来源：Modulating Aspergillus fumigatus secondary metabolism for enhanced biosynthesis of stable TiO2 nanoparticles and synthetic dye degradation（Results in Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
纺织染料废水排放带来的环境风险持续加剧，传统纳米颗粒制备方法又常伴随有毒副产物。本研究从涂料厂废水中分离出一株耐受钛离子的真菌，经形态学与分子鉴定为烟曲霉 Aspergillus fumigatus AUMC16399。研究揭示了一个有趣的双重角色——TiO₂既是纳米材料的构建单元，又是触发真菌氧化应激的代谢调节因子，可将代谢通量从初级生长转向次级代谢，大幅提升酚类和单宁等还原性封端剂的产量。在优化条件下合成的TiO₂-NPs为纯相锐钛矿结构，平均水合粒径257.2 nm，Zeta电位−27.02 mV，在自然阳光下30分钟内对结晶紫的脱色率达47.2%。
研究背景
水体污染是全球持续关注的议题。纺织染料因大量排入水生环境而占据相当比例，多数染料具有致癌性、抗生物降解性、高毒性和致突变性，对人类及水生生物均构成威胁。染料还通过阻碍太阳光穿透影响水生植物，抑制光合作用并降低水体溶解氧水平。因此，在排放前将染料降低或去除至允许浓度是刚性需求。
这一需求推动了多种技术的采用，纳米技术是其中最新的方向之一，在废水处理中具有提高处理效率、通过安全利用非常规水源增加供水量的潜力。但传统物理或化学法制备纳米颗粒存在局限，常产生对环境有毒的副产物。这催生了对高产、低成本、无毒纳米颗粒的需求，生物体系因此被开发为生态友好的“纳米工厂”。绿色纳米技术旨在带来更清洁的生态系统。二氧化钛（TiO₂）纳米颗粒因其强度、光泽和耐腐蚀性而成为最有前景的纳米材料之一。
研究方法
2.1 化学试剂
化学品和溶剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich化学公司（美国密苏里州圣路易斯，63103）。二氧化钛粉末（99.8%，痕量金属基准）购自Sigma-Aldrich化学公司。整个研究过程使用去离子水。本研究在埃及国家研究中心农业微生物系以及坦塔大学理学院植物学与微生物学系进行，目的是生物合成钛纳米结构以保护环境免受有害污染物影响。
【数据】试剂纯度：分析纯；TiO₂纯度：99.8%（痕量金属基准）；试剂来源：Sigma-Aldrich；用水：去离子水
2.2 土壤和废水样品采集
土壤和废水样品采集自Gharbia省Basyon市Alfarastaq地区的一家当地涂料厂。样品收集于灭菌袋和瓶中，采集后立即转移至实验室，并在冰箱（4 °C）中保存至使用。实验在采样次日进行。
【数据】采样地点：Gharbia省Basyon市Alfarastaq涂料厂；保存温度：4 °C；实验时间：采样次日
2.3 真菌分离与纯化
以下所有分离步骤均在无菌条件下进行三次重复。土壤样品按10%比例稀释（1 g土壤加10 mL水），在摇床上孵育1小时，静置10分钟，然后取10 mL上清液加入含100 mL灭菌富集培养基的250 mL锥形瓶中。富集培养基成分（g/L）：蔗糖30.0；亚硝酸钠2.0；磷酸氢二钾1.0；硫酸镁0.5；氯化钾0.5；硫酸亚铁0.01；二氧化钛（TiO₂）。各成分溶解后用蒸馏水定容至1升。调节培养基pH后，在121 °C下高压灭菌20分钟。
取10 mL废水样品加入250 mL锥形瓶中的100 mL灭菌富集培养基中。接种后的锥形瓶在28 °C、120 rpm振荡条件下孵育14天。再富集培养使用10 mL旧培养物接种至100 mL灭菌富集培养基中，在相同条件下孵育7天。制备含0.02 g TiO₂的琼脂培养基并分装至培养皿中以分离目标真菌。接种1 mL培养物并孵育5天。重复纯化步骤直至获得纯分离株，随后将纯分离株保存于4 °C斜面培养基上。
【数据】土壤稀释比例：10%（1 g/10 mL）；摇床孵育：1 h；静置：10 min；富集培养基pH调节后灭菌：121 °C、20 min；废水接种量：10 mL/100 mL；孵育条件：28 °C、120 rpm、14天；再富集：10 mL/100 mL、7天；分离培养基TiO₂含量：0.02 g；分离孵育：5天；保存温度：4 °C
2.4 最活跃真菌的筛选与选择
通过两个阶段、两种培养基筛选和选择产纳米钛最活跃的真菌。使用改良Czapek's Dox琼脂培养基测试真菌分离株在高浓度二氧化钛盐中的生长能力。该培养基含（g/L）：蔗糖30.0；亚硝酸钠2.0；磷酸氢二钾1.0；硫酸镁0.5；氯化钾0.5；硫酸亚铁0.01，并添加不同浓度的TiO₂（7、9、11、13、15 g/L）。培养基灭菌后分装至培养皿。凝固后，接种不同分离株，在28 °C孵育7天后观察生长情况。选择最强效的分离株。
制备Czapek's Dox液体培养基，分装至含100 mL的250 mL锥形瓶中并灭菌。每个锥形瓶接种所选分离株，在28 °C、120 rpm振荡条件下孵育。5天后过滤培养基，真菌滤液用于TiO₂-NPs生产。
【数据】TiO₂浓度梯度：7、9、11、13、15 g/L；琼脂培养温度：28 °C；琼脂培养时间：7天；液体培养基装量：100 mL/250 mL锥形瓶；液体培养条件：28 °C、120 rpm；培养时间：5天
2.5 所选真菌分离株微合成二氧化钛纳米颗粒
选择显示最高最大耐受浓度（MTC）值的真菌分离株，接种至100 mL Czapek's Dox液体培养基中，在28 °C、120 rpm轨道摇床中孵育72小时。随后通过无菌Whatman滤纸在层流条件下过滤生长培养液获得真菌生物量。将50 mL去除真菌细胞的滤液与50 mL 1% TiO₂混合，孵育过夜。用1% NaOH将pH调节至10，然后将混合物在摇床中孵育48小时。混合物在6000 rpm、10 °C下离心10分钟，共3个循环，中间用蒸馏水洗涤。随后用双光束紫外-可见分光光度计分析沉淀，检测特征吸收峰。在紫外-可见光谱中显示明显特征峰（表明TiO₂-NPs成功形成）的真菌分离株被选用于进一步研究。
【数据】接种量：100 mL培养基；孵育条件：28 °C、120 rpm、72 h；滤液与TiO₂混合比例：50 mL:50 mL；TiO₂浓度：1%；过夜孵育；pH调节：1% NaOH调至pH 10；摇床孵育：48 h；离心条件：6000 rpm、10 °C、10 min、3个循环
2.6 最强TiO₂-NPs生产者真菌分离株的鉴定
选择一株作为超级TiO₂-NPs生产者的真菌分离株进行形态学表征。采用盖玻片培养法进行真菌形态鉴定[13]。制备含薄层马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）的无菌培养皿。将无菌盖玻片以45°角插入琼脂培养基中。使用无菌接种针，将少量真菌分离株接种到靠近插入盖玻片的琼脂表面。培养皿在25–28 °C孵育5–7天，使真菌生长覆盖盖玻片。孵育后，用无菌镊子小心取出带有真菌生长的盖玻片，置于干净载玻片上。真菌菌丝和孢子的湿制片用乳酸酚棉蓝染色，轻轻盖上第二块盖玻片制成永久封片。在显微镜下检查载玻片以观察真菌形态。使用德国Axiostar plus三目研究显微镜进行检查。图像使用日本制造的Power Shot G6数码相机（710万像素）拍摄。染色菌丝、产孢细胞和分生孢子的图像在1000×放大倍数下拍摄。
同时应用分子鉴定以确认和完成目标真菌分离株的鉴定。真菌分离株在CYA培养基平板上生长，在25 °C孵育7天[14]。刮取少量真菌菌丝体悬浮于100 μl蒸馏水中，在100 °C煮沸15分钟，保存于−70 °C。样品送至SolGent公司（韩国大田）完成从DNA提取到DNA测序最终步骤的全过程。使用SolGent纯化磁珠提取和分离真菌DNA。使用通用引物扩增核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）：ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′）和ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）。使用ABI 9700热循环仪进行扩增。使用Solgent EF Taq制备聚合酶链反应（PCR）混合物如下：10× EF-Taq缓冲液2.5 μl，10 mM dNTP（T）0.5 μl，引物（F-10p）1.0 μl，引物（R-10p）1.0 μl，EF-Taq（2.5 U）0.25 μl，模板1.0 μl，DW补至25 μl。
扩增使用以下PCR反应条件：一轮扩增包括95 °C变性15分钟，随后30个循环的95 °C变性20秒、50 °C退火40秒、72 °C延伸1分钟。最后72 °C最终延伸5分钟。PCR产物在测序前用SolGent PCR纯化试剂盒-Ultra（SolGent，韩国大田）纯化。纯化的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳重新确认（使用大小标记）。然后洗脱这些条带并测序。每个样品使用相同引物和ddNTPs（big dye）在正向和反向方向测序。使用CLCBio Main Workbench程序从测序数据创建重叠群。获得的序列使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的BLAST进一步分析。获得的序列与从GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）检索的序列一起用于……
【数据】PDA培养皿；盖玻片插入角度：45°；孵育温度：25–28 °C；孵育时间：5–7天；显微镜放大倍数：1000×；CYA培养：25 °C、7天；菌丝悬浮液：100 μl蒸馏水；煮沸：100 °C、15 min；保存：−70 °C；PCR体系：25 μl（10×缓冲液2.5 μl、dNTP 0.5 μl、F引物1.0 μl、R引物1.0 μl、EF-Taq 0.25 μl、模板1.0 μl）；PCR条件：95 °C 15 min→30循环（95 °C 20 s、50 °C 40 s、72 °C 1 min）→72 °C 5 min；凝胶：1%琼脂糖
研究结果
3.1 产TiO₂-NPs真菌的分离与筛选
本方法的主要目标是获得能将钛离子还原为其纳米结构的真菌分离株。为此，从污染场地采集了不同样品（土壤和废水）。经过多轮富集循环后，分离出7株具有不同形态特征的真菌。这些分离株显示出在添加0.2%二氧化钛（TiO₂）的Czapek's Dox培养基上生长的能力，证明其对金属离子具有耐受性。这些分离株被纯化并保存在Czapek's Dox琼脂斜面上供进一步研究。它们在TiO₂补充条件下生长的能力表明其具有与纳米颗粒形成相关的潜在代谢活性[28]。
因此，对7株耐受分离株进行了生物合成二氧化钛纳米颗粒能力的筛选。将7株纯化真菌分离株接种到添加梯度浓度TiO₂（7–15 g/L）的改良Czapek's Dox琼脂上，以确定TiO₂的最低耐受浓度（MTC）。所有分离株均表现出对TiO₂的显著耐受性（图1）。
随后，将分离株在含10% TiO₂的Czapek's Dox液体培养基中培养，以评估其生物合成TiO₂-NPs的潜力。通过紫外-可见光谱在200–800 nm范围内评估7株真菌分离株各自的生物转化产物（图2）。选择紫外-可见光谱中吸光度最高的值，视为最强效的真菌分离株。使用紫外-可见分光光度计监测TiO₂纳米颗粒的形成，检测反应混合物光学吸收的变化。由于TiO₂是宽禁带半导体而非等离激元金属，其特征吸收对应于紫外区的带边跃迁而非表面等离激元共振[29]。在200–800 nm范围内记录光谱以识别与纳米颗粒形成相关的吸收边。所得结果表明，只有4株分离株显示出明显的吸收峰，表明其适合进一步研究。4株真菌分离株No. 1、3、5和6的最高峰分别为248、244、246和255 nm。这些结果与先前报道的生物合成TiO₂-NPs类似谱图的研究一致[30]。从这4株分离株中，选择No. 3用于进一步研究。
【数据】分离株数量：7株；TiO₂补充浓度：0.2%；MTC测试TiO₂梯度：7、9、11、13、15 g/L；耐受温度：28 °C；耐受时间：7天；液体培养TiO₂浓度：10%；UV-Vis扫描范围：200–800 nm；4株分离株吸收峰：248、244、246、255 nm
3.2 所选最强TiO₂-NPs生产者真菌的鉴定
所选真菌分离株基于其显微特征（形态学鉴定）和分子鉴定进行鉴定（图3）。形态学鉴定方面，其特征为快速生长的烟绿色粉末状菌落，背面呈白色至棕褐色。显微镜下，具有短而光滑壁的分生孢子梗（长达300 μm），末端为烧瓶形（亚棒状）顶囊，其上着生单列、密集的瓶梗，产生球形、2.4–3.7 μm的绿色棘状（带刺）分生孢子，排列成密集的柱状。
最强效的TiO₂-NPs生产真菌分离株（No. 3）也在分子水平上进行了鉴定。ITS rDNA序列的系统发育分析确认分离株No. 3为烟曲霉 Aspergillus fumigatus AUMC16399，与同种多个菌株显示100%一致性（98–100%覆盖度），包括模式菌株 A. fumigatus ATCC 1022（NR_121481）。多项研究已证实曲霉属物种可被分离并用于TiO₂-NPs的生物合成。例如，黑曲霉 Aspergillus niger DS22被报道可使用培养滤液高效合成TiO₂-NPs，所得纳米颗粒表现出抗菌、抗炎和伤口愈合活性[31]。其他研究证明了烟曲霉和曲霉属sp. TK4生产表征良好的TiO₂-NPs的潜力，粒径通常在50至200 nm范围内[32]。
【数据】菌落特征：烟绿色粉末状，背面白色至棕褐色；分生孢子梗长度：达300 μm；分生孢子尺寸：2.4–3.7 μm；ITS一致性：100%（98–100%覆盖度）；模式菌株：ATCC 1022（NR_121481）；参考粒径范围：50–200 nm
3.3 通过不同孵育时间（未诱导培养基）最大化烟曲霉还原剂浓度
对烟曲霉 Aspergillus fumigatus AUMC16399的生化响应进行了7天评估。分析了包括总蛋白、酚类、单宁、黄酮类和碳水化合物在内的代谢物。在对照条件下（未诱导培养基——不含TiO₂），烟曲霉AUMC16399表现出典型的生长相关代谢模式（表1）。蛋白质浓度从第1天的58.13 μg/mL急剧上升至第2天的1332.19 μg/mL，表明指数期活跃合成。随后的逐渐下降表明随着培养进入稳定期，生物合成活性降低。这种代谢行为与正常真菌生长动力学一致，即氨基酸和蛋白质合成在早期生物量积累阶段占主导[33]。
酚类和单宁化合物表现出相似模式，逐渐增加至第3天达到最大值（分别为314.00和285.83 μg/mL）。它们在指数期后期和稳定期的积累反映了次级代谢的激活，这通常在营养可用性下降或轻度氧化应激发展时发生[34]。黄酮类水平也在第3天达到峰值（174.80 μg/mL），证实了抗氧化代谢物的协调合成。碳水化合物浓度初始非常高（6477.78 μg/mL），在整个孵育过程中稳步下降，至第7天降至175.69 μg/mL。这种降低表明糖类作为能源和生物合成途径碳骨架被逐步消耗。总体而言，这些发现表明在无胁迫条件下，烟曲霉AUMC16399作为其自然生长周期的一部分，遵循从初级代谢到次级代谢的平衡进程。总体而言，结果揭示了明显的时间模式：碳水化合物和蛋白质在早期指数生长阶段（第2–3天）达到峰值，而酚类、单宁和黄酮类在孵育中期（第3–4天）达到最高水平，随后在稳定期后期下降。
【数据】评估时间：7天；蛋白质：第1天58.13 μg/mL→第2天1332.19 μg/mL；酚类峰值：第3天314.00 μg/mL；单宁峰值：第3天285.83 μg/mL；黄酮类峰值：第3天174.80 μg/mL；碳水化合物初始：6477.78 μg/mL→第7天175.69 μg/mL
3.4 通过不同孵育时间（诱导培养基）最大化烟曲霉还原剂浓度
当TiO₂被加入生长培养基时，观察到真菌代谢模式的显著改变（表2）。蛋白质水平初始增加，在第4天达到中等峰值（927.50 μg/mL），与对照相比更低且延迟。这种降低表明TiO₂纳米颗粒施加了生理胁迫，部分抑制了蛋白质合成和整体生长速率。Xing等人[35]报道了TiO₂对真菌蛋白质代谢的类似抑制作用，他们证明TiO₂暴露因纳米颗粒诱导的氧化损伤而降低了细胞蛋白质含量。
相反，在TiO₂诱导下，酚类和单宁含量显著增加。酚类化合物稳步上升至430 μg/mL，单宁至第6天达到420.42 μg/mL——显著高于对照。这种强烈的上调表明TiO₂触发了氧化应激，刺激了真菌抗氧化防御系统，导致酚类和单宁合成增强以对抗活性氧（ROS）。这些发现与金属氧化物纳米颗粒（如TiO₂）可激活氧化应激信号通路（如MAPK和ROS响应转录因子）、促进酚类生物合成作为保护机制的报道一致[36,37]。黄酮类积累在TiO₂暴露下表现出延迟模式，早期水平较低，但后期在第6天增加至63.80 μg/mL。这种响应表明黄酮类生物合成是在持续氧化压力后发生的次级适应。Cao等人[34]指出，在真菌中，酚类通常比黄酮类更早积累……
【数据】蛋白质峰值：第4天927.50 μg/mL（对照为第2天1332.19 μg/mL）；酚类：第6天430 μg/mL；单宁：第6天420.42 μg/mL；黄酮类：第6天63.80 μg/mL；诱导剂：TiO₂
讨论与解读
本研究成功展示了一种绿色、可持续且优化的生物工艺，利用从当地涂料厂废料场回收的真菌分离株烟曲霉 Aspergillus fumigatus AUMC16399进行结晶二氧化钛纳米颗粒（TiO₂-NPs）的微合成。本调查的一个关键亮点是揭示了钛前体的双重角色——既是纳米材料构建单元，又是生理胁迫诱导剂。生长培养基中TiO₂的存在成功调节了真菌代谢通量，触发氧化防御机制，将生产从初级生物量生长转向关键抗氧化还原和封端剂——特别是总酚类和单宁——的增强积累。通过系统评估操作参数，确定最佳合成条件为5天培养期、1%（w/v）TiO₂诱导、中性pH 7和下游合成温度40 °C。这一特定配置平衡了健康真菌生长与受控、均匀的纳米级组装。综合物理化学表征确认，微合成的TiO₂-NPs为纯相、结晶良好的锐钛矿结构，具有准球形形态，平均水合直径为257.2 nm，负表面电荷−27.02 mV验证了足够的胶体稳定性框架。最终，生物合成的纳米颗粒被证明是……
编译者解读：该研究的巧妙之处在于把“胁迫”变成了“工具”——用TiO₂本身作为代谢调节器，逼迫真菌过量生产酚类和单宁这类天然还原/封端剂，从而绕开了外加化学还原剂的需求。方法学上，盖玻片培养结合ITS测序的鉴定路线经典可靠，UV-Vis、FTIR、XRD、SEM/TEM、DLS/Zeta的完整表征链也足以支撑“稳定纳米颗粒”的结论。但光催化数据仅在自然阳光下30分钟取得，结晶紫脱色率47.2%而甲基橙仅14.1%，对实际复杂染料废水的处理能力尚待验证；此外，257.2 nm的水合粒径偏大，若追求更高比表面积和催化活性，合成条件的进一步细化仍有空间。
参考来源
期刊：Results in Chemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.rechem.2026.103876
DOI: 10.1016/j.rechem.2026.103876