mM TA、6 mM AA、3 mM BDO；medium 3：18 mM EG、6 mM TA、24 mM AA、12 mM BDO；medium 3中EG/TA/BDO耗尽时间：10 h；AA完全消耗时间：24 h；μmax：medium 1为0.51 h⁻¹、medium 2为0.50 h⁻¹、medium 3为0.41 h⁻¹；遗传稳定性：约300代、每100代取样、每时间点6个菌落
使用交替混合单体补料的连续发酵：为评估其……（原文此处中断）
【数据】原文未详述
使用交替混合单体补料的连续发酵：为评估其在真实补料条件下的性能，进行了21天连续发酵，采用交替混合单体补料（图3A）。在21天连续发酵过程中监测生物量形成及四种单体EG、AA、TA和BDO的消耗（图3B）。彩色三角形表示……（原文此处中断）
【数据】发酵时长：21天；单体：EG、AA、TA、BDO
从连续发酵中鉴定突变的逆向工程：基因组重测序揭示两个点突变（图4A）。基于底物利用比较逆向工程菌株与进化菌株、亲本菌株及相应缺失菌株。菌株在medium 1上培养……（原文此处中断）
【数据】突变数量：2个点突变；培养基：medium 1
从混合塑料单体生产R-3HB：图5A概述了五种塑料单体（EG、TA、AA、BDO和LA）的同化通路及为R-3HB生产模块引入的相应遗传修饰。用于R-3HB生产的操纵子（P 14ffg -BCD2-phaBA3-tesB）的基因组整合（图5B）……（原文此处中断）
【数据】单体：EG、TA、AA、BDO、LA；操纵子：P 14ffg -BCD2-phaBA3-tesB
使用酶解混合聚合物衍生单体的R-3HB生产：图6A展示了从混合塑料生产R-3HB的工作流程。菌株ETAB-HB V4在摇瓶培养中使用混合塑料水解液制备的培养基生产R-3HB（图6B）。在线监测OTR……（原文此处中断）
【数据】菌株：ETAB-HB V4；R-3HB产量：0.70 g/L；底物：PET、PBAT、热塑性PU混合水解液
讨论与解读
本研究构建了稳健的恶臭假单胞菌ETAB，可同时利用EG、TA、AA、BDO和LA五种塑料单体。通过交替混合单体补料的连续发酵验证了其在混合底物上的稳定高效利用，过程中鉴定出有益点突变，并通过逆向工程进一步改良菌株。该菌株还被基因组工程改造，从混合塑料水解液生产多功能平台化学品R-3HB。这些结果凸显了假单胞菌代谢灵活性在增值复杂塑料来源原料方面的效用，同时强调了需要更好地将碳通量导向目标产物。此前的串联化学-生物漏斗策略，包括通过金属基或无金属催化剂解聚塑料，再用单一菌株或微生物联合体进行生物转化，已大幅推进混合塑料升级回收，包括PE、PP和PS等非水解聚合物。本工作未采用化学解构，而是酶解可水解塑料，条件温和且生物相容性更好；但仍存在显著……（原文此处中断）
编译者解读：该研究用一株菌打通五单体共代谢，思路务实——先解决"吃不吃得完"，再谈"产什么"。连续发酵21天加逆向工程，把适应性进化当作菌株开发工具，比纯理性设计更贴近真实废物流。局限也明显：R-3HB仅0.70 g/L，碳通量仍偏向生物量而非产物；酶解液预处理与灭菌成本未计入。若能把产物得率提一个数量级，这条路线才有工业谈判的资格。
参考来源
期刊：Trends in Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.08.017
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.08.017