来源：Systems metabolic engineering of a plasmid-free Escherichia coli cell factory for high-level cytidine production（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
胞苷是核苷类药物的关键前体，但微生物发酵生产长期受制于降解竞争、嘧啶通量选择性差、前体供给不足及能量-氧化还原失衡。本研究通过系统代谢工程构建了一株无质粒大肠杆菌细胞工厂：逐级敲除降解与补救途径实现胞苷初步积累，引入解反馈抑制的PyrH/PyrG突变体与NudG强化UMP至CMP转化，借助CipA/CipB支架实现酶簇空间组织使尿苷降低98.70%，重建从头UMP合成并强化前体供给，最后用ATP响应型ydaO基序动态调控呼吸链。最终菌株cyt 23在5 L反应器中50 h产胞苷96.20 g/L，葡萄糖转化率0.38 g/g，生产强度1.92 g/(L·h)。
研究背景
胞苷由胞嘧啶经β-N1-糖苷键与核糖相连，是RNA的基本结构单元，也是多种高价值核苷类似物合成的必需手性起始原料。胞苷及其衍生物用于制备阿糖胞苷、吉西他滨、拉米夫定和索磷布韦等抗病毒与抗癌药物。核苷类似物药物研发的扩张，推动了对可靠、可持续胞苷供应路线的需求。
传统上胞苷依赖化学合成或酵母RNA的酶解与化学水解，这两类方法普遍产率低、纯化工艺复杂且使用危险试剂。相比之下，以可再生原料进行从头发酵合成，在温和水相条件下提供了更具可持续性的路线，并与可规模化的细胞工厂工程相兼容。大肠杆菌因遗传系统简单、代谢网络相对清晰、编辑工具丰富，被选为核苷生产宿主。此前提升大肠杆菌胞苷产量的策略包括随机诱变结合抗性筛选，或对单节点进行理性改造，例如敲除尿苷-胞苷激酶（原文此处节选中断）。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用全部菌株与质粒列于补充材料表S1。大肠杆菌W3110作为所有遗传改造的出发菌株，大肠杆菌DH5α用于质粒构建与克隆。质粒pTrc99a用于测试ydaO基序的调控效果。质粒pREDCas9与pGRB构成CRISPR/Cas9介导的基因组编辑系统。
【数据】菌株：E. coli W3110（出发菌株）、E. coli DH5α（克隆宿主）；质粒：pTrc99a、pREDCas9、pGRB；原文未详述其他参数
2.2 目标基因获取与重组质粒构建
本研究所有引物（表S2）由GENEWIZ生物技术有限公司提供。内源大肠杆菌目标基因以大肠杆菌W3110 DNA为模板扩增。以枯草芽孢杆菌F126基因组DNA为模板，扩增枯草芽孢杆菌来源的pyrB-pyrC-pyrAA-pyrAB E949*-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE基因簇、zwf及ydaO基序。来自酿酒酵母的PHM8 sce、来自透明颤菌的vgb vit，以及来自发光杆菌的cipA和cipB（表S3）经密码子优化后由GENEWIZ生物技术有限公司化学合成。以扩增型诱变和谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，获得谷氨酸棒杆菌来源的突变基因pyrG D160E, E162A, E168K cgl。此处检测的所有突变基因均通过对相应基因组DNA进行扩增型诱变获得，以大肠杆菌pyrH D93A的构建为例说明。首先分别用引物对pyrH-trc-UP-S/pyrH-UP-A和pyrH-DW-S/pyrH-DW-trc-A，从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增上游和下游突变片段pyrH-up与pyrH-dw；引物pyrH-UP-A和pyrH-DW-S含有突变残基D93A及一段共享同源序列。随后将两个片段纯化混合，用引物pyrH-trc-UP-S和pyrH-DW-trc-A进行重叠延伸PCR，获得pyrH D93A。质粒pTrc99a-ydaO-gfp的构建如下：分别用引物ydaO-trc-S/ydaO-gfp-A和ydaO-gfp-S/gfp-trc-A，从ydaO基序和gfp经PCR扩增目标片段ydaO-1和gfp-1，前者的3'端与后者的5'端同源。用引物pTrc99a-XZ-1和pTrc99a-XZ-2制备线性化pTrc99a骨架，其两端含有与ydaO和gfp片段同源的序列。最终通过目标片段与线性化载体之间的同源重组，构建重组质粒pTrc99a-ydaO-gfp。
【数据】模板：E. coli W3110基因组DNA、B. subtilis F126基因组DNA、C. glutamicum基因组DNA；合成基因：PHM8 sce、vgb vit、cipA、cipB（密码子优化）；突变位点：pyrH D93A、pyrG D160E/E162A/E168K；质粒：pTrc99a-ydaO-gfp；原文未详述PCR循环参数
2.3 菌株构建与基因组编辑
使用CRISPR/Cas9将目标基因插入或敲除于大肠杆菌W3110。以cdd的敲除为代表性示例。首先构建质粒pGRB-cdd：通过退火引物pGRB-cdd-up和pGRB-cdd-dw合成含pGRB骨架同源序列的双链DNA（dsDNA）片段，用PCR引物pGRB-S和pGRB-A将pGRB载体线性化；将dsDNA片段连接入线性化载体，得到重组质粒pGRB-cdd。随后制备供体DNA（DNA-cdd）：分别用引物对cdd-QC-1/cdd-QC-2和cdd-QC-3/cdd-QC-4扩增cdd两侧的上游和下游同源臂，再通过重叠延伸PCR融合两个片段。将得到的DNA-cdd与质粒pGRB-cdd共转化入W3110受体细胞。在1 mL含20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、0.5 g/L NaCl、25 μmol/L KCl、0.2 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L葡萄糖的SOC培养基中于32 °C复苏2 h后，将细胞涂布于补充壮观霉素和氨苄青霉素的LB琼脂平板，32 °C培养12 h。用引物cdd-QC-1和cdd-QC-4进行菌落PCR筛选，阳性克隆随后送测序验证（GENEWIZ，苏州，中国）。验证正确的菌株接种于补充10 mmol/L L-阿拉伯糖的LB肉汤中，32 °C过夜培养以诱导λ Red重组系统关闭，从而消除pGRB-cdd。pGRB-cdd消除后，将培养物转接至无抗生素LB肉汤中，42 °C过夜培养以促进含温度敏感复制起点的pREDCas9质粒丢失。所得培养物梯度稀释后涂布于无抗生素LB琼脂。随机挑取24个单菌落，用质粒特异性引物进行菌落PCR筛选，并通过分离株无法在含氨苄青霉素和壮观霉素的LB琼脂上生长，进一步确认pGRB-cdd与pREDCas9被完全去除。最后，每个工程菌株在非选择条件下连续传代10代，选取3–5个验证过的单菌落用于后续摇瓶发酵与进一步改造。
【数据】复苏条件：32 °C、2 h、1 mL SOC（20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、0.5 g/L NaCl、25 μmol/L KCl、0.2 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L葡萄糖）；平板培养：32 °C、12 h；诱导剂：10 mmol/L L-阿拉伯糖；质粒消除温度：42 °C；传代：10代；筛选单菌落：24个；选取克隆：3–5个
2.4 发酵实验
#### 2.4.1 摇瓶发酵
斜面培养基含2.0 g/L葡萄糖、10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母提取物、2.5 g/L NaCl、1.0 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4和25 g/L琼脂，以水为稀释剂，pH调至7.0–7.2。种子培养基含40 g/L葡萄糖、8 g/L酵母提取物、2 g/L蛋白胨、2 g/L (NH4)2SO4、1 g/L MgSO4·7H2O、3 g/L KH2PO4、0.3 g/L甲硫氨酸、1 mg/L VB2、VB1/VB3/VB5/VB12各2 mg/L、1 mg/L生物素和1 mL/L微量元素溶液。发酵培养基含10 g/L葡萄糖、8 g/L酵母提取物、5 g/L谷氨酸、5 g/L柠檬酸、3 g/L (NH4)2SO4、2.5 g/L MgSO4·7H2O、6 g/L KH2PO4、0.5 g/L甲硫氨酸、40 mg/L FeSO4·7H2O、10 mg/L MnSO4、1.5 mg/L VB2、VB1/VB3/VB5/VB12各1 mg/L、0.5 mg/L生物素、1 mL/L微量元素溶液和8 mg/L酚红；pH约为6.9。将冻存菌种接种于液体LB培养基，36 °C活化12 h。随后将2 mL种子培养液转接至含30 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中，36 °C、220 rpm培养24 h。根据酚红颜色变化添加25%（v/v）氨水控制发酵pH。初始培养基中葡萄糖耗尽后，补加灭菌葡萄糖溶液（60%，w/v）作为细胞生长和产物形成的碳源。
【数据】斜面培养基：2.0 g/L葡萄糖、10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母提取物、2.5 g/L NaCl、1.0 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4、25 g/L琼脂，pH 7.0–7.2；种子培养基：40 g/L葡萄糖等；发酵培养基：10 g/L葡萄糖、8 g/L酵母提取物、5 g/L谷氨酸、5 g/L柠檬酸等，pH约6.9；活化：36 °C、12 h；发酵：500 mL摇瓶装30 mL、36 °C、220 rpm、24 h；补料：60%（w/v）葡萄糖；pH控制：25%（v/v）氨水
#### 2.4.2 5 L生物反应器补料分批发酵
将冻存菌种接种于斜面培养基，36 °C活化12 h。将适量活化细胞加入含2 L种子培养基的5 L生物反应器（上海宝兴，中国），36 °C培养，pH范围6.9 ± 0.2，溶氧水平35%–45%。当600 nm光密度（OD600）达到20时，按20%（v/v）比例将种子培养液转接至含2 L发酵培养基的5 L生物反应器，36 °C培养。发酵过程中按需添加25%（v/v）氨水维持pH 6.9 ± 0.2，调节搅拌转速使溶氧浓度保持在35%–45%。添加灭菌葡萄糖溶液（80%，w/v）作为浓缩碳源，维持残余葡萄糖浓度不高于1 g/L。生物反应器所用种子与发酵培养基同摇瓶，仅省略酚红。
【数据】活化：36 °C、12 h；生物反应器：5 L、装液2 L种子培养基；培养：36 °C、pH 6.9 ± 0.2、溶氧35%–45%；转接：OD600=20、20%（v/v）；补料：80%（w/v）葡萄糖、残余葡萄糖≤1 g/L；pH控制：25%（v/v）氨水
2.5 分析方法
细胞生长通过紫外-可见分光光度计（UV1800，上海精科技术仪器有限公司，上海，中国）测定600 nm吸光度。使用SBA-40E生物传感器分析仪（山东省科学院，山东，中国）测定葡萄糖浓度。采用配备UV100 Plus紫外检测器的LC-100系统进行高效液相色谱（HPLC）分析（原文此处节选中断）。
【数据】细胞生长：OD600、UV-Vis（UV1800）；葡萄糖：SBA-40E生物传感器；HPLC：LC-100系统、UV100 Plus紫外检测器；原文未详述色谱柱与流动相参数
研究结果
3.1 系统性削弱胞苷消耗途径
野生型大肠杆菌中的胞苷会被多条竞争途径快速分解，因而不能作为稳定终产物积累。因此，削弱胞苷及其直接前体CMP的分解代谢，是实现胞苷积累的必要条件。大肠杆菌中胞苷降解主要走三条途径（图2A）：胞苷脱氨酶（由cdd编码）将胞苷脱氨为尿苷；嘧啶特异性核苷水解酶（由rihA、rihB和rihC编码）与嘧啶/嘌呤核苷磷酸化酶（由yaiE编码）协同将胞苷分解为胞嘧啶；尿苷-胞苷激酶（由udk编码）将胞苷磷酸化为CMP。同时，CMP位于胞苷直接上游，被两条竞争途径分流：嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶（由ygdH编码）将CMP水解为胞嘧啶，胞苷酸激酶（由cmk编码）将CMP进一步磷酸化为CDP，二者均降低胞苷合成前体的供给效率。为系统性削弱这些竞争旁路，依次敲除cdd、rihA/rihB/rihC、yaiE、udk、ygdH和cmk，获得一系列逐步改造的敲除菌株，命名为cyt 1至cyt 6。摇瓶发酵（图2B）显示，随着敲除模块的累积，工程菌株的胞苷滴度逐步提高。敲除cdd、rihA/rihB/rihC和yaiE的菌株cyt 3最先实现胞苷的显著积累，达到153.43 mg/L，较野生型W3110（13.43 mg/L）提高1042.44%。菌株cyt 6最终胞苷滴度达730.20 mg/L，较W3110提高5337.08%；可见，靶向削弱胞苷降解并抑制CMP消耗，显著增强了胞苷的保留与积累。值得注意的是，副产物尿苷的滴度也随敲除模块的累积而升高，在cyt 6发酵液中达到961.40 mg/L。这些结果表明，仍有相当比例的代谢通量流向尿苷分支；因此，仅削弱胞苷降解不足以实现高效、高选择性的胞苷积累。由于CMP来源于尿苷合成必经的中间体UMP，提高UMP向CMP再向胞苷的通量可分流竞争分支、有利于胞苷合成，这指导了后续的工程策略。
【数据】敲除基因：cdd、rihA/rihB/rihC、yaiE、udk、ygdH、cmk；菌株：cyt 1–cyt 6；cyt 3胞苷滴度：153.43 mg/L（较W3110提高1042.44%）；W3110胞苷滴度：13.43 mg/L；cyt 6胞苷滴度：730.20 mg/L（提高5337.08%）；cyt 6尿苷滴度：961.40 mg/L
3.2 强化UMP至胞苷的生物合成途径
#### 3.2.1 解除反馈抑制并增强UMP至CMP转化
大肠杆菌中UMP向CMP的转化涉及四步连续酶促反应（图3A）。该途径的限速酶为CTP合成酶（由pyrG编码）和UMP激酶（由pyrH编码），二者分别受CTP和UTP的反馈抑制。PyrH D93A与PyrG D160E, E162A, E168K cgl已被证明可显著降低UTP和CTP的反馈抑制。此外，核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG将CTP降解为CMP，从而降低胞内过量CTP，为胞苷合成提供直接前体CMP，同时缓解反馈抑制。基于此，我们以cyt 6为亲本菌株，加入不同的酶元件组合，包括来自大肠杆菌的野生型pyrH、来自大肠杆菌的pyrH D93A突变体、来自谷氨酸棒杆菌的pyrG变体、来自谷氨酸棒杆菌的pyrG D160E, E162A, E168K cgl多位点突变体，以及来自大肠杆菌的nudG，构建工程菌株cyt 9-1至cyt 9-4（图3B）。摇瓶发酵结果（图3C）显示，菌株cyt 6至cyt 9-4的胞苷滴度分别为0.73 g/L、1.44 g/L、1.94 g/L、1.87 g/L和2.36 g/L，相应尿苷滴度分别为0.92 g/L、2.35 g/L、2.14 g/L、1.58 g/L和1.32 g/L。pyrH D93A、pyrG D160E, E162A, E168K cgl与nudG的组合效果最佳，胞苷滴度较cyt 6提高223.28%，同时尿苷副产物水平低于其他组合。这些结果表明，该基因组合提高了胞苷合成途径的代谢通量，促进了胞嘧啶核苷酸的积累。
【数据】菌株：cyt 6、cyt 9-1至cyt 9-4；胞苷滴度：0.73、1.44、1.94、1.87、2.36 g/L；尿苷滴度：0.92、2.35、2.14、1.58、1.32 g/L；最佳组合：pyrH D93A + pyrG D160E/E162A/E168K cgl + nudG；胞苷较cyt 6提高：223.28%
#### 3.2.2 引入偏好CMP的5′-核苷酸酶增强CMP至胞苷转化
在胞苷与尿苷的竞争中，尿苷通常更易积累。因此，由于UMP至CMP需多步反应且受严格反馈调控，细胞内较易积累一定量UMP，过量UMP随后被内源5'-核苷酸酶进一步利用。此外，大肠杆菌内源5'-核苷酸酶底物特异性低，对CMP和UMP均表现出催化活性且催化效率相近。底物特异性低的内源5'-核苷酸酶会导致UMP分流为尿苷，代谢通量因而无法导向胞苷。因此，选择对CMP高亲和力的5'-核苷酸酶以提高胞苷合成效率、减少尿苷副产物积累。来自酿酒酵母的磷酸代谢蛋白8（一种5'-核苷酸酶，由PHM8 sce编码）据报道对CMP具有显著更高的底物亲和力，因而被认为适合用于提高胞苷合成。我们将密码子优化的PHM8 sce引入cyt 9-4染色体ychG位点，由强trc启动子控制，构建cyt 10。摇瓶发酵结果（图3D）显示，cyt 10的胞苷滴度较cyt 9-4提高51.07%，从2.33 g/L升至3.52 g/L，而尿苷产量仅提高21.21%，从1.32 g/L升至1.60 g/L。这些结果表明，PHM8 sce的异源表达在体内优先促进CMP向胞苷转化而非UMP向尿苷转化，与其报道的CMP偏好性一致，有效促进了胞苷积累。
【数据】菌株：cyt 10；插入位点：ychG；启动子：trc；胞苷滴度：2.33→3.52 g/L（提高51.07%）；尿苷：1.32→1.60 g/L（提高21.21%）
#### 3.2.3 支架介导的酶簇增强通量通道化
尽管前一阶段的多层次代谢工程改造显著提高了胞苷产量，发酵液中尿苷积累仍处于1.60 g/L的较高水平；因此，部分代谢通量仍被分流至竞争性副产物途径。这可能是因为胞苷与尿苷的生成均依赖5'-核苷酸酶介导的去磷酸化反应。UMP和CMP等核苷酸中间体在细胞质中不受空间限制，呈弥散分布。由于UMP位于胞苷合成网络的上游代谢节点，在扩散过程中更易被5'-核苷酸酶捕获并转化为尿苷；因此，本应导向胞苷合成的代谢通量被分散和损失。为进一步改善代谢分配、减少尿苷及其他副产物，我们采用蛋白支架通道化工程促进关键酶的组装，以期减少中间体扩散损失，将代谢通量导向目标产物。基于这些发现，使用CipA/CipB支架蛋白的新型通道结构可增强多酶协同并减少副产物。例如，CipA自组装支架系统已成功用于大肠杆菌，通过实现细胞色素P450与其同源还原酶的紧密空间排列促进电子传递。此外，CipA和CipB支架蛋白均可在大肠杆菌中以可溶状态表达而无需（原文此处节选中断）。
【数据】尿苷积累：1.60 g/L；支架蛋白：CipA/CipB；原文未详述支架通道化后的具体滴度数据（节选中断）
3.3 重连从头嘧啶核苷酸生物合成途径
（原文结果节选未包含3.3–3.5的正文内容，仅提供图注信息）
图4显示，前体供给工程策略用于重建从头嘧啶核苷酸生物合成途径（图4A），并展示了argF敲除及引入相关元件对菌株性能的影响（图4B）。
【数据】原文未详述
3.4 动态强化呼吸链重塑能量与氧化还原辅因子代谢
（原文结果节选未包含3.4的正文内容，仅提供图注信息）
图5显示，添加不同浓度ATP二钠盐对胞内ATP水平的影响（图5A），以及添加ATP二钠盐对菌株性能的影响（图5B）。
【数据】原文未详述
3.5 补料分批发酵验证菌株生产性能
（原文结果节选未包含3.5的正文内容，仅提供图注信息）
图6展示了5 L生物反应器装置示意图（图6A），以及菌株cyt 23在5 L生物反应器中的常规补料分批发酵（图6B）。
【数据】菌株：cyt 23；生物反应器：5 L；原文未详述
图1展示了大肠杆菌中胞苷生物合成的代谢途径及本研究用于提高胞苷产量的代谢工程策略。橙色箭头表示过表达的原生基因，绿色箭头表示过表达的异源基因，带双斜杠的红色箭头表示（图注中断）。
【数据】原文未详述
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过协调途径选择性、前体供给、副产物控制与能量-氧化还原代谢，建立了无质粒大肠杆菌高产胞苷平台。无质粒底盘具有更高的遗传稳定性，无需抗生素选择，并降低了质粒维持带来的代谢负担，为大规模发酵提供了更稳健、更具工业相关性的平台。胞苷积累首先通过阻断胞苷降解、补救及竞争性CMP消耗实现；随后通过解除反馈抑制、增强CMP生成及引入偏好CMP的磷酸酶强化UMP至胞苷通量。CipA/CipB介导的支架组装在空间上组织关键酶，大幅降低尿苷积累，表明局部途径通道化是改善嘧啶核苷生物合成中碳分配的有效策略。重建从头UMP合成、增强PRPP供给、强化谷氨酰胺/草酰乙酸/天冬氨酸生成进一步扩大了前体池。此外，基于ydaO基序动态调控呼吸链与氧利用模块，改善了ATP生成、NAD+再生与细胞生长之间的平衡。最终菌株cyt 23在摇瓶中达到19.06 g/L胞苷，在5 L补料分批生物反应器中50 h达到96.20 g/L（原文讨论节选至此中断）。
编译者解读：该工作的方法学价值在于将"降解阻断—反馈解除—支架通道化—前体扩容—能量动态调控"整合为一条可复制的无质粒路线，其中CipA/CipB支架使尿苷降低98.70%是通量重分配的关键节点。局限方面，支架蛋白的胞内表达负担与长期传代稳定性、以及ydaO动态调控在工业规模下的响应灵敏度，仍需在更大体量发酵中检验。整体而言，该策略对嘌呤/嘧啶类核苷细胞工厂具有直接迁移价值。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.09.003
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.09.003