无细胞系统多维优化实现(2S)-柚皮素高效合成

📅 2026-09-24 📰 BioDesign Research 2026-09-23 📂 研究进展 👁 36

来源：Design and Multidimensional Optimization of Cell-Free System for Efficient (2S)-Naringenin Production（BioDesign Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

柚皮素是一种具有多种药理活性的珍贵黄酮类化合物，但微生物细胞工厂产量偏低限制了其工业化生产。本研究构建并系统优化了基于大肠杆菌的无细胞合成系统，通过比较三种系统架构、筛选四种通路酶的最优同源物、优化酶浓度、缓冲液组分、辅因子供给和底物供应，最终实现(2S)-柚皮素产量2153.8 ± 60.3 mg/L，时空产率89.7 mg/L/h。

研究背景

(2S)-柚皮素是植物苯丙烷代谢途径产生的核心黄酮类代谢物，具有抗氧化、抗炎、神经保护和抗肿瘤等生物活性，在药物开发、功能性食品加工和化妆品原料制造中应用潜力广泛。传统获取方式主要依赖植物组织提取和人工化学合成，两者均存在生产效率低、操作成本高和环境污染风险大的问题。

为克服这些技术局限，工程化微生物细胞工厂已被广泛用于(2S)-柚皮素的异源生物合成。随着合成生物学和代谢工程的发展，已在多种微生物底盘（包括大肠杆菌、酿酒酵母和解脂耶氏酵母）中成功构建了高效的柚皮素合成途径。在大肠杆菌中，Daza等报道了4 L发酵罐中最高的(2S)-柚皮素滴度（3.11 g/L）。Li等应用系统工程策略在5 L生物反应器中利用酿酒酵母实现了3.42 g/L的(2S)-柚皮素产量。解脂耶氏酵母经工程改造后，通过补料分批培养实现了最高8.65 g/L的滴度和55.4 mg/L/h的生产率。

无细胞生物合成通过将产物合成与细胞生长解耦，提供了一种有前景的替代方案。本研究建立并系统优化了基于大肠杆菌的无细胞系统用于柚皮素生产。

研究方法

菌株与质粒

本研究采用的所有工程化微生物菌株和重组表达质粒列于补充表S1。所有功能性合成基因经大肠杆菌密码子优化后由擎科生物科技有限公司合成，随后亚克隆至pET32a表达载体的BamHI/EcoRI位点。所有目标基因的详细遗传信息和背景总结于表1。

【数据】载体：pET32a；克隆位点：BamHI/EcoRI；基因合成公司：擎科生物；原文未详述基因序列信息

大肠杆菌粗细胞提取物的制备

大肠杆菌粗细胞裂解液的制备方案在先前报道的标准实验程序基础上进行了修改和优化。不含外源合成途径基因的空白大肠杆菌BL21 Star (DE3)菌株在2×YTPG培养基中于37 °C恒温培养。携带目标重组质粒的工程菌株在ZYM-5052自诱导培养基中培养，该培养基组成为1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、25 mM磷酸氢二钠、25 mM磷酸二氢钾、50 mM氯化铵、5 mM硫酸钠、0.5%甘油、0.05%葡萄糖、0.2%乳糖、2 mM硫酸镁和0.2×微量元素母液。1000倍浓缩微量元素溶液由50 mM氯化铁、20 mM氯化钙、10 mM氯化锰、10 mM硫酸锌、2 mM氯化钴、2 mM氯化铜、2 mM氯化镍、2 mM钼酸钠、2 mM亚硒酸钠和2 mM硼酸溶解于60 mM稀盐酸中配制而成。将50 mL种子菌液转入250 mL摇瓶中，于37 °C、250 rpm连续振荡培养。当OD600吸光度值达到0.6–0.8时，加入0.1 mM IPTG诱导异源蛋白表达，菌株在16 °C继续过夜培养。通过4 °C低温条件下4000 × g离心10 min收获菌体。收集的细胞沉淀用预冷的S30缓冲液（10 mM Tris-乙酸，pH 8.2；14 mM乙酸镁；60 mM谷氨酸钾）洗涤三次，用液氮快速冷冻，保存于-80 °C备用。粗裂解液制备时，每克湿菌体用1 mL S30缓冲液重悬。采用冰浴超声处理破碎细胞，输出功率220 W（工作3 s、间歇5 s，总处理时间10 min）。匀浆后的细胞溶液在4 °C下18000 × g离心15 min，彻底去除细胞碎片和不溶性杂质。收集的上清液分装后用液氮速冻，保存于-80 °C。各粗裂解液样本的总蛋白浓度采用经典Bradford比色法定量。

【数据】培养基：2×YTPG（空白菌株）、ZYM-5052自诱导培养基（工程菌株）；诱导温度：16 °C；诱导剂：0.1 mM IPTG；诱导时机：OD600 0.6–0.8；培养温度：37 °C；摇床转速：250 rpm；离心条件：4000 × g，10 min，4 °C；超声功率：220 W；超声模式：工作3 s/间歇5 s；超声总时间：10 min；超速离心：18000 × g，15 min，4 °C；S30缓冲液：10 mM Tris-乙酸 pH 8.2，14 mM乙酸镁，60 mM谷氨酸钾；重悬比例：1 mL S30缓冲液/g湿菌体；蛋白定量方法：Bradford法

无细胞蛋白合成（CFPS）

无细胞蛋白合成反应在15 μL微量体系中进行，对传统实验方案进行了轻微修改。完整反应体系包含2.2 μL溶液A（含1.2 mM ATP、0.85 mM混合GTP/UTP/CTP、0.034 mg/mL亚叶酸钙、0.171 mg/mL tRNA、0.40 mM NAD、0.27 mM CoA、4 mM草酸、1 mM腐胺、1.5 mM亚精胺和57 mM HEPES缓冲液，pH 7.5）、2.1 μL溶液B（含8 mM谷氨酸镁、10 mM谷氨酸铵、134 mM谷氨酸钾、33.33 mM磷酸烯醇式丙酮酸和20种标准氨基酸各2 mM）、4.5 μL通路酶粗裂解液（终蛋白浓度12 mg/mL）和0.8 μL质粒模板（终浓度20 ng/μL）。补充超纯水使总反应体积达到15 μL。在37 °C恒温孵育4 h后，反应混合物经低速低温离心收集上清液。通过Bradford法测定CFPS的总蛋白含量。新合成蛋白量由表达通路酶的菌株总蛋白含量减去不含通路的菌株总蛋白含量计算得出。

【数据】反应体积：15 μL；溶液A组分：1.2 mM ATP、0.85 mM GTP/UTP/CTP混合、0.034 mg/mL亚叶酸钙、0.171 mg/mL tRNA、0.40 mM NAD、0.27 mM CoA、4 mM草酸、1 mM腐胺、1.5 mM亚精胺、57 mM HEPES pH 7.5；溶液B组分：8 mM谷氨酸镁、10 mM谷氨酸铵、134 mM谷氨酸钾、33.33 mM PEP、20种氨基酸各2 mM；粗裂解液体积：4.5 μL；蛋白终浓度：12 mg/mL；质粒终浓度：20 ng/μL；孵育温度：37 °C；孵育时间：4 h

(2S)-柚皮素的无细胞生物合成（CFBS）

所有CFBS反应在1.5 mL无菌离心管中进行。基础反应体系包含8 mM谷氨酸镁、10 mM谷氨酸铵、134 mM谷氨酸钾、S30缓冲液（10 mM Tris、14 mM乙酸镁、60 mM乙酸钾，pH 8.0）、1.5 mM ATP、1.5 mM CoA、1.5 mM NADPH和10 mM磷酸氢二钾，以及不同剂量的通路相关催化酶。对于CFME催化系统，所有功能酶均来自表达单一目标酶的菌株粗裂解液，终浓度为4 mg/mL。通过添加2 mM L-酪氨酸启动合成反应，随后在37 °C孵育24 h。对于CFPS-ME系统，4CL酶预先通过CFPS反应体外合成，然后与另外三种酶的粗裂解液（各4 mg/mL）混合启动偶联催化反应。对于优化的CFPS-4CL系统，4CL表达质粒与其余三种酶裂解液（各4 mg/mL）共孵育4 h完成体外4CL蛋白合成。随后向体系中补充L-酪氨酸、ATP和CoA，维持连续催化反应20 h用于(2S)-柚皮素生产。

【数据】反应容器：1.5 mL无菌离心管；基础体系：8 mM谷氨酸镁、10 mM谷氨酸铵、134 mM谷氨酸钾、S30缓冲液（10 mM Tris、14 mM乙酸镁、60 mM乙酸钾，pH 8.0）、1.5 mM ATP、1.5 mM CoA、1.5 mM NADPH、10 mM磷酸氢二钾；CFME酶终浓度：各4 mg/mL；CFME底物：2 mM L-酪氨酸；CFME反应条件：37 °C，24 h；CFPS-ME：4CL预先CFPS合成，与三种酶裂解液各4 mg/mL混合；CFPS-4CL：4CL质粒与三种酶裂解液共孵育4 h，随后补加底物和辅因子反应20 h

代谢物定量

CFBS反应后，加入10倍体积甲醇终止反应。混合物剧烈涡旋1 min，然后12000×g离心3 min提取代谢物。上清液用0.22 μm膜过滤后进行HPLC检测。合成代谢物的定量检测使用Thermo Dionex Ultimate 3000高效液相色谱系统，配备C18反相色谱柱，柱温稳定在30 °C，参照先前发表的方法。流动相由10 mM甲酸铵水溶液（pH 3.0，A相）和纯乙腈（B相）组成。洗脱梯度程序设置如下：0–0.5 min，5% B相；0.5–7.0 min，5%至60% B相线性梯度洗脱；7.0–9.5 min，60% B相等度洗脱；9.5–9.6 min，60%至5% B相线性梯度洗脱；9.6–12 min，5% B相稳定洗脱。流速维持1.5 mL/min。对香豆酸、柚皮素查尔酮和(2S)-柚皮素的检测波长分别设为333 nm、370 nm和290 nm。制备梯度浓度标准曲线用于目标产物的绝对定量分析。对香豆酸、柚皮素查尔酮和(2S)-柚皮素在其相应可检测波长下的保留时间分别为6.35 min、8.17 min和8.33 min。标准曲线见补充图S1。LC-MS分析参照先前研究进行。样品使用Waters Synapt G2 Si Q-TOF LC-MS分析，进样体积3 μL，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）。缓冲液A为含0.1%甲酸的水，缓冲液B为含0.1%甲酸的乙腈。程序设置为梯度：1 min 5% B起始，10.1–13 min 95% B，13.1–15 min 5% B，流速0.25 mL/min。质谱在负电喷雾电离模式下进行，毛细管电压2.5 kV，源温度120 °C，锥孔气流40 L/h，脱溶剂温度350 °C，脱溶剂气流800 L/h。数据采集在Fast Data-Dependent Acquisition模式下进行，质量范围m/z 50–1200。MS/MS碎裂采用碰撞能量梯度：低质量（LM）梯度10至20 eV，高质量（HM）梯度20至40 eV。

【数据】终止方式：10倍体积甲醇；涡旋：1 min；离心：12000×g，3 min；过滤：0.22 μm膜；HPLC系统：Thermo Dionex Ultimate 3000；色谱柱：C18反相柱；柱温：30 °C；流动相A：10 mM甲酸铵 pH 3.0；流动相B：纯乙腈；流速：1.5 mL/min；检测波长：对香豆酸333 nm、柚皮素查尔酮370 nm、(2S)-柚皮素290 nm；保留时间：对香豆酸6.35 min、柚皮素查尔酮8.17 min、(2S)-柚皮素8.33 min；LC-MS进样体积：3 μL；LC-MS流速：0.25 mL/min；毛细管电压：2.5 kV；源温度：120 °C；脱溶剂温度：350 °C

统计分析

所有实验组设置三个独立生物学重复，使用同一批次提取物。

【数据】重复数：3个独立生物学重复；原文未详述统计分析方法

研究结果

无细胞生物合成系统的构建

以L-酪氨酸为起始底物的(2S)-柚皮素生物合成途径需要四种核心酶的协同催化（酪氨酸解氨酶TAL、4-香豆酸-CoA连接酶4CL、查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI）以及三种必需辅因子，包括三磷酸腺苷（ATP）、辅酶A（CoA）和丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）（图1A）。工程化大肠杆菌报道的最高L-酪氨酸滴度为109.2 g/L，高于大肠杆菌中柚皮素滴度（3.11 g/L）。因此，本研究聚焦于从L-酪氨酸到(2S)-柚皮素的生物合成途径。虽然未测定柚皮素的手性，但使用了与文献相同的通路酶，因此推断柚皮素的立体构型为S型。本研究构建并系统比较了三种不同的无细胞催化框架（图1B），即CFME、CFPS-ME和CFPS-4CL。三种平台的操作流程标准化如下：1）CFME系统：四种单一酶的粗裂解液混合后在37 °C连续反应24 h；2）CFPS-ME系统：4CL蛋白先通过CFPS合成，然后与另外三种酶裂解液混合进行24 h偶联催化反应；3）CFPS-4CL系统：4CL表达质粒与三种酶裂解液共孵育4 h进行体外酶合成，随后补充底物和辅因子进行20 h催化反应。定量检测结果证实，定制的CFPS-4CL系统实现了最高的(2S)-柚皮素积累，约为传统CFME系统产量的四倍（图1C）。我们还进一步用表达其他三种酶的质粒替换CFPS-4CL系统中的4CL质粒，结果证实CFPS-4CL系统表现出最高的(2S)-柚皮素产量（图S2）。这表明4CL是(2S)-柚皮素生物合成中的关键酶。CFPS 4 h后，加入2 mM L-酪氨酸进行(2S)-柚皮素的CFBS。同时，质粒和提取物同时反应时产量无显著变化。因此，后续反应的所有组分可同时加入系统中反应24 h。

【数据】通路酶：TAL、4CL、CHS、CHI；辅因子：ATP、CoA、malonyl-CoA；L-酪氨酸最高滴度：109.2 g/L；大肠杆菌柚皮素滴度：3.11 g/L；CFME反应时间：24 h，37 °C；CFPS-4CL预孵育：4 h；CFPS-4CL催化反应：20 h；CFPS-4CL产量：约为CFME的4倍；底物添加：2 mM L-酪氨酸

▲ Cell-free biosynthesis of (2S)-naringenin. (A) Biosynthetic pathway of (2S)-naringenin from L-tyrosine. (B) Schematic diagram of CFME, CFPS-ME and CFPS-4CL system. (C) Comparison of p-coumaric acid and naringenin yields in different synthesis systems. CFME reaction mixtures contain CFBS reaction sol

最优酶同源物的筛选

基于最优的CFPS-4CL催化框架，对合成途径中四个催化基因进行了系统性跨物种筛选，以筛选高活性同源酶。基于近期文献选择了催化活性较高的候选酶（表1）。筛选结果表明，来自胶红酵母的RgTAL、来自矮牵牛的PhCHSA和来自玉米的ZmCHI在CFPS-4CL系统中分别对TAL、CHS和CHI表现出最佳的催化性能（图2A、C、D）。在相同浓度4 mg/mL下，不同CHS同源变体之间未检测到催化效率的显著差异。来自拟南芥的At4CL4对柚皮素合成的催化活性显著高于其他筛选的4CL同源物（图2B）。

【数据】最优TAL：RgTAL（胶红酵母）；最优4CL：At4CL4（拟南芥）；最优CHS：PhCHSA（矮牵牛）；最优CHI：ZmCHI（玉米）；CHS测试浓度：4 mg/mL；不同CHS同源物间无显著差异

▲ Screening of optimal enzyme orthologs based on (2S)-naringenin yield in the CFPS-4CL system. (A) Screening of optimal TAL orthologs. (B) Screening of optimal 4CL orthologs. (C) Screening of optimal CHS orthologs. (D) Screening of optimal CHI orthologs. In CFPS-4CL reactions, the concentration of eac

粗酶提取物和质粒浓度的优化

为进一步提高(2S)-柚皮素产量，我们对建立的CFPS-4CL系统的各组分进行了系统优化。首先优化了粗酶提取物和4CL质粒的浓度。在初始CFPS-4CL系统中，大肠杆菌BL21粗提取物的体积百分比设为30%。当三种酶粗提取物（RgTAL + PhCHSA + ZmCHI）总体积百分比低于30%时，用不含酶的E. coli BL21 Star (DE3)粗提取物调整至30%。由于同批次粗酶提取物的体积随蛋白浓度增加而增加，因此在相同总粗提取物体积百分比和相同蛋白浓度下比较(2S)-柚皮素产量。随后设置总粗提取物体积百分比梯度（30%、40%、50%、60%、70%和80%），每个体积百分比选择五个蛋白浓度梯度。结果表明，在相同总蛋白浓度下，较高的总粗提取物体积百分比通常产生较高的(2S)-柚皮素产量（图3A）。然而，在相同总粗提取物体积百分比下，最高的总蛋白浓度并未产生最高的(2S)-柚皮素产量。最高产量在总粗提取物体积百分比80%和总蛋白浓度76.5 mg/mL时实现。基于总粗提取物体积百分比60%和总蛋白浓度60 mg/mL，设置了三种酶的一系列浓度比（RgTAL:PhCHSA:ZmCHI）：1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:2:2、1:3:3、1:4:4和1:5:5。结果表明，改变三种酶的浓度比并未显著提高(2S)-柚皮素产量（图3B）。测试比例中最高产量出现在RgTAL:PhCHSA:ZmCHI比例为1:2:2时。这一结果与体内研究一致，后者已确定CHS和CHI为(2S)-柚皮素生物合成中的限速酶。随后进行梯度实验优化4CL质粒浓度，初始浓度为20 ng/μL。在1:1:1和1:2:2酶比例下比较不同质粒浓度的产量，结果表明最高产量在RgTAL:PhCHSA:ZmCHI比例1:2:2和4CL质粒浓度25 ng/μL时实现（图3C）。

【数据】初始粗提取物体积百分比：30%；体积百分比梯度：30%、40%、50%、60%、70%、80%；最优体积百分比：80%；最优总蛋白浓度：76.5 mg/mL；酶比例测试条件：60%体积百分比、60 mg/mL总蛋白；测试比例：1:1:1至1:5:5共13组；最优酶比例：RgTAL:PhCHSA:ZmCHI = 1:2:2；最优4CL质粒浓度：25 ng/μL；初始质粒浓度：20 ng/μL

▲ Effects of crude enzyme extract and plasmid concentrations on p-coumaric acid and (2S)-naringenin yields. (A) (2S)-naringenin yields at different total protein concentrations (RgTAL + PhCHSA + ZmCHI) and different total E. coli BL21 crude extract volume percentages. The control condition was a RgTAL

溶液A和溶液B浓度的优化

细胞破碎破坏了胞内稳态代谢环境，导致内源性小分子代谢物丢失，需要合理的外源补充以维持高催化活性。经典CFPS反应体系由供能溶液A和含无机盐及氨基酸的溶液B组成。通过单组分缺失实验阐明各组分对(2S)-柚皮素合成的必要性。从溶液A中去除任何单一组分均未显著降低(2S)-柚皮素产量（图4A），而从溶液B中去除任何单一组分均导致产量显著降低（图4B）。这些结果表明溶液B组分对CFPS-4CL系统中(2S)-柚皮素生物合成是必需的，而溶液A组分是非必需的。我们进一步测试了不同浓度的溶液A和溶液B。当溶液B浓度保持不变、溶液A浓度减半时，对香豆酸产量下降而(2S)-柚皮素产量增加（图S3）。溶液A完全去除导致(2S)-柚皮素产量显著增加（图4A、C）。鉴于溶液B组分的必要性，我们在无溶液A条件下优化了溶液B各组分的浓度。对15×盐溶液组分和PEP的单因素分析表明，谷氨酸镁、谷氨酸铵和谷氨酸钾浓度分别为6 mM、6 mM和110 mM时(2S)-柚皮素产量最高，而最优PEP浓度与原始系统相同（图S4）。优化盐溶液下的产量是原始系统的1.4倍（图4D）。接下来研究哪些氨基酸能显著提高(2S)-柚皮素产量。由于添加单个氨基酸可能改变反应体系的pH，首先进行了pH梯度实验。结果表明(2S)-柚皮素产量随pH升高而降低，最高产量在pH 6.5时实现。

【数据】溶液A单组分去除：产量无显著降低；溶液B单组分去除：产量显著降低；溶液A完全去除：产量显著增加；最优谷氨酸镁浓度：6 mM；最优谷氨酸铵浓度：6 mM；最优谷氨酸钾浓度：110 mM；最优PEP浓度：与原始系统相同；优化盐溶液产量：原始系统的1.4倍；最优pH：6.5；pH趋势：产量随pH升高而降低

▲ Effects of Solution A and Solution B concentrations on p-coumaric acid and (2S)-naringenin yields. (A) p-Coumaric acid and (2S)-naringenin yields when individual components of Solution A were added separately. The reaction with the original complete Solution A served as the control. In the absence o

pH、氨基酸浓度和溶液A添加的影响

在不同反应pH值下（含或不含溶液A），测定了对香豆酸和(2S)-柚皮素产量（图5A）。在不同浓度19种氨基酸下测定了pH变化和(2S)-柚皮素产量（图5B）。

【数据】原文未详述具体数值，详见原文图5

▲ pH、氨基酸浓度和添加溶液A对p-香豆酸和(2S)-柚皮素产量的影响。(A)在不同反应pH值下，添加或不添加溶液A时p-香豆酸和(2S)-柚皮素的产量。(B)在不同浓度的19种氨基酸下pH变化和(2S)-柚皮素产量

外源关键辅因子补充的影响

在无溶液A条件下，测定了不同ATP和CoA浓度下的对香豆酸和(2S)-柚皮素产量（图6A）。在不添加外源ATP或CoA的条件下作为对照。进一步测定了其他辅因子补充对产量的影响（图6B）。

【数据】原文未详述具体数值，详见原文图6

▲ Effects of exogenous key cofactor supplementation on p-coumaric acid and (2S)-naringenin yields in the absence of Solution A. (A) p-Coumaric acid and (2S)-naringenin yields at different ATP and CoA concentrations. The reaction without exogenous ATP or CoA served as the control. (B) p-Coumaric acid a

不同L-酪氨酸浓度下的产量

在不同L-酪氨酸浓度下测定了对香豆酸和(2S)-柚皮素产量。CFBS反应混合物包含溶液A、溶液B、4CL质粒、含pET32-TAL、pET32-CHI和pET32-CHS的E. coli BL21 Star (DE3)提取物和水。所有水均被E. coli提取物替换。

【数据】原文未详述具体数值，详见原文图7

▲ p-Coumaric acid and (2S)-naringenin yields at different L-tyrosine concentrations. The CFBS reaction mixtures contained Solution A, Solution B, 4CL plasmid, extract of E. coli BL21 Star (DE3) containing pET32-TAL, pET32-CHI and pET32-CHS, and water. All the water was replaced by the extract of E. co

逐步优化过程中的产量提升

在从L-酪氨酸出发的无细胞生物合成系统优化过程中，(2S)-柚皮素产量的逐步提升见图8。与原始CFPS-4CL系统相比的统计显著性表示为****，P < 0.0001。误差棒代表均值标准误（n = 3）。

【数据】统计显著性：****，P < 0.0001；误差棒：均值标准误；n = 3

▲ Stepwise improvement in (2S)-naringenin yield during optimization of the cell-free biosynthetic system from L-tyrosine. Statistical significance compared to the original CFPS-4CL system is indicated as ****, P < 0.0001. Error bars represent the standard error of the mean (n = 3). The biological repl

4CL-CFPS反应的时间依赖性生产

不同时间点（0、4、8、12、16、20和24 h）的柚皮素产量见图9A。相应时间点290 nm处柚皮素的HPLC色谱图见图9B。

【数据】时间点：0、4、8、12、16、20、24 h；检测波长：290 nm

▲ Time-dependent production of the 4CL-CFPS reaction for the yield of naringenin and corresponding HPLC analysis. (A) The yield of naringenin at different time points (0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h). (B) HPLC chromatograms of naringenin at 290 nm taken at the corresponding time points shown in (A). Th

讨论与解读

无细胞生物制造是一项创新的合成生物学技术，从根本上解决了限制传统体内微生物发酵的多个瓶颈，包括微生物生长限制、胞内前体竞争代谢和产物诱导的细胞毒性。本研究基于大肠杆菌粗细胞裂解液成功构建了高效的(2S)-柚皮素体外合成平台。优化的CFPS-4CL系统实现了柚皮素滴度2153.8 ± 60.3 mg/L、得率64.6%（g/g）和时空产率89.7 mg/L/h（表2）。(2S)-柚皮素滴度仅通过优化CFBS组分获得。优化反应体积、温度、孵育时间等后，(2S)-柚皮素产量可能进一步提高。各种(2S)-柚皮素生物合成系统的比较见表2。本研究中获得的(2S)-柚皮素滴度低于使用更廉价碳源葡萄糖的体内发酵系统，但CFBS的时空产率（生产率）高于发酵系统。尽管CFBS实现了更高的时空产率，但其放大和经济可行性仍是主要挑战。CFBS反应混合物含粗裂解液、质粒模板、氨基酸和更昂贵的底物（L-酪氨酸和L-苯丙氨酸），导致原料成本高于体内发酵。

编译者解读：该研究在无细胞系统架构选择上颇具策略性——将最关键的4CL酶改为质粒原位表达，巧妙规避了4CL蛋白体外合成后活性损失的难题，使产量较传统CFME提升4倍。多维优化思路（酶同源物筛选→浓度配比→缓冲液简化→辅因子调控）系统性强，但产量仍低于体内发酵，且粗裂解液批次差异和质粒成本是放大瓶颈。未来若能将关键酶固定化或采用廉价底物替代，无细胞黄酮合成路线的经济性有望改善。

参考来源

期刊：BioDesign Research, 2026

DOI: 10.1016/j.bidere.2026.100111

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