谷氨酸棒杆菌系统代谢工程实现克级磷酸吡哆醛生产

📅 2026-09-24 📰 Biochemical Engineering Journal 2026-09-22 📂 研究进展 👁 38

来源：Systematic metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for gram-scale pyridoxal 5′-phosphate production（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

磷酸吡哆醛（PLP）是维生素B6的主要活性辅酶形式，参与转氨、脱羧、消旋等大量酶催化反应。本研究以谷氨酸棒杆菌为底盘，对DXP依赖型PLP合成途径进行系统性代谢工程改造。从已有菌株CG-PLP0出发，依次引入EcZwf/EcDxs、反义模块、多因素模块化优化、染色体rpe/taldo1敲除、基于4HTP节点的途径模块化与启动子架构替换，最终添加EcPdxK获得CG-PLP7，摇瓶产量达595.8mg/L，较出发菌株提高8.6倍。5L生物反应器三批次独立发酵96h平均产量为2.0 ± 0.2g/L，实现了克级PLP生产。

研究背景

PLP是维生素B6的主要活性辅酶形式，参与转氨基、脱羧、消旋、裂解反应、一碳代谢以及含氮化合物转化等广泛的酶催化反应。由于PLP依赖型酶广泛参与氨基酸代谢和细胞核心过程，PLP及维生素B6相关化合物在食品、医药、营养强化和生物催化领域应用广泛。维生素类化合物可持续生产需求的增长，推动了微生物细胞工厂合成PLP的研究兴趣。传统维生素B6类化合物的生产主要依赖化学合成或多步转化工艺，这些路线虽然技术成熟，但通常涉及多步反应、较苛刻的反应条件和复杂的副产物控制。相比之下，微生物发酵可利用可再生碳源、在温和条件下运行，提供了更绿色、更灵活的生产路径。已有多種微生物宿主被用于维生素和辅因子合成研究，谷氨酸棒杆菌因其安全应用历史、成熟的工业发酵背景、稳健的生理特性以及对中心碳代谢的适应性而尤为引人关注。

研究方法

2.1 菌株、质粒与试剂

本研究所用宿主菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。以先前建立的DXP依赖型PLP生产菌株CG-PLP0为起始菌株，逐步构建CG-PLP1至CG-PLP7。主要表达骨架为pXMJ19-CmR和pEC-XK99E-KanR，分别赋予氯霉素和卡那霉素抗性。根据构建体的不同，使用Ptac、Ptrc或PH36驱动相应的表达模块。详细的质粒架构、启动子分配、RBS序列和基因来源信息见支持信息（表S1–S3）。用于PLP途径构建的关键基因包括EcEpd、EcPdxB、EcPdxA、SmPdxJ、EcPdxH、EcZwf、EcDxs和EcPdxK。anti-Cg-pdxS-ASm模块作为靶向Cg-pdxS相关内源途径的反义干预手段引入。在CG-PLP4中完全敲除了染色体基因rpe和taldo1。PLP标准品、HPLC级甲醇及其他分析试剂均为色谱级或分析级。基因来源和登录号信息见支持信息。

【数据】菌株：谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；质粒：pXMJ19-CmR、pEC-XK99E-KanR；启动子：Ptac、Ptrc、PH36；抗性：氯霉素、卡那霉素；敲除基因：rpe、taldo1；反义模块：anti-Cg-pdxS-ASm（300bp）；其余参数：原文未详述

2.2 培养基组成

一级种子培养使用LBHis培养基，含5g/L胰蛋白胨、2.5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、18.5g/L脑心浸液和91g/L山梨醇。当OD600达到约6时转接一级种子，通常在12–14h后。二级种子培养使用LBG培养基，含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl和20g/L葡萄糖。当OD600达到约10时转接二级种子，通常在12–14h后。发酵培养基含60g/L葡萄糖、5g/L尿素、8g/L玉米浆粉、0.0004g/L生物素、0.0004g/L维生素B1、1g/L K2HPO4、1g/L KH2PO4、0.0294g/L CaCl2·2H2O、1.2325g/L MgSO4·7H2O和5mL/L微量元素母液。微量元素母液含FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NiCl2·6H2O和HCl，母液浓度分别为10g/L、10g/L、1g/L、2g/L、0.02g/L和1mL/L HCl。根据载体的抗性标记添加抗生素。卡那霉素和氯霉素的终浓度分别为50mg/L和5mg/L。

【数据】一级种子培养基：LBHis（5g/L胰蛋白胨、2.5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、18.5g/L脑心浸液、91g/L山梨醇）；二级种子培养基：LBG（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、20g/L葡萄糖）；发酵培养基：60g/L葡萄糖、5g/L尿素、8g/L玉米浆粉、0.0004g/L生物素、0.0004g/L维生素B1、1g/L K2HPO4、1g/L KH2PO4、0.0294g/L CaCl2·2H2O、1.2325g/L MgSO4·7H2O、5mL/L微量元素母液；卡那霉素：50mg/L；氯霉素：5mg/L；转接OD600：一级约6、二级约10；培养时间：12–14h

2.3 DXP依赖型PLP生产菌株的构建

CG-PLP0是先前建立的DXP依赖型PLP生产菌株，携带Ptrc-EcEpd-EcPdxB-EcPdxA-SmPdxJ-EcPdxH。将EcDxs和EcZwf添加到CG-PLP0的pEC构建体中以生成CG-PLP1。随后将300bp的anti-Cg-pdxS-ASm序列引入CG-PLP1构建体中以生成CG-PLP2。该模块被设计为对Cg-pdxS相关内源途径的反义干预；本研究中未直接测量CgPdxS转录本或蛋白质丰度来量化衰减程度。以CG-PLP2为亲本菌株进行多因素模块化优化。选定的CG-PLP3构型包含pXMJ19/Ptac-EcEpd-EcPdxB-EcPdxA和pEC-XK99E/Ptrc-SmPdxJ-EcPdxH-EcZwf-Ptrc-EcDxs-ASm。最终构型从探索性酶源、RBS、基因顺序和启动子构型筛选实验中选出（表S6）。在CG-PLP3中完全敲除染色体基因rpe和taldo1以生成CG-PLP4。随后围绕4HTP节点重新组织途径组件以生成CG-PLP5。在CG-PLP5中，pXMJ19携带Ptac-EcEpd-EcPdxB-EcZwf-ASm，而pEC-XK99E含有Ptrc-EcPdxA-SmPdxJ-EcPdxH和第二个Ptrc-EcDxs表达单元。CG-PLP6保留了CG-PLP5的编码基因分布，但使用PH36替代pXMJ的Ptac启动子和两个pEC的Ptrc单元。CG-PLP7保留了CG-PLP6的pEC架构，通过在pXMJ19模块中EcZwf下游添加EcPdxK生成。因此，CG-PLP6到CG-PLP7的主要构建体变化是将EcPdxK添加到保留的含PdxH双质粒架构中。

【数据】菌株：CG-PLP0至CG-PLP7；CG-PLP0基因型：Ptrc-EcEpd-EcPdxB-EcPdxA-SmPdxJ-EcPdxH；CG-PLP1新增：EcDxs、EcZwf；CG-PLP2新增：300bp anti-Cg-pdxS-ASm；CG-PLP3构型：pXMJ19/Ptac-EcEpd-EcPdxB-EcPdxA + pEC-XK99E/Ptrc-SmPdxJ-EcPdxH-EcZwf-Ptrc-EcDxs-ASm；CG-PLP4敲除：rpe、taldo1；CG-PLP5：pXMJ19-Ptac-EcEpd-EcPdxB-EcZwf-ASm + pEC-XK99E-Ptrc-EcPdxA-SmPdxJ-EcPdxH + Ptrc-EcDxs；CG-PLP6启动子替换：PH36替代Ptac和Ptrc；CG-PLP7新增：EcPdxK（pXMJ19模块中EcZwf下游）

2.4 多因素模块化优化

以CG-PLP2为亲本菌株进行多因素模块化优化。优化包括酶源筛选、RBS调谐、启动子构型筛选和基因排列优化。通过摇瓶发酵比较候选构建体，以鉴定与更高PLP产量相关的构型。最终CG-PLP3架构从这些探索性筛选中选出。详细的候选酶源、RBS序列、启动子构型、基因排列和生物学重复数据见表S6。在历史启动子构型筛选中，V1和V2表示两个表达模块。对于每个模块，P1–P4表示四种启动子放置/构型排列，而非四种启动子身份或测量强度类别。V1Px × V2Py的表示法指从每个模块中选择一种构型；历史最佳筛选组合为V1P1 × V2P3。这些数据用于探索性构建体选择。最终CG-PLP3基因型是根据验证的最终构建体记录独立定义的，并非简单组合所有单独最高筛选条件而重建。

【数据】亲本菌株：CG-PLP2；优化维度：酶源、RBS、启动子构型、基因排列；模块标记：V1、V2；启动子构型：P1–P4；历史最佳组合：V1P1 × V2P3；摇瓶发酵筛选；其余参数：原文未详述

2.5 摇瓶发酵

将工程菌株活化后接种到一级种子培养基中。培养至OD600≈6后，将培养物转接到二级种子培养基中，生长至OD600≈10后接种到发酵培养基中。种子培养在含20mL LBG培养基的100mL摇瓶中进行。发酵在50mL体系中进行，种子接种量为2%（v/v）。采用摇瓶发酵评估CG-PLP0至CG-PLP7的PLP产量。培养物在30°C、200rpm下孵育。当OD600达到2.5时添加IPTG。对于50mL发酵体系，添加184μL 50mg/mL IPTG母液，最终IPTG浓度约为0.184mg/mL。在指定时间点收集样品以测定PLP效价、OD600和残留葡萄糖。所有摇瓶发酵实验均至少进行三次独立生物学重复，结果以平均值 ± 标准差表示。

【数据】种子培养基体积：20mL LBG/100mL摇瓶；发酵体系：50mL；接种量：2%（v/v）；温度：30°C；转速：200rpm；诱导条件：OD600=2.5时添加IPTG；IPTG用量：184μL（50mg/mL母液），终浓度约0.184mg/mL；生物学重复：≥3次；结果表示：mean ± SD

2.6 5L生物反应器发酵

为评估CG-PLP7的放大性能，在5L生物反应器中使用相同发酵工艺进行了三次独立发酵。初始工作体积为2.5L，初始葡萄糖浓度为60g/L。发酵培养基按2.2节所述制备。温度维持在30°C，pH使用6.5%硫酸和25%氨水控制在7.0。采用分段通气与搅拌策略。在早期生长阶段，通气速率维持在0.8–1.0 vvm，搅拌速度300rpm。在生产阶段，通气速率调整为0.6 vvm，搅拌速度提高至500rpm。通过调节通气和搅拌调控溶解氧。从36h至72h以20mL/h的恒定速率补加800g/L葡萄糖溶液，累计补料体积约720mL。最终培养体积估计约为3.5L，但未直接测量。当OD600达到约20–24时，添加8mL 50mg/mL IPTG母液进行诱导。定期收集样品以监测细胞生长（OD600）、残留葡萄糖浓度、PLP产量和溶解氧。发酵持续96h，三次独立运行的最终PLP浓度通过HPLC定量。代表性Run 1曲线显示溶解氧在约32至76h期间接近0%；因此该区间被描述为限氧培养而非完全受控的好氧培养。

【数据】反应器规模：5L；初始工作体积：2.5L；初始葡萄糖：60g/L；温度：30°C；pH：7.0（6.5%硫酸、25%氨水调控）；早期通气：0.8–1.0 vvm，搅拌300rpm；生产期通气：0.6 vvm，搅拌500rpm；补料：800g/L葡萄糖，36–72h，20mL/h，累计约720mL；最终体积：约3.5L（未直接测量）；诱导：OD600约20–24时添加8mL 50mg/mL IPTG；发酵时间：96h；溶解氧：约32–76h接近0%；独立运行：3次

2.7 PLP定量

用于最终PLP效价测定的方法为……

【数据】原文未详述

研究结果

3.1 逐步工程策略与基于HPLC的菌株比较

DXP依赖型PLP途径需要多种碳前体和一系列协调的酶促反应（图1A）。因此，我们评估了一系列工程干预措施，涵盖前体相关基因、反义模块、组合表达优化、染色体缺失、途径模块化、启动子架构替换以及EcPdxK的添加。这些干预被视为工程假设；除非特别说明，未直接量化细胞内通量、代谢物池、转录本丰度或酶活性的变化。对最终菌株系列的HPLC定量给出了CG-PLP0至CG-PLP7的PLP效价（表2和表S5）。从CG-PLP0到CG-PLP7的总体增幅为8.6倍。逐步趋势支持对工程模块的持续评估，尽管各工程步骤的效果大小不同，不应被解释为所提出代谢机制的直接证据。菌株构建路线图和代表性遗传架构总结于图1。详细的启动子、RBS、基因顺序和质粒信息见表S1–S3。

▲ PLP biosynthetic pathways and major metabolic engineering targets in Corynebacterium glutamicum. (A) Schematic comparison of the DXP-dependent and DXP-independent PLP biosynthetic pathways. In the DXP-dependent pathway, erythrose 4-phosphate (E4P)-derived intermediates and 1-deoxy-D-xylulose 5-phosp

【数据】菌株系列：CG-PLP0至CG-PLP7；总增幅：8.6倍；定量方法：HPLC；其余参数：原文未详述

3.2 EcDxs/EcZwf添加与anti-Cg-pdxS-ASm干预

基于EcDxs和EcZwf在DXP形成和PPP相关代谢中的预期作用，将其引入CG-PLP0。CG-PLP1产生147.0 ± 14.3mg/L PLP，而CG-PLP0为69.5 ± 4.9mg/L（图2D和表S5），平均效价增加111.4%。该结果表明EcDxs/EcZwf干预与PLP产量的大幅增加相关；然而，未直接测量细胞内DXP、E4P、NADPH或代谢通量。随后添加300bp的anti-Cg-pdxS-ASm模块以生成CG-PLP2。该构建体被设计为对内源Cg-pdxS相关途径的反义干预（图2B和2C）。由于未直接测量CgPdxS转录本、蛋白质丰度和途径通量，目前的数据确立了构建体水平的干预及其生产表型，而非分子衰减的程度。CG-PLP2产生216.8 ± 18.4mg/L PLP，较CG-PLP1数值增加47.5%，相对CG-PLP0效价为3.1倍（图2D和表S5）。CG-PLP1到CG-PLP2的比较在相邻Tukey比较中未达到显著性，因此反义干预的效果被保守地解释为正向生产趋势，而非竞争通量减少的直接证据。

▲ EcDxs/EcZwf addition and anti-Cg-pdxS-ASm intervention for improving PLP production. (A) Engineering rationale for introducing EcDxs and EcZwf to reinforce DXP precursor formation and PPP-associated precursor/cofactor supply, respectively. (B) Schematic relationship between the endogenous CgPdxS-rel

【数据】CG-PLP0：69.5 ± 4.9mg/L；CG-PLP1：147.0 ± 14.3mg/L（较CG-PLP0增加111.4%）；CG-PLP2：216.8 ± 18.4mg/L（较CG-PLP1增加47.5%，为CG-PLP0的3.1倍）；反义模块：300bp；统计：CG-PLP1至CG-PLP2未达显著性

3.3 多因素模块化优化与染色体Δrpe Δtaldo1缺失

从CG-PLP2出发，探索性优化比较了酶源、RBS变体、基因排列和启动子构型（图3A和表S6）。这些筛选实验用于鉴定更高性能的整合构型，而非建立每个因素的独立机制贡献。所选构型CG-PLP3产生314.1 ± 27.4mg/L PLP，较CG-PLP2增加44.8%（图3C和表S5）。相应的筛选数据显示，替代的酶/RBS/组织选择产生了不同的PLP输出，支持组合途径优化的实用价值。随后完全敲除基因rpe和taldo1以生成CG-PLP4。CG-PLP4产生426.9 ± 14.8mg/L PLP，较CG-PLP3高35.9%（图3C和表S5）。该增加表明rpe/taldo1缺失是该菌株背景中有用的工程干预。由于未测量E4P、GAP、DXP、相关代谢物和13C通量，观察到的产量增加不应被解释为碳通量重分布的直接实验证明。

▲ Multifactorial modular optimization and chromosomal rpe/taldo1 deletion for enhanced PLP production. (A) Exploratory multifactorial optimization of CG-PLP2, including RBS tuning, promoter-configuration optimization, enzyme-source screening, and gene-arrangement optimization, was used to identify the

【数据】CG-PLP3：314.1 ± 27.4mg/L（较CG-PLP2增加44.8%）；CG-PLP4：426.9 ± 14.8mg/L（较CG-PLP3增加35.9%）；敲除基因：rpe、taldo1；其余参数：原文未详述

3.4 基于4HTP节点的途径模块化与启动子架构替换

围绕4HTP节点重新分配途径组件以生成CG-PLP5。pXMJ19模块含有Ptac-ecepd-ecpdxb-eczwf-ASm，而pEC-XK99E含有Ptrc-ecpdxa-smpdxj-ecpdxh和第二个Ptrc-ecdxs单元（表S2和S3）。CG-PLP5产生458.3 ± 39.3mg/L PLP，较CG-PLP4数值增加7.3%。该单步未显示统计学显著改善，因此被解释为结构性途径重组步骤，而非细胞内4HTP形成或消耗经实验验证变化的证据。CG-PLP6保留了相同的编码基因分布，但将pXMJ的Ptac启动子和两个pEC的Ptrc启动子替换为PH36。CG-PLP6产生514.4 ± 35.9mg/L PLP，较CG-PLP5数值增加12.3%；该单独比较也未达到统计学显著性。总体而言，CG-PLP4到CG-PLP6序列产生了20.5%更高的平均效价，支持继续使用重组/启动子替换架构，同时避免关于细胞内4HTP水平或通量协调的机制性声明。

▲ 4HTP-node-based pathway modularization and promoter-architecture replacement. (A) The DXP-dependent PLP biosynthetic pathway was conceptually divided into upstream and downstream modules using 4HTP as a design boundary for pathway modularization. Intracellular 4HTP concentrations were not directly m

【数据】CG-PLP5：458.3 ± 39.3mg/L（较CG-PLP4增加7.3%，未达显著性）；CG-PLP6：514.4 ± 35.9mg/L（较CG-PLP5增加12.3%，未达显著性）；CG-PLP4至CG-PLP6总增幅：20.5%；启动子替换：PH36替代Ptac和Ptrc；其余参数：原文未详述

3.5 在保留的含PdxH架构中添加EcPdxK

PdxK和PdxH参与维生素B6 vitamer互变，为测试在前述途径修饰后添加EcPdxK是否能进一步影响PLP产量提供了依据。CG-PLP6已在pEC模块上保留了EcPdxH；CG-PLP7通过在pXMJ19模块中EcZwf下游添加EcPdxK而生成，同时保留CG-PLP6的pEC架构（表S2和S3）。CG-PLP7产生595.8 ± 38.9mg/L PLP，较CG-PLP6高15.8%，较CG-PLP0高8.6倍（图5和表S5）。该增加支持将EcPdxK添加作为保留含PdxH背景中有用的后期工程干预。本研究未定量PNP、PMP、其他维生素B6 vitamer、EcPdxK/EcPdxH表达水平或酶活性。因此，数据未直接建立EcPdxK相对于保留的含EcPdxH架构表达状态的明确相对添加，也未证明细胞内vitamer池的重分布。这些机制性可能性在讨论中作为未来验证的假设予以考虑。

▲ Addition of EcPdxK to the retained EcPdxH-containing dual-plasmid architecture further improved PLP production. (A) Biochemical context of EcPdxK and EcPdxH in vitamin B6 interconversion. EcPdxK catalyzes phosphorylation of pyridoxal (PL), pyridoxine (PN), and pyridoxamine (PM) to PLP, PNP, and PMP,

【数据】CG-PLP7：595.8 ± 38.9mg/L（较CG-PLP6增加15.8%，较CG-PLP0增加8.6倍）；添加基因：EcPdxK（pXMJ19模块中EcZwf下游）；保留：EcPdxH（pEC模块）；未测量：PNP、PMP、其他vitamer、酶活

3.6 生物反应器验证

在5L生物反应器中评估CG-PLP7，以在受控培养条件下评估生产性能（图6A）。在表S7报告的代表性时程运行中，PLP在发酵过程中总体增加，96h达到2.1g/L，同时残留葡萄糖降至约0.1g/L。观察到PLP效价的轻微后期波动，因此该曲线被描述为总体增加而非持续累积。在三次独立5L运行中，96h的最终PLP效价分别为2.1、2.0和1.8g/L，平均为2.0 ± 0.2g/L（n = 3）。相应的平均生产率为20.6 ± 1.7mg/L/h。这些独立运行证明了CG-PLP7在测试的生物反应器工艺下可重复地实现克每升级PLP生产。代表性时程还指出了工艺优化的机会。96h时残留葡萄糖接近耗尽以及后期溶解氧的变化表明，补料策略、氧传递、诱导时机和培养时长值得进一步评估。这些工艺观察与基因工程机制分开解释。

▲ 5L bioreactor fermentation of CG-PLP7. (A) Schematic representation of the fed-batch fermentation process for CG-PLP7. Fermentation was initiated at a working volume of 2.5L with an initial glucose concentration of 60g/L and was conducted at 30 °C and pH 7.0. An 800g/L glucose solution was fed from

【数据】反应器：5L；96h PLP效价（三次独立运行）：2.1、2.0、1.8g/L；平均效价：2.0 ± 0.2g/L（n=3）；平均生产率：20.6 ± 1.7mg/L/h；代表性运行96h PLP：2.1g/L；残留葡萄糖：约0.1g/L；发酵时间：96h

讨论与解读

本研究的主要进展不在于首次建立DXP依赖型PLP途径——这已在先前CG-PLP0的工作中实现——而在于对该底盘进行的后续多层次重新设计。本研究结合了前体相关基因添加、反义干预、酶源/RBS/基因组织的探索性组合优化、染色体rpe/taldo1缺失、两个质粒间途径组件的重新分配、启动子架构替换、EcPdxK添加以及独立的5L验证。这一进展将早期的途径构建研究从PLP生物合成的概念验证推向了菌株架构的系统优化。HPLC定量的菌株系列显示从CG-PLP0的69.5 ± 4.9mg/L到CG-PLP7的595.8 ± 38.9mg/L的明显总体增加。然而，各步骤的幅度和统计强度并不一致。特别是CG-PLP5和CG-PLP6相对于其直接亲本显示数值上但单独不显著的增加。这种模式反对将每个设计步骤视为独立验证的代谢机制；相反，数据支持一种累积工程策略，其中若干结构变化共同贡献于最终生产表型。Δrpe Δtaldo1干预产生了较大的逐步增加之一，但本实验未包括E4P、GAP、DXP、4HTP或13C代谢的靶向测量。

编译者解读

该研究展示了一条清晰的逐步代谢工程路线：从途径前体强化、竞争支路抑制到途径模块化和辅因子互变基因补充，最终在5L反应器实现2.0g/L的PLP产量。方法学上，作者对每个工程步骤的统计显著性保持审慎，明确区分了工程假设与机制验证，这种严谨态度值得借鉴。局限在于多数步骤缺乏细胞内代谢物和通量的直接证据，反义模块的衰减效果未经转录/蛋白水平验证，后期步骤的增益未达统计显著。未来可通过13C通量分析和代谢物组学解析限速节点，并结合补料-溶氧联动控制进一步优化工艺。

参考来源

期刊：Biochemical Engineering Journal, 2026

DOI: 10.1016/j.bej.2026.110413

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